Aspergilus oryzae sinh enzyme lactase

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................ii
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................iii
MỤC LỤC............................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG............................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ..............................................................................iii
PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU...........................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1
1.2. Mục tiêu chung...............................................................................................2
1.3. Mục tiêu cụ thể...............................................................................................2
PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................3
2.1. Tổng quan về enzyme lactase.........................................................................3
2.1.1. Enzyme lactase............................................................................................3
2.1.2. Phương pháp thu nhận enzyme...................................................................6
2.2. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus oryzae....................................................7
2.2.1. Các đặc điểm chung của Aspergillus oryzae...............................................7
2.2.2. Ứng dụng của A. oryzae............................................................................11
2.2.3. Khả năng sinh enzyme lactase của chủng A.oryzae và những yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng đó.......................................................................................13
2.2.4. Đặc điểm của enzyme sinh ra bởi A.oryzae..............................................13
PHẦN THỨ BA – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU....................................................................................................................14
3.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................14
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................14
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu..................................15
3.1.3. Môi trường nghiên cứu..............................................................................15
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................15
3.3. Nội dung nghiên cứu....................................................................................15
3.4. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................16
3

3.4.1. Phương pháp phân lập...............................................................................16
3.4.2. Phương pháp tuyển chọn...........................................................................16
3.4.3. Phương pháp xác định đặc tính của enzyme lactase.................................19
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu.........................................................................19
PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................20
4.1. Kết quả phân lập A. oryzae..........................................................................20
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái nấm phân lập được trên các mẫu thu thập...........20
4.3. Kết quả tuyển chọn các chủng Aspegillus oryzae sinh enzyme lactase trên
môi trường PDA..................................................................................................25
4.3.1. Kết quả định tính chủng sinh enzyme.......................................................25
4.3.2. Kết quả định lượng hoạt độ enzyme lactase..............................................26
4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tốc độ phát triển của nấm.............27
4.3.4. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến tốc độ phát triển của nấm.....................28
4.4. Đặc tính của enzyme lactase sinh ra bởi nấm mốc Aspergillus oryzae........29
4.4.1. Độ bền nhiệt..............................................................................................29
PHẦN THỨ NĂM – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................32
5.1. Kết luận........................................................................................................32
5.2. Đề nghị.........................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................41
PHỤ LỤC............................................................................................................39

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần cơ chất tham gia phản ứng enzyme định lượng lactase. .17
Bảng 4.2. Tốc độ phát triển của tản nấm trên môi trường PDA ở 300C..............22
Bảng 4.3. Tốc độ phát triển của tản nấm trên môi trường CYA ở 300C..............24
Bảng 4.4. Kết quả định tính lactase của các loại nấm đã phân lập......................25

Bảng 4.5. Kết quả định lượng hoạt độ enzyme...................................................26
Bảng 4.6. Tốc độ phát triển của tản nấm trong điều kiện nhiệt độ khác nhau trên
môi trường PDA sau thời gian nuôi cấy 96h.......................................................27
Bảng 4.7. Tốc độ phát triển của nấm trên môi trường pH khác nhau.................28

5


DANH MỤC HÌNH, ĐỒ TH
Hình 2.1. Cơ chế thủy phân đường lactose của enzyme lactase...........................3
Hình 4.1. Một số hình ảnh nấm phân lập được................................................21Y
Hình 4.2. Độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh ra bởi chủng M1.....................30
Hình 4.3. Độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh ra bởi chủng G1......................30

vii


PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong cơ thể sống, hầu như không có một quá trình hóa học nào lại không
có sự liên quan mật thiết đến các quá trình sinh học xúc tác của enzyme. Chính
vì thế, việc sản xuất các chế phẩm enzyme đã ra đời và đang phát triển mạnh mẽ
trên quy mô công nghiệp. Công nghệ enzyme được nghiên cứu, ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực khác nhau và thu được rất nhiều lợi nhuận. Trong số các enzyme
đó, không thể không kể đến sự có mặt và ứng dụng của enzyme lactase.
Enzyme lactase có khả năng thủy phân đường lactose thành đường đơn
giản hơn gồm galactose và glucose mà sinh vật nói chung đều có thể hấp thụ
được. Do thế, nó được dùng để thủy phân lactose trong sữa và whey, tạo ra các
sản phẩm có hàm lượng lactose thấp. Với thói quen ít dùng sữa của một số
người thì enzyme lactase bị mất dần, khi đó, việc sử dụng sữa hay các sản phẩm

từ sữa sẽ khiến cơ thể phản ứng lại với các biểu hiện như khó tiêu, tiêu chảy…
Do vậy, lactase được biết đến như một phương pháp trong việc giảm các hiện
tượng trên, góp phần quan trọng cho ngành chế biến sữa nói riêng và nền công
nghiệp thực phẩm nói chung (Đặng Thị Thu và cs., 2007).
Lactase tự nhiên được tìm thấy ở ruột non động vật. Bên cạnh đó nó còn
được tìm thấy như một chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ một số vi sinh vật như
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn. Lactase sinh ra từ các chủng vi sinh vật khác
nhau sẽ có những đặc tính khác nhau. Lactase từ nấm mốc rất ổn định và không
cần ion kim loại cho hoạt động của mình, đồng thời, nấm mốc sản sinh ngoại
bào nên dễ dàng cho việc thu nhận enzyme. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thu
nhận lactase từ nấm mốc rất được quan tâm. Một số chủng nấm mốc có khả
năng sinh lactase có thể kể đến như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, nấm
men Kluyveromyces lactics, Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotropicalis
… (Nguyễn Thúy Hương, 2013).
1


Aspergillus oryzae được biết đến là một loại nấm mốc có lợi, có khả năng
sinh trưởng và phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Các chủng được
phân lập từ nguồn cơ chất khác nhau cũng có đặc điểm khác nhau, khả năng sinh
lactase và hoạt tính lactase khác nhau. Chính vì thế đề tài “Phân lập, tuyển
chọn và xác định đặc tính các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sinh
enzyme lactase” được quan tâm nghiên cứu.
1.2. Mục tiêu chung
Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính các chủng Aspergillus oryzae
có khả năng sinh enzyme lactase.
1.3. Mục tiêu cụ thể
- Phân lập được chủng Aspergillus oryzae có khả năng sinh lactase từ các
nguồn cơ chất khác nhau trên môi trường PDA và CYA;
- Tuyển chọn được các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sinh

lactase và khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH tới các chủng đó;
- Xác định độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh ra bởi các chủng
Aspergillus oryzae tuyển chọn được.

2


PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về enzyme lactase
2.1.1. Enzyme lactase
2.1.1.1. Giới thiệu về enzyme lactase
Lactase hay còn gọi là lactase – phlorizyn hydrolase hoặc lactose
galactohydrolase, hay còn có tên gọi khác là β-galactosidase. Nó có khả năng
thủy phân liên kết β-(1,2) và β-(1,4) galactoside của các polysaccharide và
oligosaccharide cũng như phản ứng nghịch đảo của các phản ứng ngưng tụ và
chuyển hóa thành một loại đường khác nhờ thay đổi liên kết glycoside. Do đó,
lactase có thể dùng để thủy phân đường lactose thành đường đơn giản hơn gồm
galactose và glucose sinh vật có thể hấp thụ được. Việc sử

dụng

β-

galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những
ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sản phẩm
từ sữa. Enzyme này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố
định nhưng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn,
còn dạng cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản
xuất gián đoạn và liên tục. Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân

lactose với enzyme tự do, nhưng việc sử dụng enzyme β-galactosidase cố định là
một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó (Đặng Thị Thu và cs.,
2007).

Hình 2.1. Cơ chế thủy phân đường lactose của enzyme lactase
3


2.1.1.2. Nguồn thu nhận
Lactase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các loài thực vật, động vật và vi
sinh vật. Tuy nhiên, tính chất của enzyme được thu nhận từ các nguồn khác
nhau có sự khác nhau rõ rệt. Enzyme thu nhận từ nguồn thực vật và động vật
có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế
như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu
nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng
của loại enzyme này. Nguồn thu nhận chủ yếu là từ E.coli tuy nhiên nó còn phổ
biến ở tự nhiên, được tìm thấy ở thực vật (quả mơ, táo…), cơ quan động vật,
nấm men, nấm mốc và vi khuẩn (Lê Xuân Phương, 2001).
Vi khuẩn: Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis,
B.

megaterum,

Bifidobacterium

B.

bifidum,

thermosulfurogens,

agglomerans,

stearothermophilus,

E.

B.infantis,

Clostridium

Corynebacterium
cloaceae,

Bacteriodes

Escherichia

polypragmatus,

acetobutylicum,

murisepticum,
coli,

C.

Enterobacter

Klebsiella

pneumonia,

Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L. kefiranofaciens, L.
lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii…
Nấm mốc:

Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A.

carbonarius, A. oryzae,

Auerobasidium pullulans,

Curvularia inaequalis,

Fusarium monilliforme, F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora
crassa,

Penicillum

canescens,

P.

chrysogenum,

P.

expansum,

Saccharopolyspora rectivergula, Streptomyces violaceus…

Nấm men: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces
anamensis, S. lactis, S. fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis,
K.marxianus (Tarek Elbashiiti et al., 2010).
Lactase của nấm men hoạt động tối ưu ở pH là 6 – 7, của nấm mốc là từ 3
– 5. Do lactase của nấm men và nấm mốc có pH tối ưu khác nhau nên enzyme

4


của nấm men hoạt động tốt trong huyết thanh sữa có pH trung tính, còn enzyme
của nấm mốc hoạt động tốt hơn trong huyết thanh sữa có tính acid.
Việc lựa chọn cơ chất rẻ tiền và sẵn có cùng với vi sinh vật sản xuất phù
hợp là những yêu cầu trong sản xuất enzyme. Mặt khác nấm mốc sản xuất
enzyme ngoại bào nên dễ dàng cho việc thu nhận enzyme. Vì thế, Aspergillus
oryzae và Aspergillus niger thường được sử dụng nhiều nhất (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
2.1.1.3. Ứng dụng của enzyme lactase
Enzyme lactase có vai trò vô cùng to lớn trong ngành công nghiệp thực
phẩm nói chung và ngành công nghiệp chế biến sữa nói riêng. Thủy phân lactose
trong whey là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành
công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu được qua lọc
màng có thể được sử dụng như chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng
hợp và nước giải khát.
Ngoài ra, sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến
hương liệu sữa, phô mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng
sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và
sản phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa
chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thường
là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa
chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hương vị cho pho mát. Chất lượng của

sữa đông lạnh và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzyme
lactase. Nó chống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành
glucose và galactose và làm giảm cấu trúc cát sạn (Kumari et al., 2010).
2.1.1.4. Tình hình sản xuất enzyme lactase trong và ngoài nước
Trên thế giới đã sản xuất lactase và ứng dụng rất rộng rãi trong thực
phẩm. Enzyme lactase được biết có khả năng thủy phân đường lactose thành

5


glucose và galactose, đồng thời còn tạo ra các sản phẩm phụ là GOS (Galactooligosaccharide). Các GOS này không có giá trị dinh dưỡng với con người,
không được cơ thể con người hấp thụ nhưng lại được vi khuẩn ở ruột già sử
dụng, do đó các GOS này có tiềm năng để sản xuất prebiotic. Trên thế giới GOS
đã được nghiên cứu và sản xuất thương mại, GOS được thừa nhận và bổ sung
vào thực phẩm ở châu Âu. Đã có nhiều chiến lược được đặt ra để sản xuất GOS
dạng công nghiệp. Từ những năm 1950 người ta đã biết được rằng những
oligosaccharide có thể được hình thành từ monosaccharide với xúc tác là các
acid vô cơ. Aronso đầu tiên đã thu được oligosaccharide khi thủy phân lactose
trong môi trường acid. Do sản phẩm tạo ra thiếu sự đa dạng và ở điều kiện khắc
nghiệt khi dùng acid thủy phân lactose, con đường sản xuất GOS này đã không
được dùng trong công nghiệp. Do vậy người ta nghĩ đến một hướng khác đó là
sử dụng enzyme lactase với hiệu suất tạo GOS cao (Nguyễn Bảo Dư, 2011).
Tuy nhiên ở Việt Nam, lactase vẫn chưa được sản xuất với qui mô công
nghiệp, chỉ bước đầu nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm.
Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản, lacstase từ nấm
mốc Aspergillus oryzae có triển vọng để để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như
công nghệ thực phẩm, công nghệ di truyền, y học… Lactase đã và đang trở
thành một trong những mối nghiên cứu quan trọng của các nhà khoa học trên thế
giới (Sunil Agrawal et al., 1989)
2.1.2. Phương pháp thu nhận enzyme

Để phân lập các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme, người ta dùng môi
trường đặc trưng cho từng nhóm vi sinh vật. Hiện nay, hai phương pháp nuôi
mặt và nuôi bề sâu là hai phương pháp dùng phổ biến nhất.
2.1.2.1. Phương pháp nuôi bề mặt
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004): “Phương pháp nuôi về mặt thích hợp
cho quá trình nuôi nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. Môi trường nuôi cấy là rắn
hoặc xốp”.
6


Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi cao về
thiết bị, không đòi hỏi vô trùng tuyệt đối. Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm là tốn
diện tích mặt bằng, khó cơ khí hóa, khó tự động hóa được toàn bộ quá trình, chi
phí nhân công, điện nước… cho một sản phẩm cao, sản phẩm tạo thành không
được tinh sạch.
2.1.2.2. Phương pháp nuôi bề sâu
Phương pháp nuôi bề sâu hay lên men chìm là phương pháp được dùng
cho cả vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí, phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men
công nghiệp, vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trình một cách
dễ dàng.
Phương pháp này có ưu điểm tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt
dây chuyền, chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản
phẩm thấp, dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn, các thiết bị lên men
chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá. Nó cũng có những nhược điểm như đòi hỏi
trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị lên men
chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc
với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ phần đã
nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng được). Hơn nữa trong lên men chìm
cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được oxy hoà tan
trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệ thống

này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
2.2. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.1. Các đặc điểm chung của Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Tricomomacae, bộ
Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới Nấm
(Kitamoto, 2002) và là nấm đa bào.

7


Nấm mốc A.oryzae là một trong những loại nấm mốc có khả năng sinh
trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Quan sát trên
kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 cho thấy đặc điểm hình thái của A. oryzae như:
cơ thể sinh trưởng là một hệ sợi rất mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh
nhiều và có vách chia sợi có các cuống đính bào tử (dài 1 -2 mm) nên có thể
quan sát bằng mắt thường, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính, phía cuống đính 1
bào tử phồng lên gọi là bọng, bọng đỉnh giá có hình quả lê, hình chùy hoặc hình
cầu, đường kính từ 22 - 50µm, cuống sinh bào tử nhẵn hoặc sần sùi, kích thước
từ 500 – 2500 µm. Bào tử trần hình cầu đến hình trứng, nhẵn đến có gai nhẹ,
đường kính 4 – 8,5 µm, có vàng lục hay màu vàng hoa cau.
Chúng ta dễ dàng bắt gặp Aspergillus oryzae ở những nơi có điều kiện
nóng ẩm, như các kho dự trữ lương thực, như lúa, gạo, ngô, mì… Hay như ở
Việt Nam, A.oryzae được sử dụng vào quá trình làm tương, tại Nhật Bản ngoài
làm tương thì nó còn dùng vào việc sản xuất súp miso và rượu sake.
A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme sinh vật, sử dụng cơ chất hữu cơ
để làm dinh dưỡng. Vì vậy để nấm mốc sinh trưởng, phát triển tốt thì môi trường
phải đảm bảo có đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào, sinh tổng hợp
enzyme và khả năng sinh bào tử cao (Nguyễn Lân Dũng và cs., 1982).
2.2.1.1. Nguồn dinh dưỡng

 Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử từ
enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Khoảng một nửa chất khô
của tế bào là cacbon. Chính vì vậy, những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng
đầu trong sự sống của vi sinh vật.
Trong nuôi cấy vi sinh vật, nguồn cacbon thường được sử dụng là tinh
bột, đường saccarose, đường glucose… Các loại bột ngũ cốc như bột gạo, bột
ngô, bột mỳ, bột sắn, cám gạo… có chứa nhiều tinh bột là nguồn cacbon chính

8


được sử dụng trong nuôi cấy nấm mốc để thu nhận enzyme theo phương pháp
nuôi cấy bề mặt.
A.oryzae có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và không đòi
hỏi nghiêm ngặt đối với các loại thức ăn cacbon. Nhiều loại nấm mốc còn có
khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều
sinh vật khác (các hợp chất n – ancal, ancaloit, phenol, nhiều chất kháng
sinh…). Đối với nguồn thức ăn phức tạp như xylan, tinh bột, xenlulo, kitin…
trước hết A.oryzae phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất này thành
các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng.
 Nguồn nitơ
Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong các quá
trình sống để xây dựng tế bào. Tất cả các thành phần quan trọng trong tế bào đều
có chứa nitơ (protein, acid nucleic, enzyme…). Trong tất cả các môi trường nuôi
cấy cần thiết phải có các hợp chất nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hóa được. Việc
chọn nguồn nitơ phải đảm bảo được hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế.
Nguồn nitơ dùng trong nuôi cấy vi sinh vật có thể là hợp chất vô cơ như muối
nitrat, muối amon, ure hoặc các hợp chất hữu cơ như: bột đậu tương, bột mì, bột
ngô, bột khô lạc. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sinh tổng hợp

enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nitơ hữu cơ và nitơ
vô cơ. Nấm mốc A.oryzae thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và
hữu cơ.
 Các nguyên tố khoáng
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định được tất
cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố đa lượng có thể
kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần
trăm trọng lượng khô. Các nguyên tố vi lượng Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B. Hàm

9


lượng các nguyên tố khoáng trong tết bào nấm mốc thay đổi tùy thuộc vào điều
kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy.
Một trong những tính chất của chúng là làm thay đổi trạng thái hóa keo
của tế bào chất. Dưới tác dụng của những muối vô cơ lớp bề mặt tế bào không
ngừng thay đổi và dẫn đến làm thay đổi tốc độ các phản ứng enzyme trong quá
trình trao đổi chất. Sự có mặt của hợp chất P và nồng độ của chúng trong môi
trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật.
Thay đổi nồng độ các hợp chất P trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá
trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào chứa P, tế bào chất và chất
nhân. Ngoài ra P trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme
đồng hóa các loại thức ăn C.
Một số kim loại (Zn, Fe, Mn, Mg…) là các chất hoạt hóa enzyme. Chúng
tham gia vào cấu tạo phân tử enzyme, enzyme này được gọi là các
metaloenzyme. Cơ chế tác dụng của các cation kim loại trong các phản ứng
enzyme có thể là: kim loại là thành phần trung tâm hoạt động enzyme, kim loại
giúp định hình và ổn định phân tử protein cần thiết để có tác dụng xúc tác của
enzyme, kim loại có tác dụng lên cơ chất làm thay đổi cấu trúc điện tử và dễ
dàng tham gia vào các phản ứng enzyme, kim loại giúp cho coenzyme kết hợp

với apoenzyme, kim loại thực hiện chức năng cầu nối giữa enzyme và cơ chất
tạo thành các hợp chất trung gian.
2.2.1.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới hoạt động của vi sinh vật. A.oryzae là vi sinh
vật ưa ấm, nhiệt độ tối thích từ 28 – 32oC. Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong
quá trình sinh trưởng của sợi nấm. Nhiệt độ quá thấp, A.oryzae phát triển chậm,
thời gian nuôi cấy kéo dài. Nhiệt độ quá cao dẫn đến hô hấp quá mạnh, không
tốt cho quá trình tạo sinh khối (Lê Văn Nhượng và Quản Đức Thịnh, 1968).
2.2.1.3. Độ ẩm

10


Trong những nhân tố tác động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có
vai trò rất lớn. Độ ẩm môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành enzyme
khoảng 55 – 60%. Độ ẩm môi trường tốt nhất cho sự hình thành bào tử của nấm
mốc là khoảng 45%. Cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá
trình phát triển (Lê Xuân Phương, 2001).
2.2.1.4. Độ thoáng khí
A.oryzae hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển trong điều kiện thoáng khí.
Nếu bề mặt môi trường không đảm bảo sự thoáng khí, độ dày môi trường lớn sẽ
dẫn đến thiếu sự lưu thông oxy và CO 2, nấm mốc phát triển cục bộ. Khi nuôi cấy
nấm mốc bằng phương pháp bề mặt cần chú ý tới độ dày khối môi trường để
đảm bảo sự thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc. Để đáp ứng điều
kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không quá dày và phòng
nuôi phải thoáng (Lê Xuân Phương, 2001).
2.2.1.5. pH môi trường
pH môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của A.oryzae. Phần
nhiều nấm mốc phát triển trong phạm vi pH từ 4 – 8 nhưng một số nấm mốc có
khả năng chịu được cơ chất pH có acid cao hơn hoặc kiềm hơn. pH môi trường

thuận lợi cho sự phát triển của A.oryzae là môi trường acid yếu pH 5,5 – 6,5.
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá
trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc A.oryzae vì môi trường rắn có tính
đệm cao (Lê Xuân Phương, 2001).
2.2.1.6. Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của
A.oryzae. Thường thì thời gian thích hợp đối với A.oryzae là 36 – 72h. Nếu thời
gian quá ngắn hoặc quá dài thì nấm mốc cho hiệu quả sản xuất không cao (Lê
Xuân Phương, 2001).
2.2.2. Ứng dụng của A. oryzae
2.2.2.1. Ứng dụng của A.oryzae trong công nghệ thực phẩm
11


A.oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như
cenlulase, pectinase, xylanase, hemicellulase khi sống trên môi trường có cơ
chất tương ứng. Thực tế, A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản
xuất, chế biến thực phẩm như nước mắm, bia, bánh kẹo… và trong công nghiệp
sản xuất các enzyme (amylase, protease, lipase…).
Trong ngành công nghệ sản xuất nước quả: enzyme glucanase và
pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt và tăng độ đồng
thể các loại nước quả có thịt quả tốt hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia: các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase được sử dụng để ngăn chặn sự tào thành các diaxetyl, giúp rút ngắn
thời gian lên men bia.
Trong công nghệ sản xuất cà phê: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme
cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng trích ly dịch quả
trong sản xuất cà phê.
Ở Nhật Bản, A.oryzae được sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn như
xì dầu, rượu sake, các sản phẩm lên men truyền thống như tương miso…

Ở Việt Nam, A.oryzae được sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tương.
2.2.2.2. Ứng dụng của A.oryzae trong các lĩnh vực khác
Trong đời sống, A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản suất.
Trong công ngệ sản xuất giấy và bột giấy: các loại enzyme được bổ sung
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng, và xeo giấy có vai trò quan trọng, gỗ được xử
lý với các endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ
làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phái trong gỗ và hiệu quả khử ligin.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme βglucanase trực tiếp cho vào thức ăn sẽ cho phép tăng hấp thu và chuyển hóa thức
ăn của động vật.

12


Trong công nghệ sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy
thành tế bào như cellulase, hemicellulase giúp tăng lượng đường tạo ra dẫn tới
tăng hiệu suất thu hồi rượi lên 1,5% (Đặng Thị Thu và cs., 2012).
Trong công nghệ xử lý nước thải và sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất
enzyme cellulase thủy phân cellulose trong rác thải. Vì vậy, nước thải của nhà
máy giấy, cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung chế phẩm chứa hệ
cellulase đem lại hiệu qua cao (Trần Đình Toại, 2007).
2.2.3. Khả năng sinh enzyme lactase của chủng A.oryzae và những yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng đó.
Các chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus có khả năng tổng hợp mạnh
mẽ và đồng thời nhiều enzyme khác nhau hoặc một enzyme nhất định nào đó.
Enzyme lactase hay còn gọi là β-galactosidase được sản xuất từ nấm men
và nấm mốc. Nấm mốc được sử dụng nhiều nhất là A. oryzae và A. niger
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Bảng 2.1. Tính chất của lactase
Tính chất của lactase
pH hoạt động

Nhiệt độ tối ưu
pH ổn định tối ưu và nhiệt độ
tối ưu

Nguồn lactase
Nấm men
6,5 – 7
30 – 750C

Nấm mốc
4,5 – 6,5
40 – 500C

6,5 – 7,5; 300C

pH 4,5

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
pH đầu của môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ enzyme, pH thích
hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme lactase của A.oryzae từ 7 – 7,5.
Đối với nguồn cacbon thì cacbon có nguồn gốc từ lactose và galactose,
A.oryzae có khả năng sinh tổn hợp lactase. Tuy nhiên, đối với cacbon từ nguồn
saccaroso, maltose thì ngược lại (Đặng Thị Thu và cs., 2007).
Ngoài ra, quá trình sinh enzyme của nấm mốc còn chịu sự ảnh hưởng của
các yếu tố dinh dưỡng như nguồn nitơ, cacbon, amino acid …
13


2.2.4. Đặc điểm của enzyme sinh ra bởi A.oryzae.
Lactase từ nấm mốc rất ổn định, đồng thời nấm mốc sản xuất enzyme

ngoại bào nên dễ dàng cho việc thu nhận.
Lactase sinh ra bởi A.oryzae có pH tối ưu là 4 – 4.5, hoạt tính 400U/g
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).

14


PHẦN THỨ BA – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Để phân lập, sàng lọc và nghiên cứu đặc tính các chủng Aspergillus
oryzae có khả năng sinh enzyme lactase”, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu có
cơ chất lactose và mẫu có khả năng có sự xuất hiện nấm Aspergillus oryzae.
Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam, nấm mốc phát triển hết
sức thuận lợi. Hơn nữa, Aspergillus oryzae lại giàu enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào như amylase, protease, lactase… nên chúng ta rất dễ bắt gặp chúng ở
các kho nguyên liệu, thùng chứa bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch, ở
bã bia, bã rượu, lõi ngô, sắn… Không chỉ vậy, Aspergillus oryzae còn tham gia
vào việc sản xuất nhiều loại thực phẩm như sản xuất nước tương, nước nắm,
miso, rượu sake… ở Nhật, và ở nước ta, Aspergillus oryzae tham gia vào quá
trình làm tương – loại thực phẩm phổ biến.
Vì vậy, địa điểm thu thập mẫu của chúng tôi là các địa điểm làm tương
nổi tiếng ở Việt Nam như thị trấn Bần (Hưng Yên), Ba Vì (Hà Nội)…, và các
kho chứa nguyên liệu tại các vùng quê như Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Nội. Ngoài
ra chúng tôi còn tiến hành thu thập thêm các mẫu như thức ăn chăn nuôi, nguồn
nước thải, sữa… tại địa điểm chăn nuôi bò Vĩnh Phúc.

Hình 4.1. Các sợi nấm phát triển trên bề mặt mẫu đậu tương mốc (Hưng Yên)
và mẫu gạo mốc (Thanh Hóa).

15


3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu
Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, buồng cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, cân
kỹ thuật, cân phân tích, máy đo pH, bề ổn nhiệt, máy đo OD…
Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, đĩa Petri, que cấy, đèn cồn, ống tube
đựng mẫu, bình định mức…
Hóa chất: NaNO3, MgSO4, FeSO4…
3.1.3. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường PDA (Potato D – glucose Agar) (g/l): khoai tây (200g),
đường D – glucose (20g), agar (15g), nước cất vừa đủ.
- Môi trường CYA (Czapek Yeast Autolysate Agar) (g/l): cao nấm men
(5g), NaNO3 (3g), K2HPO4 (1g), KCl (0.5g), MgSO4.7H2O (0.5g), FeSO4.7H2O
(0.01g), succrose (100 ml với nồng độ 30g/100ml), agar (15g), nước cất vừa đủ.
- Môi trường PLA + X – gall (g/l): khoai tây (200g), đường lactose (20g),
agar (15), nước cất vừa đủ.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ thực phẩm Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu từ 08/2016 đến 1/2017.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng Aspergillus oryzae từ các nguồn cơ chất khác nhau;
- Tuyển chọn các chủng Aspergillus oryzae có khả sinh enzyme lactase và
khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố tới phát triển của tản nấm mốc:
+ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: PCA, CYA;
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy: 20; 25; 30; 35, 40oC;
+ Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau: 3; 4; 5; 6; 7.

16

- Xác định đặc tính bền nhiệt của enzyme lactase sinh ra bởi các chủng
Aspergillus oryzae tuyển chọn được. Độ bền nhiệt: ở 30 oC, 60oC trong
khoảng thời gian từ 1-5h, bước nhảy 0,5h;
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp phân lập
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên trong
môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Tiến hành: Mẫu ở dạng rắn thì phải đưa về dạng lỏng bằng cách nghiền
mẫu và hòa tan mẫu bằng nước cất vô trùng. Sau đó pha loãng mẫu ở nồng độ
cần thiết. Từ mẫu pha loãng này, hút 0,1ml vào đĩa thạch chứa sẵn môi trường
PDA, dùng que cấy trang đều cho đến khi bề mặt khô, sau đó đặt ở tủ nuôi 30 oC.
Để có được chủng thuần, tiến hành lặp lại các thao tác trên cho đến khi tất cả các
khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường đĩa thạch là đồng nhất.
3.4.2. Phương pháp tuyển chọn
Nấm mốc Aspegillus oryzae được sàng lọc bằng cách xác định các chủng
có khả năng sinh enzyme lactase.
3.4.2.1. Phương pháp định tính lactase
Nguyên tắc: Sự có mặt của enzyme -galactosidase được xác định dựa
trên nguyên tắc sau: -galactosidase xúc tác thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết
tủa màu xanh da trời. Vi khuẩn dương tính với enzyme này tạo khuẩn lạc màu
xanh khi nuôi cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal trong môi trường nuôi cấy
(Gonzalez, 1994).
Tiến hành: X-Gal được hoà tan trong dimethyl sulphoxide (C 2H6OS) ở
nồng độ 20 g/μl. Dung dịch gốc này phải được bảo quản trong tối ở nhiệt độ
-20ºC. Môi trường PDA thạch đĩa được hấp vô trùng, để tủ ấm 30 0C qua đêm,
sau đó gạt đều 60 l chỉ thị X-Gal trên bề mặt môi trường PDA thạch đĩa. Cấy
17

chấm điểm các chủng nấm mốc phân lập được trên đĩa thạch có chỉ thị X-Gal
(Gonzalez,1994).
Sau 48 giờ nuôi cấy ở 30 0C, các chủng nấm mốc tạo khuẩn lạc có màu
xanh trên đĩa chỉ thị là các chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme galactosidase.
3.4.2.2. Phương pháp định lượng lactase
Nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp lactase theo phương pháp nuôi bề sâu,
đặt trong máy lắc tròn với chế độ lắc 200 (v/ph).
Nguyên tắc: Xác định định lượng lactase dựa trên phản ứng với cơ chất onitrophenol-β-D-galactosid (oNPG), khi cơ chất này bị β-galactosidase thủy
phân sẽ tạo ra galactose và nitrophenol (màu vàng). Thành phần oNP hấp thụ
bước sóng 420 nm. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ oNP
(0 đến 0,9 mM) trong dung dịch và giá trị A 420 (Mahoney, 1998).
Một đơn vị hoạt tính (IU) được quy định là lượng enzyme cần thiết để giải
phóng 1μM ONP trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.
Tiến hành: sinh khối sinh ra được lọc qua một lớp màng lọc, dung dịch
thu được đem li tâm ở chế độ 6000 vòng trong thời gian 20 phút. Sau li tâm, gạt
bỏ giữa phần cặn và phần dịch, phần dịch chính là phần chứa enzyme thu được,
lấy dịch cho vào các ống tube lưu mẫu, cất giữ ở điều kiện 4oC.
Mỗi phản ứng enzyme chuẩn bị 2 ống nghiệm (1 ống test và 1 ống đối chứng):
Bảng 3.1. Thành phần cơ chất tham gia phản ứng enzyme định lượng lactase
Thành phần

oNPG

Enzyme

(µl)
Ống test
Ống đối chứng

480

480

20
0

Môi trường

Na2CO3

0
750
20
750
( Theo Toru Nakayama et al., 1999)

Phản ứng enzyme được thực hiện ở 30oC, nên sau khi cho oNPG vào, cả
ống test và ống đối chứng đều được ủ nhiệt ở 30 oC trong vòng 5 phút với máy ủ
nhiệt. Sau đó, ống test được thêm 20µl enzyme (enzyme có thể pha loãng thích
18


hợp), ủ ở 30oC trong 10 phút, thời gian 10 phút là thời gian phản ứng được tính
chính xác kể từ lúc cho enzyme vào. Kết thúc phản ứng bằng cách cho them 750
µl Na2CO3 (0.4 M).
Mẫu đối chứng: sử dụng 20 µl môi trường nuôi cấy thay vì enzyme tương
ứng.
Mẫu test : ít nhất 2 ống, lỗi thử nghiệm không được vượt quá 5%.
Sau khi phản ứng kết thúc, đo mẫu ở OD 420nm, đối chiếu với đường
chuẩn để suy ra lượng enzyme tương ứng.
Lưu ý: oNPG được giữ ở -20°C và khá là đắt tiền nên chỉ cần chuẩn bị số

lượng đủ cho thử nghiệm. oNPG là chất không dễ dàng để hòa tan khuấy nên từ
trường có thể được sử dụng nhưng nó phải được thực hiện rất nhanh chóng để
tránh sự nóng. oNPG là nhạy cảm với ánh sáng nên khi dụng cụ pha hóa chất
phải là vật liệu tối, không tiếp nhận ánh sáng. oNPG chỉ được chuẩn bị vừa đủ
thực hiện các thí nghiệm hàng ngày, tuy nhiên, nếu sau ngày thí nghiệm vẫn còn
dư thừa, không vứt nó đi. Nó có thể được giữ ở -20°C trong thời gian tới.
3.4.2.3. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố tới tốc độ phát triển
của tản nấm A.oryzae có khả năng sinh enzyme lactase
Nguyên tắc: sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật chịu sự ảnh hưởng rất
lớn của các nhân tố môi trường như nhiệt độ, hóa chất, pH…Vì vậy, để khảo sát
sự ảnh hưởng của các yếu tố tới tốc độ phát triển của nấm A.oryzae chúng tôi
tiến hành nuôi cấy ở các điều kiện môi trường, nhiệt độ và pH khác nhau.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của môi trường
Tiến hành: các chủng nấm mốc được nuôi trên 2 môi trường khác nhau là
PDA và CYA. Qua thời gian nuôi cấy 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, đo
kích thước của tản nấm.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
Tiến hành: nấm được nuôi trên môi trường PDA, mỗi chủng 5 đĩa tương
ứng với 5 mức nhiệt độ khác nhau. Sau 96h, đo kích thước tản nấm.
19


Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH
Tiến hành: nuôi nấm ở các môi trường PDA sau khi đã được chuẩn độ về
pH 4, 5, 6, 7, mỗi một chủng ứng với 4 môi trường pH khác nhau. Quan sát quá
trình hình thành khuẩn lạc. Sau 96h, đo kích thước tản nấm và nhận xét.

3.4.3. Phương pháp xác định đặc tính của enzyme lactase
3.4.4.1. Phương pháp test bền nhiệt
Phương pháp tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sinh βgalactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt được xác định theo phương pháp

của Nguyễn Hoàng Anh và cs. (2012). Để xác định khả năng chịu nhiệt của βgalactosidase, các enzyme này được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (30ºC, 60ºC).
Tại các thời gian ủ khác nhau, enzyme lấy ra để xác định hoạt tính (mục
3.4.2.2). Độ bền nhiệt của enzyme được xác định bằng cách so sánh với mẫu đối
chứng không qua xử lí nhiệt (30ºC).
3.4.4.2. Phương pháp test bền pH
Chủng có enzyme chịu nhiệt được xác định ở trên (mục 3.4.4.1) được sử
dụng để xác định khả năng chịu acid. Để xác định độ bền ph của βgalactosidase, ủ các enzyme này ở pH 3,4. Tại các thời gian ủ khác nhau,
enzyme lấy ra để xác định hoạt tính theo phương pháp xác định hoạt độ (3.4.3).
Độ bền của enzyme được xác định bằng cách so sánh với mẫu đối chứng không
qua xử lí nhiệt (30ºC) và ở pH 7 (Nguyễn Hoàng Anh và cs., 2012).
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm excel và xử lý thống kê bằng phần
mềm Minitab 16. Các nhân tố được phân tích nhờ phương pháp ANOVA một
chiều và ANOVA hai chiều. Giá trị trung bình được đánh giá nhờ phép so sánh
Turkey một chiều với giới hạn tin cậy là 95%.

20


PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập A. oryzae
Từ các nguồn cơ chất khác nhau, ở những địa điểm khác nhau mà chúng
tôi thu thập được, ta tiến hành phân lập trên môi trường PDA. Kết quả phân lập
thu được nhiều loại nấm với những hình thái khác nhau và được thể hiện qua
bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái nấm phân lập được trên các mẫu thu thập
Cơ chất

Số
loại

Kí hiệu
chủng
G1

Gạo

03

G2
G3
T1

Tương
bần

03

T2
T3
P1

Đậu
tương
Bã đậu
sau khi
làm đậu
phụ

03

P2
P3
B1

03

B2
B3

Ngô

03

F1
F2

Hình thái khuẩn lạc nghi ngờ
-

Tâm nấm màu vàng hoa cau, màu trắng, có sợi;
Nấm chuyển màu nâu vàng khi về già.
Thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh (sau 24h)
Khi nấm còn non có màu vàng nhạt ở tâm nấm,
rìa nấm là các sợi màu trắng.

-

Hệ nấm bao phủ toàn bộ bề mặt cơ chất.
Tâm nấm màu vàng hoa cau, màu trắng, có sợi;

Nấm chuyển màu nâu vàng khi về già.
Nấm có màu xanh, không sợi, phủ toàn bộ bề mặt
cơ chất khi về già.
- Khi nấm còn non có màu vàng nhạt ở tâm nấm,
rìa nấm là các sợi màu trắng.
- Sợi nấm màu trắng, dài mịn. Hệ ít sợi.
-

Sợi nấm màu trắng, có đốm vàng, sợi dài, mịn;
Bao phủ bề mặt cơ chất.
Sợi nấm màu trắng;
Hệ sợi nhiều.
Sợi nấm trắng, ngắn;
Có hiện tượng đọng ẩm.
Sợi nấm trắng ngắn;
Không bao phủ bề mặt cơ chất.
Sợi nấm trắng, ngắn;
Phát triển không đều.
Sợi nấm vàng nhạt, ít; Phát triển không đều.
Thời gian xuất hiện khuẩn lạc chậm (sau 48h)
Sợi nấm vàng xen lẫn xanh, Hệ nấm thưa thớt.
21