CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Chương 5:
CÁC PHƯƠNG PHÁP
KIỂM NGHIỆM VI SINH
THỰC PHẨM


Chuẩn bị mẫu
• Thu mẫu ngẫu nhiên, tại nhiều vị trí để có tính
đại diện
• Mẫu chứa trong bình nhựa hay bao nilon
• Bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển
• Bảo quản -200C cho đến khi phân tích hoặc 040C trong vòng 36h
• Giải đông ở 2-50C trong 18h hoặc 450C trong
15 phút
• Đồng nhất mẫu trước khi phân tích


• Phương pháp MPN (most probable
number): phương pháp định lượng theo số
lượng VSV có xác xuất cao nhất dựa vào kết
quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp
lại ở một số độ pha loãng khác nhau


Các loại môi trường nuôi cấy VSV
•
-

Về bản chất của thành phần môi trường:
Môi trường tự nhiên
Môi trường tổng hợp

Môi trường bán tổng hợp
Mt tổng hợp hoặc bán tổng hợp dưới dạng
đông khô thương phẩm của các hãng MERCK,
OXOID,DIFCO, BBL, HIGH-MEDIA


•
-

Về tính chất vật lý:
Môi trường lỏng
Môi trường rắn
Môi trường bán rắn (xốp)

•
-

Về công dụng:
Môi trường tiền tăng sinh
Môi trường tăng sinh
Môi trường chọn lọc
Môi trường thử nghiệm sinh hóa


QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ
TIÊU VI SINH VẬT


1. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
• Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh

giá chất lượng của mẫu về VSV, nguy cơ hư
hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm.
• Xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
• Biểu diễn bằng đơn vị CFU/g hay CFU/ml


Mẫu
Dung dịch nước muối pepton
Lắc đều, ít nhất 2 phút
Đồng nhất mẫu
Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân
Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml
mẫu vào các đĩa petri vô trùng ( mỗi nồng độ 2 đĩa)
Cấy mẫu bằng pp hộp đổvới 10-15ml
mt Plate Count Agar
Ủ 300C, 72h
Đếm khuẩn lạc

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ


Cách tính kết quả
• Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250
• Mật độ VK trong 1g hay 1ml mẫu:

A=

N
n1Vf1 + …+ niVfi

A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu
N: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ I
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng


• Mt nước muối pepton (SPW)
- 8,5g NaCl
- 1g pepton
- Nước cất cho đủ 100ml


2. COLIFORMS VÀ E.COLI
• Coliforms là nhóm VK Gram âm, hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, lên men
lactose sinh hơi trong 24- 48h ở 350C
• Nhóm Coliforms bao gồm 4 giống là
Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae và Citrobacter


• Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên
men sinh hơi khi ủ 440C trong mt EC (E.coli medium)
• Coliforms phân là những coliform chịu nhiệt có khả năng
sinh Indol trong mt trypton
• E.coli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC
(++--)
• Nhóm Coliform sinh hơi khi nuôi trong mt canh thang
lactose mật bò BGBL (Brilliant Green Bile Broth Lactose)

và LSB ( Lauryl Sulphate Broth)
• Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, MPN (Most
Probable Number)


• Thử nghiệm Indol:
- Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường canh thang
tryptophan, để ở 35° - 37°C trong 18 – 24h.
- Nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac vào trong ống nghiệm.
Quan sát kết quả. Phản ứng (+) sẽ xuất hiện vòng màu đỏ
phía trên dung dịch nuôi cấy
• Cơ sở khoa học:
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy
phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và
NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p –
dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac
hình thành nên phức hợp màu đỏ.


• Thử nghiệm MR (Methyl-Red)
- Kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo
ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật

- Thực hiện: Nuôi VSV trên canh thang (broth)
MR-VP, thêm 5 giọt dung dịch đỏ methyl 0,2%
(chỉ thị pH), phản ứng (+) khi mt có màu đỏ


• Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer):
- Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol

(acetoin) trong quá trình lên men glucose của
một số vi sinh vật.

- Thực hiện: nuôi VSV trên MR-VP Broth, nhỏ
6 giọt dung dịch a-napthol 5%, 2 giọt KOH
40%. Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiện
sau 15-20 phút


• Thử nghiệm citrate:
- Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy
nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật.
- Môi trường (Simmons citrate) có chứa muối ammonium vô
cơ. Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn
Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium
làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm.
Trong mt có Bromthymol blue – chất chỉ thị pH, chuyển từ
xanh lục sang xanh dương khi mt kiềm.
- Thực hiện: nuôi VSV trên mt Simmons citrate, ủ 24h, phản
ứng (+) khi mt chuyển từ màu xanh lục sang xanh dương.


Qui trình định lượng Coliforms, coliforms chịu nhiệt,
coliforms phân và E.coli bằng pp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu
để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml
canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL

Cấy vào ống canh EC

ủ 37 + 10C, 48h

ủ 44,5 + 0,20C, 24h

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Coliforms

Coliforms chịu nhiệt


Cấy lên thạch EMB, ủ

Chọn khuẩn lạc điển hình
(tròn, dẹt hình đĩa, có ánh kim
tím), cấy vào canh Trypton,
ủ 44,5 + 0,20C, 24h

Thử nghiệm Indol

Đếm số ống canh EC(+) và
Indol (+), tra bảng MPN

Coliforms phân

370C,

24h

Eosin Methylene Blue Agar: phân biệt có
lên men lactose hay không? Sinh acid phản
ứng thuốc nhuộm tạo màu ánh kim tím

Chọn khuẩn lạc điển hình (tròn, dẹt
hình đĩa, có ánh kim tím), cấy vào
canh Trypton, MR- VP, SC Citrate ủ
44,5 + 0,20C, 24h

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC(+) và
IMViC (++--), tra bảng MPN

E.coli




•
-

Mt LSB
Trypton: 20g
Lactose: 5g

KH2PO4: 2,75g
K2HPO4: 2,75g
NaCl:5g
Sodium lauryl sulfate:0,1g
Nước cất: 1 lít
pH cuối 6,8 + 0,2. Phân phối vào các ống nghiệm
có ống Durham


•
-

Mt BGBL
Peptone: 10g
Lactose: 10g
Mật bò: 20g
Brilliant green: 0,0133g
Nước cất: 1 lít
Hòa tan từng loại rồi trộn chung.
pH cuối 7,2 + 0,2. Phân phối vào các nghiệm chứa
ống Durham.


•
-

Mt EC
Trypton: 20g
Muối mật: 1,5g
Lactose: 5g

KH2PO4: 1,5g
K2HPO4:4g
NaCl: 5g
Nước cất: 1 lít
pH cuối 6,9 + 0,2. Rót vào các ống nghiệm có chứa
ống Durham.


• Mt canh Trypton
- Trypton :10g
- Nước cất: 1 lít
pH 6,9 + 0,2


Qui trình định lượng Coliforms, coliforms phân và E.coli
bằng pp đếm khuẩn lạc
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu
để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đỉa petri bổ sung
5ml mt TSA, lắc đều, để yên 1-2h

Tryptone casein soy agar

Rót 10-15ml mt thạch VRB, để đông ủ 370C, 24- 48h

Violet Red Bile

Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa
muối mật, dk > 0,5mm, chọn 5 khuẩn lạc

Cấy vào ống canh BGBL

Cấy vào ống canh EC

ủ 370C, 24- 48h

ủ 440C, 24-48h

Đếm số ống canh (+) (sinh hơi),
tính mật độ Coliforms

Chọn ống canh (+)( sinh hơi)