công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

4/9/2019

Chương 3:
Công nghệ sản xuất chế
phẩm enzyme từ vi sinh vật

Sản xuất chế phẩm enzyme từ VSV
1. Điều hoà quá trình sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi
cấy VSV
2. Tuyển chọn và cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt lực cao
3. Phương pháp bảo quản giống VSV
4. Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme
5. Các phương pháp nuôi cấy VSV

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

2

1


4/9/2019

Con đường trao đổi chất
• Hàng loạt phản ứng hóa
học xảy ra trong tế bào.
• Sản phẩm của phản ứng
này là cơ chất của phản
ứng tiếp theo.
• Thiếutăng; thừa giảm

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

3

Nguyên lý của quá trình điều hòa
• Điều hòa hoạt độ:
bản thân enzyme đó hoạt động bình thường hay giảm hoạt động do bị
ức chế

• Điều hòa sinh tổng hợp enzyme
số lượng các enzyme được sản xuất ra ít hay nhiều

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

4

2


4/9/2019

Điều hòa hoạt độ
• Nhiều loại enzyme thường không sử dụng hết khả năng xúc tác
của chúng
• Làm tăng tốc độ của quá trình chuyển hóa khi có nhu cầu cần
thiết của tế bào
• yếu tố không đặc hiệu: pH, thế năng oxy hóa khử, lực ion, nhiệt độ
• hợp chất có tác dụng đặc hiệu với trung tâm hoạt động: cơ chất, coenzyme
• chất có tác dụng dị lập thể
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

5

Điều hòa hoạt độ theo cơ chế dị lập thể
• khi sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của một dãy phản ứng hóa học
xúc tác bởi nhiều enzyme có thể tác dụng hoạt hóa hay ức chế lên
enzyme xúc tác phản ứng đầu tiên là một enzyme dị lập thể.
• Enzyme dị lập thể thay đổi hoạt độ xúc tác thông qua sự thay
đổi cấu hình không gian của enzyme, của trung tâm hoạt động
khi gắn với các chất điều hòa dị lập thể
• Nếu làm tăng hoạt độ gọi là chất điều hòa dương, nếu làm giảm
hoạt độ gọi là các chất điều hòa âm.
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

6

3


4/9/2019

Ức chế ngược - ức chế dị lập thể

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

7

Điều hòa hoạt độ theo cơ chế biến đổi dạng HĐ và KHĐ

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

8

4


4/9/2019

Điều hòa sinh tổng hợp enzyme
Trong cơ thể thường tồn tại hai loại enzyme:
• Enzyme thường trực hay enzyme cơ cấu (constitutive
enzymes) là những enzyme tham gia thành phần cơ bản của
hoạt động tế bào, gồm tất cả các loại enzyme xúc tác quá trình
chuyển hóa của tế bào và lúc nào cũng có trong tế bào
• Enzyme cảm ứng (inductive enzymes) bình thường có lượng
rất ít, không đáng kể, chúng sẽ được tăng lên nhanh chóng khi
đưa vào môi trường chất xác định.
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

9

Hiện tượng cảm ứng (induction)
• Là hiện tượng làm tăng lượng enzyme của tế bào (ngược lại
với hiện tượng trấn áp).
• Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, có những
enzyme bình thường chỉ được tổng hợp rất ít ỏi nhưng khi thêm
một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy thì hàm lượng
của chúng có thể tăng lên rất nhiều lần. Monod và Cohn (1925)
gọi các enzyme này là enzyme cảm ứng, chất gây nên hiệu quả
này là gọi là chất cảm ứng.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

10

5


4/9/2019

Hiện tượng cảm ứng
• Các enzyme cảm ứng thường là những enzyme xúc tác cho
quá trình phân giải như: protease, amylase, pectinase,
penixilinase, β-galactosidase ở tế bào E. coli.
• Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền.
• Sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

11

Hiện tượng trấn áp (ức chế )- repression
• Là hiện tượng làm giảm quá trình sinh tổng hợp do sản phẩm
cuối cùng của quá trình nuôi cấy.
• Hiện tượng này thường gặp đối với các enzyme xúc tác quá
trình sinh tổng hợp một chiều như: quá trình sinh tổng hợp axit
amin, nucleotit.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

12

6


4/9/2019

Ví dụ về cơ chế trấn áp

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

13

Cơ chế hiện tượng cảm ứng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

14

7


4/9/2019

Cơ chế hiện tượng cảm ứng
Có chất cảm ứng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

15

Cơ chế hiện tượng kìm hãm

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

16

8


4/9/2019

Điều hoà tương tác giữa RNA - polymerase với promotor
• AMPv (AMP vòng) có tác
dụng kích thích đối với quá
trình sao chép mã của các
operon phân giải nhờ một
protein đặc biệt làm trung
gian gọi là protein nhận
AMPv, hay còn gọi là protein
hoạt hoá phân giải CAP
(catabolite activator protein).

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

17

Điều hoà tương tác giữa RNA - polymerase với promotor
• Khi AMPv kết hợp với CAP
tạo thành phức hợp có tác

dụng hoạt hoá promotor làm
cho RNA - polymerase dễ
dàng kết hợp với nó để bắt
đầu quá trình sao chép mã.
 AMPv có tác dụng làm tăng
cường quá trình sao chép

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

18

9


4/9/2019

Kết luận
Trong tế bào có những cơ chế điều chỉnh rất phức tạp và rất có
hiệu quả, đảm bảo cho sự liên hệ thông tin chặt chẽ giữa bộ máy
di truyền của tế bào và các quá trình chuyển hóa vật chất trong
tế bào.

Nhờ các cơ chế này mà nồng độ nội bào của các phân tử nhỏ có
thể kiểm tra sự tổng hợp các phân tử enzyme.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

19

Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme

Để thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa đó, VSV phải tổng
hợp các enzyme tương ứng.
• Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực
hiện các hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bào.
• Các enzyme dị hóa được tổng hợp trong tế bào nhưng có thể
hoạt động trong tế bào (enzyme ngoại bào – exoenzyme) hoặc
ngoài tế bào (enzyme dị bào – endoenzyme).

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

20

10


4/9/2019

Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme
• Theo nghĩa rộng, enzyme nội bào còn bao gồm cả các loại
enzyme tham gia tổng hợp, enzyme tham gia phản ứng oxy
hóa và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất trong tế bào.
• Phần lớn những enzyme ngoại bào thuộc enzyme cảm ứng. Do
đó, việc điều khiển sinh tổng hợp enzyme này ta áp dụng quy
luật cảm ứng sẽ thu được những kết quả như mong muốn

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

21

Nguyên lý điều khiển quá trình kỹ thuật sản xuất enzyme trong

quy mô công nghiệp
• Điều khiển genotype

• Điều khiển biểu hiện phenotype

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

22

11


4/9/2019

Sản xuất chế phẩm enzyme từ VSV
1. Điều hoà quá trình sinh tổng hợp enzyme trong môi trường
nuôi cấy VSV
2. Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt
lực cao
3. Phương pháp bảo quản giống VSV
4. Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme
5. Các phương pháp nuôi cấy VSV
6. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme

Phân lập
• Trong điều kiện tự nhiên: môi trường khắc nghiệt nhất, tồn
tại giống có hoạt tính cao.
• Trong điều kiện sản xuất.
• Trong mẫu đã hư hỏng.

12


4/9/2019

Đặc điểm chủng được phân lập trong tự nhiên
• Không có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme thật sự mạnh
• Cần có thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp.
• tập trung ở vùng môi trường có chứa nhiều cơ chất tương ứng.
• Trong quá trình sinh sản và phát triển, VSV tự nhiên luôn xảy ra
thường biến và đột biến. Những đột biến có lợi thường tồn tại bền
vững nên việc tìm kiếm các đột biến kiểu này rất có ý nghĩa.
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

25

Đặc điểm giống phân lập trong điều kiện sản xuất
• Đã thích nghi với điều kiện sản xuất không cần phải qua giai
đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
• Có đặc điểm sinh hóa cao hơn các chủng hoang dại.
• Mật độ tế bào VSV có trong điều kiện sản xuất thường rất cao.
Do đó khả năng thu nhận được các chủng có khả năng sinh
tổng hợp enzyme cao thường rất cao.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

26

13

4/9/2019

Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống
• Phương pháp gây đột biến: dùng tác nhân vật lý hay hóa học để
tác động lên tế bào VSV.
• Phương pháp biến nạp: biến đổi tính trạng di truyền của VSV dưới
ảnh hưởng của DNA trong dịch chiết nhận từ tế bào của VSV khác.
• Phương pháp tiếp hợp gene: Vật liệu di truyền chuyển từ tế bào
cho sang tế bào nhận khi 2 tế bào tiếp xúc với nhau.
• Phương pháp tải nạp: Vật liệu di truyền chuyển từ tế bào cho sang
tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể.
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

27

Phương pháp bảo quản giống
• Cấy chuyền: vi khuẩn, nấm men (1-3 tuần)
• Làm khô: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp (<5%), VSV có
bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong một
thời gian dài. Phương pháp này chỉ có hiệu quả đối với VSV có khả
năng sinh bào tử
• Đông khô: (giảm đến giới hạn ngưng phát triển vsv)-10 năm, đắt tiền
• Làm lạnh đông trong nitơ lỏng
Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

28

14

4/9/2019

Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme
• Nguồn Cacbon
• Nguồn Nito

• Nguồn khoáng và vi lượng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

29

Các loại môi trường nuôi cấy
MT TỔNG HỢP

MT TỰ NHIÊN

Là môi trường gồm các chất với liều lượng
xác định (qua tìm hiểu, nghiên cứu).

Dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các nguồn C, N,
khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng.

Loại môi trường này được sử dụng cho mục
đích nghiên cứu

Các nguyên liệu này lại có sẵn, rẻ tiền được sử dụng rất nhiều trong
công nghiệp sản xuất

Tinh bột, cellulose, đường, axit, rượu, nguồn
Nitơ vô cơ hoặc hữu cơ (axit amin,
peptin...).

Cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô
dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân huỷ nấm men bia, trấu, lõi
ngô (để làm chất độn, tạo xốp)

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

30

15


4/9/2019

Các phương pháp nuôi cấy VSV
• Nuôi cấy bề mặt
• Nuôi cấy chìm

• Nuôi cấy chìm hai bước

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

31

Phương pháp nuôi cấy bề mặt
 Thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm

 Dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột ngô, mảnh hạt bo bo
có chất phụ gia là trấu
 Bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ, photpho, nitơ hữu cơ và các
chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc
bã rượu

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

32

16


4/9/2019

Quy trình công nghệ
Nguyên liệu
Kiểm tra, định lượng
Phối trộn
Thanh trùng bằng nhiệt
Làm nguội, làm tơi
Gieo giống VSV

Nuôi cấy giống

Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy
Nuôi cấy, theo dõi, xử lý

Làm ẩm môi trường
• Hàm ẩm tối ưu (cám) là 58-60%.

• Quá ẩm sẽ bị dính bết, dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp.
• Để làm ẩm:
- dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng
- làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng để
điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu.

17


4/9/2019

Thanh trùng bằng hơi nhiệt
Làm cho môi trường được tinh khiết hơn
về phương diện vsv và làm cho chín (biến
hình) môi trường (tinh bột, protein). Thông
thường người ta thanh trùng bằng hơi nước
trực tiếp ở nhiệt độ 120- 1300C trong 2-3h.

Làm nguội và làm tơi môi trường
Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy phải
làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào
các dụng cụ nuôi.
Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên
ngoài.
Nhiệt độ yêu cầu đạt được để gieo giống là 35-390C.

18

4/9/2019

Nuôi cấy nấm mốc giống
Tạo đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi
cấy. Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản
xuất lớn nhưng các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắc khe
hơn: nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện
nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài
hơn (gần gấp đôi) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều.

Quá trình nuôi cấy
(kéo dài 33-48h/mẻ gồm 3 giai đoạn)
• Giai đoạn 1 (Từ khi nuôi đến giờ nuôi thứ 10-12): trương nở bào tử và
xuất hiện cuống nấm, W = 55-60%, =96-100%, T=30-32oC.
• Giai đoạn 2 (kéo dài trong 10-18h): phát triển mạnh, dẫn đến hiện tượng kết
bánh. môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, T=38-40oC. Để khống chế
nhiệt độ thích hợp 28-30oC cần thông gió (quạt) và bão hoà ẩm không khí
phòng nuôi.
• Giai đoạn 3 (kéo dài trong 10-20h ): tạo ra enzyme nhiều nhất. Cường độ
trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt toả ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của
môi trường nuôi cấy cũng giảm theo.

19


4/9/2019

Phương pháp nuôi cấy chìm
►Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu
trong đa số trường hợp là tinh bột.

►Đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối.
►Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước (1pha) gồm: chuẩn
bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm mốc giống, nuôi cấy nấm mốc
sản xuất

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

40

20


4/9/2019

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Sau khi đã phối trộn đúng tỉ lệ các thành phần sẽ được khuấy
trộn kỹ rồi thanh trùng bằng hơi nhiệt (trực tiếp hay gián tiếp
bằng nồi 2 vỏ), nhiệt độ 118-125oC, thời gian 15-60 phút, sau đó
được làm nguội đến nhiệt độ 30oC thì tiến hành gieo cấy nấm mốc
giống vào.

21


4/9/2019

Nuôi cấy nấm mốc giống
• Ở cấp PTN: tiệt trùng môi trường làm nguội, cấy giống rồi nuôi trên
máy lắc (150-200 lần/phút), T=46-50h.
• Ở cấp phát triển giống trung gian: sục khí vô trùng với lưu lượng 1520m3/m3h, T= 36-40h, V dịch men giống = 10% V dịch men sản xuất

Nuôi cấy nấm mốc sản xuất
• Trong quá trình nuôi cấy cần phải sục khí vô trùng và khuấy trộn,
tiếp dầu phá bọt nếu có hiện tượng tạo bọt trào ra khỏi nồi lên
men.
• T =1-4 (ngày) tuỳ theo giống vi sinh vật.
• Khống chế pH, chế độ sục khí và bảo đảm vô trùng.
• Ví dụ: đối với enzyme α-amylaza thì pHopt của các loại vi khuẩn
là 7, của các loại nấm mốc là 5.6–5.7

22


4/9/2019

• Tác dụng của hệ thống thổi khí:
• Làm xáo trộn môi trường.
• Thúc đẩy VSV sinh sản và phát triển.
• Hạn chế những ảnh hưởng xấu của các chất khí được tạo ra trong quá
trình trao đổi chất.

• Tác dụng của hệ thống khuấy trộn
• làm các thành phần môi trường và tế bào VSV không bị lắng xuống, từ đó
làm tăng khả năng tổng hợp enzyme.
• làm tăng khả năng tan của oxy.
• làm tăng nhanh quá trình sinh sản sản vô tính do tác động cơ học

Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học
• V= 63 m3

• Thép kép có nắp hình nón
• Trên nắp: bộ khuấy đảo, nạp liệu, chất khử
bọt, nạp và thải không khí

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

46

23


4/9/2019

Phương pháp nuôi cấy chìm 2 bước
Vi sinh vật được nuôi trong thiết bị đầu tiên (pha thứ nhất – pha sinh
trưởng) để phát triển đến mức độ cần thiết, sau đó được chuyển sang
thiết bị lên men tiếp theo (pha thứ hai – pha tạo enzyme) có thành
phần khác với thiết bị đầu để sinh tổng hợp enzyme.

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

47

Sản xuất enzyme α - manozilostreptomixinase
• Phát minh quá trình lên men chất kháng sinh streptomixin bởi xạ khuẩn
Streptomyces griseus vào năm 1944 bởi Schatz, Bugie và Waksman
• Pha thứ nhất: Tế bào Streptomyces griseus được nuôi trong môi trường dinh
dưỡng có khuấy trộn và sục khí trong 17h ở nhiệt độ 280C để tạo nhiều bào tử. Sau
đó bào tử được rữa sạch và chuyển sang thiết bị tiếp theo.
• Pha thứ 2: Tiếp tục nuôi cấy để sinh tổng hợp enzyme α- manozilostreptomixinase

trong 18-24h. Lúc này tốc độ phát triển của vi khuẩn chậm lại, nhưng sự chuyển
hoá phức chất manozidosteptomixin nhanh chóng diễn ra dưới tác dụng của
enzyme thành kháng sinh streptomixin

24


4/9/2019

Bề mặt

Bề sâu

Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều
lần

Nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme
sẽ có giá thành cao

Chế phẩm dễ dàng sấy khô, dễ bảo quản,
vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực
tiếp
Tốn ít năng lượng thiết bị, dụng cụ nuôi cấy
đơn giản, có thể thực hiện ở qui mô gia
đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến
20T/ngày.

Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm
vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất
lớn

Điều kiện nuôi cấy không cần vô trùng
tuyệt đối, nếu có nhiễm trùng phần nào chỉ
cần loại bỏ canh trường phần đó.

Nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến và
lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều
kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn.

Năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động
Dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ
hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế
chức sản xuất tiết kiệm diện tích sản xuất.
phẩm ở các mẻ không đồng đều.

Tổng quan enzyme

50

25