BÀI TIỂU LUẬN DỊCH THUẬT VÀ TÌM HIỂU VỀ CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS9 VÀ CHẤT ỨC CHẾ PD1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA
***

BÀI TIỂU LUẬN
DỊCH THUẬT VÀ TÌM HIỂU VỀ CÔNG NGHỆ
CRISPR – CAS9 VÀ CHẤT ỨC CHẾ PD-1

Giảng viên hướng dẫn :
Nhóm SV thực hiện
:
Lớp

:14CHD

Đà Nẵng, tháng 11 năm 2017.


MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU..............................................................................................................2
Bài báo:......................................................................................................................... 4
Bài dịch......................................................................................................................... 7
1. Khái quát chung về công nghệ chỉnh sửa gen.....................................................9
1.1.

Chỉnh sửa bộ gen (GENOME EDITING)......................................................9

1.2.

Phân biệt chỉnh sửa gen và chuyển gen.........................................................9

1.3.

Mục đích chỉnh sửa gen..................................................................................9

1.4.

Bản chất của kỹ thuật chỉnh sửa gen...........................................................10

1.4.1.

Ghép nối không tương đồng (NHEJ).......................................................10

1.4.2.

Sự tái tổ hợp tương đồng (HR)................................................................11

1.5.

Các công nghệ chỉnh sửa gen.......................................................................12

1.5.1.

Công nghệ ZFNs......................................................................................12

1.5.2.

Công nghệ TALENs..................................................................................12

1.5.3.

Công nghệ CRISPR-Cas9........................................................................13

2. Các khái niệm, thuật ngữ và lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9.....13
2.1. Khái niệm và các thuật ngữ.............................................................................13
2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas....................................................14
2.2.1. Lịch sử ra đời của công nghệ chỉnh sửa gen................................................14
2.2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9...............................................14
3. Công nghệ CRISPR-Cas9, ưu - nhược điểm.....................................................14
3.1. Công nghệ CRISPR-Cas9................................................................................14
3.2. Ưu - nhược điểm...............................................................................................18
4. Cơ chế tác động của công nghệ CRISPR-Cas9.................................................19
4.1. Cơ chế hoạt động của CRISPR-Cas9...............................................................19
4.2. Cơ chế miễn dịch của CRISPR-Cas9...............................................................24
5. Ứng dụng và các thành tựu CRISPR-Cas9 đạt được:......................................26
6. Chất ức chế PD-1.................................................................................................31
6.1. Khái niệm..........................................................................................................31
6.2. Cấu trúc............................................................................................................31
6.3. Ý nghĩa lâm sàng..............................................................................................32
6.4. Ứng dụng..........................................................................................................33
KẾT LUẬN................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................36
2


LỜI NÓI ĐẦU
Ngày nay, với sự phát triển của công nghiệp và xã hội, các vấn nạn về bênh tật
do các vấn đề ô nhiễm môi trường gây ra ngày càng cao, một trong số đó là các căn
bệnh về ung thư. Theo thống kê gần nhất (4/2014) của tổ chức Y tế thế giới (WHO),
hiện nay số người bị nhiễm ung thư ngày càng cao và không ngừng gia tăng, cũng theo

thống kê này Việt Nam là quốc gia thuộc top 2 về những quốc gia dẫn đầu về tỉ lệ mắc
căn bệnh này.

Việc nghiêm cứu tìm ra phương pháp chống lại sự gia tăng và chữa khỏi của
căn bệnh quái ác này là một vấn đề vô cùng khó khăn đặt racho các nhà khoa học, các
viện nghiên cứu và vấn đề này thu hút rất lớn sự quan tâm từ các nhà khoa học. Một
nghiên cứu mới đây được đăng tải trên tạp chí Nature công bố một ứng dụng của công
nghệ CRISPR-Cas9 trong việc tìm kiếm các mục tiêu mới giúp nâng cao tính hiệu quả
(effectiveness) của chất ức chế PD-1 trong liệu pháp miễn dịch ung thư.Trong công
trình này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để tìm ra các gene
giúp tế bào ung thư “lẩn trốn” khỏi hệ miễn dịch của cơ thể. Qua đó, việc phá huỷ các
gene này sẽ giúp làm tăng hiệu quả của các chất ức chế PD-1.
Vậy công nghệ CRISPR-Cas9 là gì? Chất ức chế PD-1 là gì? Nó có những ưu
điểm và ứng dụng gì khiến nó thật đặc biệt đối với thế giới và các nhà khoa học? Bài
thuyết trình dịch thuật từ một bài báo của Nature sau đây sẽ giúp mọi người hiểu thêm
về công nghệ CRISPR-Cas9, chất ức chế PD-1 cũng như những ứng dụng quan trọng
mà công nghệ này mang lại.

3


Bài báo:

MAKING CANCER VULNERABLE TO IMMUNE
ATTACK
CRISPR-Cas9 is revealing new drug targets that could boost cancer immunotherapy
Anovel screening method developed by a team at Dana-Farber/Boston Children’s
Cancer and Blood Disorders Center — using CRISPR-Cas9 genome editing
technology to test the function of thousands of tumor genes in mice — has revealed
new drug targets that could potentially enhance the effectiveness of PD-1 checkpoint

inhibitors, a promising new class of cancer immunotherapy.
In findings published online today by Nature, the Dana-Farber/Boston Children’s team
— led by pediatric oncologist W. Nick Haining — reports that deletion of the Ptpn2
gene in tumor cells made them more susceptible to PD-1 checkpoint inhibitors. PD-1
blockade is a drug that “releases the brakes” on immune cells, enabling them to locate
and destroy cancer cells.
“PD-1 checkpoint inhibitors have transformed the treatment of many cancers, and
opened the door to the possibility that immunotherapy will form part of the cure for
cancer,” says Haining, senior author on the new paper, who is also associate professor
of pediatrics at Harvard Medical School and associate member of the Broad Institute
of MIT and Harvard.
Yet despite the clinical success of this new class of cancer therapy, the majority of
patients don’t reap a clinical benefit from PD-1 blockade. That, Haining says, has
triggered a rush of additional trials to investigate whether other drugs, when used in
combination with PD-1 inhibitors, can increase the number of patients whose cancer
responds to the treatment.
“The challenge so far has been finding the most effective immunotherapy targets and
prioritizing those that work best when combined with PD-1 inhibitors,” Haining says.
“So, we set out to develop a better system for identifying new drug targets that might
aid the body’s own immune system in its attack against cancer.
“Our work suggests that there’s a wide array of biological pathways that could be
targeted to make immunotherapy more successful,” Haining continues. “Many of these
are surprising pathways that we couldn’t have predicted. For instance, without this
screening approach, it wouldn’t have been obvious that Ptpn2 is a good drug target for
the immunotherapy of cancer.”
4


Sifting through thousands of potential targets
To cast a wide net, the paper’s first author Robert Manguso, a graduate student in

Haining’s lab, designed a genetic screening system to identify genes used by cancer
cells to evade immune attack. He used CRISPR-Cas9, a genome editing technology
that works like a pair of molecular scissors to cleave DNA at precise locations in the
genetic code, to systematically knock out 2,368 genes expressed by melanoma skin
cancer cells. Manguso was then able to identify which genes, when deleted, made the
cancer cells more susceptible to PD-1 blockade.
Manguso started by engineering the melanoma skin cancer cells so that they all
contained Cas9, the “cutting” enzyme that is part of the CRISPR editing system. Then,
using a virus as a delivery vehicle, he programmed each cell with a different “single
guide RNA” sequence of genetic code. In combination with the Cas9 enzyme, the
sgRNA codes — about 20 amino acids in length — enabled 2,368 different genes to be
eliminated.
By injecting the tumor cells into mice and treating them with PD-1 checkpoint
inhibitors, Manguso was then able to tally up which modified tumor cells survived.
Those that perished had been sensitized to PD-1 blockade as a result of their missing
gene.
Using this approach, Manguso and Haining first confirmed the role of two genes
already known to be immune “evaders” — PD-L1 and CD47, drug inhibitors that are
already in clinical trials. They then discovered a variety of new immune evaders that,
if inhibited therapeutically, could enhance PD-1 cancer immunotherapy. One such
newly-found gene of particular interest is Ptpn2.
“Ptpn2 usually puts the brakes on the immune signaling pathways that would
otherwise smother cancer cells,” Haining says. “Deleting Ptpn2 ramps up those
immune signaling pathways, making tumor cells grow slower and die more easily
under immune attack.”
Gaining more ground
With the new screening approach in hand, Haining’s team is quickly scaling up their
efforts to search for additional novel drug targets that could boost immunotherapy.
Haining says the team is expanding their approach to move from screening thousands
of genes at a time to eventually be able to screen the whole genome, and to move

beyond melanoma to colon, lung, renal carcinoma and more. He’s assembled a large
team of scientists spanning Dana-Farber/Boston Children’s and the Broad Institute to
tackle the technical challenges that accompany screening efforts on such a large scale.
5


In the meantime, while more new potential drug targets are likely around the corner,
Haining’s team is taking action based on their findings about Ptpn2.
“We’re thinking hard about what a Ptpn2 inhibitor would look like,” says Haining.
“It’s easy to imagine making a small molecule drug that turns off Ptpn2.

6


Bài dịch

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR-CAS9 TRONG
VIỆC TỐI ƯU HÓA LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH

Hình: Các tế bào T miễn dịch (màu đỏ) đang tiêu diệt các tế bào ung thư (nhiều màu
sắc) đã bị loại bỏ những gene giúp “lẩn trốn” khỏi hệ miễn dịch của cơ thể.
Một nghiên cứu mới đây được đăng tải trên tạp chí Nature công bố một ứng dụng của
công nghệ CRISPR-Cas9 trong việc tìm kiếm các mục tiêu mới giúp nâng cao tính
hiệu quả (effectiveness) của chất ức chế PD-1 trong liệu pháp miễn dịch ung thư.
Nghiên cứu do nhóm tác giả tại Trung Tâm Nghiên Cứu Ung Thư Trẻ Em và Bệnh Lý
Huyết Học Dana-Farber/Boston thực hiện. Trong công trình này, nhóm nghiên cứu đã
sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để tìm ra các gene giúp tế bào ung thư “lẩn trốn” khỏi
hệ miễn dịch của cơ thể. Qua đó, việc phá huỷ các gene này sẽ giúp làm tăng hiệu quả
của các chất ức chế PD1 (programmed cell death 1: thụ thể gây chết tế bào theo
chương trình). CRISPR-Cas9, viết tắt của thuật ngữ “Clustered regularly interspaced

short palindromic repeats,” là một kỹ thuật mới được phát triển gần đây để chỉnh sửa
bộ gene.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy chất ức chế PD-1 hứa hẹn những tiềm năng lớn trong
điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch (cancer immunotherapy). Tuy nhiên, ở nhiều
bệnh nhân, ứng chế PD-1 không hoàn toàn đem lại kết quả lâm sàng quan trọng. Do
đó, nhiều nhóm nghiên cứu tìm cách kết hợp các loại thuốc khác với chất ức chế PD-1.
Bài toán đặt ra là, làm thế nào để tìm thấy những mục tiêu (target) điều trị miễn dịch
hiệu quả nhất.
Để giải quyết vấn đề này, Robert Manguso và các cộng sự đã thiết kế một hệ thống
sàng lọc di truyền (genetic screening system) giúp xác định các gene được các tế bào
ung thư sử dụng để trốn tránh sự tấn công của hệ thống miễn dịch. Anh đã sử
7


dụng CRISPR-Cas9, công nghệ chỉnh sửa bộ gene, hoạt động giống như một cặp kéo
phân tử để cắt DNA tại các vị trí chính xác trong mã di truyền, để loại bỏ được 2.368
gen biểu hiện bởi các tế bào ung thư hắc tố (melanoma skin cancer cell). Tiếp theo,
Manguso xác định gene nào, khi bị xóa, làm cho các tế bào ung thư nhạy cảm hơn với
thuốc ức chế PD-1. Các tế bào ung thư hắc tố này được tiêm vào chuột rồi được điều
trị với thuốc ức chế PD-1. kết quả cho thấy các tế bào ung thư bị loại bỏ đi các gene kể
trên thực sự nhạy cảm hơn với thuốc ức chế PD-1 và bị tiêu diệt.
Nghiên cứu cũng đồng thời xác nhận được vai trò của 2 gene giúp các tế bào ung thư
“lẫn trốn” khỏi hệ miễn dịch mà con người đã biết, đó là PD-L1 và CD47. Đồng thời,
nhóm nghiên cứu cũng tìm ra nhiều gene mới với chức năng tương tự, một trong số đó
là gene Ptpn2. Loại bỏ gene Ptpn2 sẽ làm tế bào ung thư phát triển chậm hơn và dễ bị
các tế bào miễn dịch tiêu diệt hơn.
Từ các kết quả này, giáo sư W.Nick Haining và nhóm nghiên cứu sẽ cải tiến phương
pháp để có thể sàng lọc không chỉ hàng ngàn gene cùng một lúc mà là cả bộ gene. Hơn
nữa, nhóm sẽ mở rộng sang các loại tế bào ung thư khác như ruột kết, phổi, và thận.
Đồng thời, nhóm nghiên cứu cũng sẽ tập trung phát triển một loại thuốc mới có khả

năng ức chế gene Ptpn2.

8


1. Khái quát chung về công nghệ chỉnh sửa gen
1.1. Chỉnh sửa bộ gen (GENOME EDITING)
Là một kỹ thuật được sử dụng để sửa đổi một cách chính xác và hiệu quả DNA
trong một tế bào. Nó bao gồm việc cắt giảm các trình tự ADN cụ thể với enzyme được
gọi là 'nucleases kỹ thuật'. Có thể được sử dụng để thêm, xoá, hoặc sửa đổi DNA
trong bộ gen
1.2. Phân biệt chỉnh sửa gen và chuyển gen
Chỉnh sửa gen(Genome editing)
Chuyển gen (Gene transformation)
Tạo ra những thay đổi trên trình tự gen Đưa DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào
nội sinh theo cách có chủ đích, tại một vị chủ theo cách ngẫu nhiên, không có vị trí
trí xác định (non-GMO)
xác định (GMO)
 GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, khi nói đến
GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật mang các gen của một loài khác
để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên
1.3. Mục đích chỉnh sửa gen
- Tạo đột biến gen:
 Là tạo những biến đổi nhỏ xảy ra trong cấu trúc gen. Những biến đổi này
thường liên quan đến 1 cặp nucleotit ( đột biến điểm) hoặc 1 số cặp nucleotit.
 Các dạng đột biến: Mất, thêm và thay thế
Bằng cách tạo đột biến gen có thể:

Tạo SNP (single nucleotide polymorphisms) có nghĩa là các dạng đa hình của
nucleotid đơn, được sử dụng để phân tích gen người và cho nhiều sinh vật khác nhờ

một đột biến điểm trên gen.
Ví dụ: Một đột biến điểm thay thế cặp nucleotit G-C bằng cặp A-T hoặc ngược
lại sẽ tạo ra một SNP
9



Kiểm
soát
biểu
hiện
của gen:
Sự
biến đổi
cấu
trúc
phân
tử của
gen
có thể
dẫn
đến biến
đổi
cấu trúc
của
loại
prote
inmà nó
mã
hóa,

cuối
cùng có
thể
dẫn đến
biến
đổi
ở
kiểu hình. Các đột biến gen biểu hiện ra kiểu hình ở từng cá thể riêng lẻ, không tương
ứng với điều kiện sống
 Tạo sản phẩm dung hợp với protein nội sinh.
1.4. Bản chất của kỹ thuật chỉnh sửa gen
Chỉnh sửa gen là một loại kỹ thuật di truyền, trong đó sử dụng một loại
enzyme “engineered nucleases” để cắt DNA tạo ra sự phá vỡ sợi đôi ( double-strand
breaks) (DSBs) của DNA cụ thể tại các vị trí mong muốn trong bộ gen.

Các sợi đôi này được sửa chữa thông qua sự ghép nối không tương đồng
(Non-homologous end joining) (NHEJ) hoặc tái tổ hợp tương đồng (Homologous
recombination) (HR), dẫn đến các đột biến có mục tiêu
NHEJ sử dụng một loạt các enzyme để trực tiếp kết nối DNA kết thúc trong
một đứt gãy sợi đôi. Ngược lại, trong HR, một trình tự DNA tương đồng được sử dụng
như một khuôn mẫu để tái tạo chuỗi DNA bị mất ở điểm dừng.
1.4.1. Ghép nối không tương đồng (NHEJ)
Là một con đường để sửa chữa sự phá vỡ sợi đôi trong DNA. NHEJ được gọi
là "không đồng nhất" bởi vì các đầu ngắt được trực tiếp ghép nối lại mà không cần một
mẫu tương đồng làm khuôn mẫu.
10


NHEJ thường sử dụng các trình tự DNA ngắn gọi là microhomologies và các
enzyme để sửa chữa. Những microhomologies hiện diện ở đầu của các sợi đơn trong

đứt gãy sợi đôi. Khi phần nhô ra hoàn toàn tương thích, tiến hành sửa chữa DNA. Nếu
phần nhô ra không tương thích có thể xảy ra mất hoặc thêm nucleotide dẫn đến việc
sủa chữa không chính xác.
1.4.2. Sự tái tổ hợp tương đồng (HR)
Là một loại tái tổ hợp di truyền, trong đó các trình tự nucleotide được trao đổi
giữa hai phân tử tương tự hoặc giống hệt nhau của DNA.
Sau khi phá vỡ sợi dây đôi, các đoạn DNA xung quanh đầu 5’ của sợi đơn
trong liên kết kết đôi DNA bị phá vỡ được cắt bỏ. Trong bước tiếp theo, một đoạn cuối
đầu 3’ của phân tử DNA tách ra sau đó "xâm nhập" một phân tử DNA tương đồng.
Sau cuộc “xâm lược” trên, tiến hành sửa chữa DNA. Sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra
trong quá trình sửa chữa DNA có xu hướng dẫn đến các sản phẩm không chéo, có hiệu
lực khôi phục lại phân tử DNA bị hư hỏng như trước khi bị phá vỡ.

NHEJ có thể dễ bị lỗi, và đã được chứng minh là gây ra đột biến ở khu vực
sửa chữa trong khoảng 50%. Vì vậy, nếu người ta có thể tạo ra một DSB ở một gen
mong muốn trong nhiều mẫu, rất có thể các đột biến sẽ được tạo ra tại nhiều mẫu do
lỗi của NHEJ. Mặt khác, sự phụ thuộc của HR vào một trình tự tương đồng để sửa
chữa DSB có thể được khai thác bằng cách chèn thêm một dãy mong muốn trong một
dãy DNA tương đồng để tạo ra sự thay đổi mong muốn trong vùng gen quan tâm.

11


1.5.

Các công nghệ chỉnh sửa gen
Có nhiều loại khác nhau của enzyme“engineered nucleases”được sử dụng
trong chỉnh sửa bộ gen.Tất cả chúng đều chứa một phần nuclease để cắt DNA và một
phần xác định DNA để nhận dạng chuỗi DNA chúng cắt.Chúng khác nhau chủ yếu
trong cách nhận ra DNA để cắt:

Dựa vào RNA: chứa một đoạn ngắn của RNA liên kết với DNA mục tiêu sẽ
được cắt.
Dựa vào Protein: chứa một protein nhận ra và liên kết với các DNA mục tiêu
sẽ được cắt.
1.5.1. Công nghệ ZFNs
ZFNs là viết tắt của 'zinc-finger nucleases'. Phần gắn kết với DNA của ZFNs
được tạo ra từ các protein zinc-finger, mỗi zinc-finger liên kết với 3 nucleotid. Sự kết
hợp khác nhau của protein zinc-finger gắn kết với các chuỗi DNA khác nhau. Phần
nuclease của ZFNs thường là Fokl Nuclease-enzyme dùng để cắt DNA. Hai phân tử
Fokl bắt cặp với nhau để cùng tạo ra việc phá vỡ liên kết đôi trên DNA, do đó một cặp
ZFN được tạo ra, mỗi phân tử liên kết với một sợi DNA.

1.5.2. Công nghệ TALENs
TALENs là viết tắt của'Transcription activator-like effector nucleases'.
Miền liên kết với DNA của TALENs được tạo thành từ sự phiên mã các chất hoạt hóanhư cơ quan phản ứng lại kích thích (TALE). Có bốn miền TALE khác nha tương ứng
với bốn nucleotid, vì vậy chúng có thể được sắp xếp để liên kết với các trình tự DNA
cụ thể dễ dàng hơn ZFNs. Giống như ZFNs, phần nuclease của TALENs thường là
Fokl Nuclease. Hai phân tử FokI kết hợp với nhau để cắt DNA, do đó hai TALEN
được tạo ra, một cho mỗi sợi

12


1.5.3. Công nghệ CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 là công nghệ phổ biến và hiệu quả nhất được sử dụng để chỉnh
sửa bộ gen.
CRISPR là viết tắt của cụm từ "clustered regularly interspaced short
palindromic repeats".CRISPR là phần xác định DNA đích của hệ thống bao gồm một
phần tử RNA ‘hướng dẫn’, được thiết kế để liên kết với các nucleotid cụ thể thông qua
liên kết bổ sung. Cas9 là viết tắt của ‘CRISPR-associated protein 9’, và là một phần

của nuclease có tác dụng cắt DNA.
Hệ thống CRISPR-Cas9 ban đầu được phát hiện trong vi khuẩn, chúng sử
dụng hệ thống này để tiêu diệt các virut xâm nhập.

2. Các khái niệm, thuật ngữ và lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9
2.1. Khái niệm và các thuật ngữ
 CRIPS:
CRISPR là viết tắt của Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats, là các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên hay cụm đoạn lặp xuôi ngược
ngắn phân cách đều. Trong sự lặp lại của palindromic, trình tự nucleotide đều giống
nhau ở cả hai hướng.
CRISPR thường được tìm thấy trong hệ gen của vi khuẩn và các sinh vật khác.
RNA được mã hóa từ CRISPR cùng với các enzyme thuộc họ.
 Cas 9:
Cas 9: là từ viết tắt của CRIPS-associated ([yếu tố] đi kèm với CRISPR),
Protein Cas9 là một enzyme làm cắt DNA ngoại lai.
Protein này thường liên kết với hai phân tử RNA: crRNA và một loại khác gọi
là tracrRNA (hoặc "trans-activation crRNA"). Cả hai hướng dẫn Cas9 đến vị trí mục
tiêu nơi nó sẽ được cắt. Sự mở rộng của DNA này bổ sung cho một đoạn dài 20
nucleotide của crRNA. Cas có vai trò như là hàng rào miễn dịch của tế bào chủ đối với
virut.
 CRISPR/ CAS9
Là kỹ thuật cho phép bạn tạo đột biến, cắt, tăng, điều chỉnh gen và đột biến bất kì
gen nào trong bất kì tế bào nào.
 ncRNA: non-conding RNA, là các RNA không mã hóa protein.
 PD1:
13


Là từ viết tắt của Programmed cell death protein. Là thụ thể bề mặt tế bào đóng

một vai trò quan trọng trong việc điều hoà hệ thống miễn dịch và thúc đẩy khả năng tự
chịu đựng bằng cách ngăn chặn hoạt động viêm tế bào T. PD-1 là một trạm kiểm soát
miễn dịch và bảo vệ chống lại tự miễn nhiễm thông qua cơ chế kép để thúc đẩy quá
trình tự chết (apoptosis) trong tế bào T đặc hiệu kháng nguyên trong các hạch bạch
huyết đồng thời giảm apoptosis trong các tế bào T điều tiết.

Gen PTPN2 là từ viết tắt của Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type
2, là một gen mã hóa ptrotein. Protein mã hoá bởi gen này là một thành viên của họ
protein tyrosine phosphatase (PTP). Các thành viên của họ PTP có cùng một xúc tác
có tính bảo thủ cao, điều này rất cần thiết cho hoạt động xúc tác. Các PTP được biết
đến là các phân tử tín hiệu điều chỉnh nhiều quá trình di động bao gồm sự tăng trưởng
tế bào, sự phân biệt, chu kỳ phân bào và sự chuyển đổi gen.

Gen CD47:là từ viết tắt của Cluster of Differentiation 47. Gen này mã hóa một
protein màng, nó liên quan đến sự gia tăng nồng độ canxi nội bào xảy ra khi sự kết
dính tế bào với ma trận ngoại bào. Protein mã hóa cũng là một thụ thể cho miền gắn
kết tế bào C của thrombospondin, và nó có thể đóng một vai trò trong vận chuyển
màng tế bào và truyền dẫn tín hiệu. Giống này có sự phân bố của mô rộng và giảm
biểu hiện hồng cầu hồng.
2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas
2.2.1. Lịch sử ra đời của công nghệ chỉnh sửa gen
- Năm 1989 Chỉnh sửa gen HR
- Năm 1992 Công nghệ Cr-Lox ra đời
- Năm 1998 Phát hiện protein ZF nhận biết DNA đặc hiệu
- Năm 2000 Phát hiện cơ chế phòng vệ CRISPR-Cas 9
- Năm 2009 Phát hiện cơ chế hoạt động của TAL effector
- Năm 2011 Tạp chí Nature bình chọn TALEN là phương pháp của năm
- Năm 2013 Công nghệ CRISPR-Cas9
2.2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9
Năm 1985-1986: Oliver Smithies và Mario Capecchi cùng lúc sử dụng tái tổ

hợp tương đồng để thay đổi trình tự DNA trên tế bào của động vật có vú.
Năm1987: Capecchi và Smithies kết hợp tái tổ hợp tương đồng với vector đích
để chỉnh sủa gen trên tế bào gốc từ phôi ở chuột.
Năm1990: Công bố rộng rãi trình tự gen chuột
Năm1991: Các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc tinh thể zinc finger tạo
nên một thời kì ZFNs- một công cụ chỉnh sửa gen
Năm1994: Maria Jasin chứng minh các đứt gãy mạch đôi giúp tăng cao tỷ lệ tái
tổ hợp tương đồng
Năm2010: TALEs với khả năng định hướng các nuclease tạo ra đứt gãy mạch
đôi ở vị trí mong muốn.
Năm2012: CRISPR với khả năng tạo ra các đứt gãy mạch đôi ở protein Cas9
Năm2014: Sangamo Biosciences sử dụng ZFNs để chỉnh sửa gen CCRS trên tế
bào T ở bệnh nhân HIV.
Năm2016: Bệnh nhân đầu tiên sử dụng điều trị lâm sàng bằng CRISPR.
3. Công nghệ CRISPR-Cas9, ưu - nhược điểm
3.1. Công nghệ CRISPR-Cas9

14


CRISPR được phát hiện vào năm 1987 trong vi khuẩn E. coli. Sự ra đời của hệ
thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã khắc phục được những hạn chế của ZFN và
TALEN, tạo nên cuộc cách mạng đột phá trong công nghệ sinh học.
Về bản chất, CRISPR là một phần hệ thống miễn dịch của vi khuẩn chống lại
virus xâm nhiễm. Hệ thống này đã được ứng dụng trên các tế bào nhân thực. Tính đặc
hiệu được điều khiển bởi “guide ARN” (thường gắn với một đoạn trình tự 18-20 cặp
base trên ADN mục tiêu) và có thêm một số motifs giúp hình thành một phức hợp với
Cas9 nuclease (CRISPR – associated nuclease). Để có thể gắn thành công Cas9, trong
trình tự bộ gen đích phải có một đoạn trình tự protospacer adjacent motif (PAM) ngay
sau trình tự đích. PAM là một motif NGG liền kề vị trí liên kết. Đối lập với ZFN và

TALEN, hệ thống CRISPR giúp nuclease (enzyme cắt – Cas9) nhận biết trình tự cắt
thông qua “guide ARN”. Đặc tính này giúp ta dễ dàng thiết kế một “guide ARN” mới
khi cần cắt một trình tự mục tiêu mới và cũng cho phép cắt nhiều mục tiêu cùng lúc
(khi kết hợp nhiều “guide ARN”).
Hệ thống CRISPR sử dụng RNA ngắn, được gọi là CRISPR RNAs (crRNAs),
nhằm mục tiêu một phức hợp endonuclease hoặc endonuclease với các axit nucleic
xâm nhập mà một prokaryote trước đây đã gặp phải. Một khi một mảnh DNA nước
ngoài đã được công nhận, nó sẽ bị phá hủy.
Các hệ thống CRISPR được xác định cho đến ngày nay được chia thành ba lớp,
loại I, II, và III. Tất cả các hệ thống CRISPR bao gồm một locus CRISPR, mang thông
tin về các bệnh nhiễm trùng trong quá khứ, và các gien cas , mã hoá các protein trung
hòa miễn dịch dựa trên CRISPR. Các locus CRISPR, bất kể loại, bao gồm các chuỗi
palindromic ngắn (~ 30nt) bên cạnh các chuỗi spacer có kích thước tương tự có nguồn
gốc từ các axit nucleic xâm nhập. Mặc dù các gien cas thường gắn với locus CRISPR,
trong một số trường hợp nó được tìm thấy ở những nơi khác trong bộ gen.
Tất cả các hệ thống CRISPR chia sẻ cùng ba bước :
Khả năng thích nghi - kết hợp các chuỗi spacer mới với trung gian bởi Cas1 và Cas2
Biểu hiện - sao chép các chuỗi lặp lặp lại lặp lại lặp lại vào các RNA tiền CRISPR
(pre-crRNA) sau đó xử lý các trình tự này thành các crRNA trưởng thành bằng các loại
protein Cas cụ thể
15


Sự can thiệp -nhận dạng qua trung gian crRNA và tiêu hủy các axit nucleic xâm
chiếm

16


 Cấu trúc của CRISPR trong genome vi khuẩn

Nghiên cứu cho thấy tổ chức của CRISPR trong genome vi khuẩn rất đa dạng.
Một locus (vị trí) CRISPR cấu thành từ các đoạn lặp (repeats) dài 21 đến 48 bp xen kẽ
bởi các trình tự dài 26 đến 72 bp gọi là các đoạn đệm (spacers). Trong một locus thì
kích thước của đoạn lặp và đoạn đệm rất ổn định. Mỗi locus CRISPR được đặc trưng
bởi trình tự của đoạn lặp điển hình trong locus đó. Một locus CRISPR chỉ chứa các
đoạn lặp và các đoạn đệm, không có khung đọc mở (open reading frame).
Đặc điểm thường thấy
Các đoạn lặp (Repeats)
Các đoạn đệm (Spacers)
4. Có từ 2 – 375 đoạn lặp trong mỗi 7. Có từ 1 – 374 đoạn đệm trong mỗi
vùng (locus)
locus
5. Trình tự lặp ít biến đổi
8. Trình tự biến đổi
6. Đoạn lặp dài từ 21 - 48 bp (base 9. Đoạn đệm dài từ 26 – 72 bp (base
pair)
pair)
Thường thì trong một locus CRISPR, trình tự đoạn lặp rất bảo thủ. Hầu hết các
đoạn lặp có tính palindromic một phần (nghĩa là một phần trình tự xuôi và ngược
giống nhau), dẫn đến khả năng hình thành nên cấu trúc thứ cấp ổn định, bảo thủ cao.
CRISPR thường nằm trong nhiễm sắc thể, nhưng cũng có trường hợp nằm trong
plasmid.

17


Có thể có nhiều locus CRISPR trong hệ gene của sinh vật prokaryote. Số lượng
lớn nhất phát hiện được cho tới nay là 20 locus CRISPR trong hệ gene
của Methanococcus jannaschii. Các đoạn lặp và đệm trong CRISPR có thể chiếm tới

1% tổng trình tự toàn hệ gene của vi khuẩn. Có nhiều suy đoán về vai trò của CRISPR
như vai trò trong tái sắp xếp nhiễm sắc thể, điều hòa biểu hiện của các gene lân cận,
sửa chữa DNA… Năm 2005, ba nghiên cứu độc lập cho thấy sự tương đồng giữa trình
tự của các đoạn đệm (spacers) với các yếu tố ngoại nhiễm sắc thể như plasmid và
virus. Điều này dẫn tới giả thuyết rằng CRISPR có thể đóng vai trò miễn dịch thích
nghi (adaptive immunity) chống lại các yếu tố di truyền ngoại lai.
3.2. Ưu - nhược điểm

18



Ưu điểm: để nêu lên ưu điểm nổi bật của CRISPR-Cas9 ta có thể xem xét nó
với 2 công nghệ ZFNs và công nghệ TALENs qua bảng so sánh dưới đây.

ZFNs

TALENs

CRISPR-Cas9

 Trình tự DNA đích:  Trình tự DNA đích:  Trìnhtự DNA đích: 20
18 – 24 Nucleotid
24 – 59 Nucleotid
– 22 Nucleotid
 1 khu vực ZF nhận  1 khu vực TALE nhận  Liên kết bổ sung
biết 3 Nucleotid
biết 1 Nucleotid
giữaRNA-DNA
 Cắt 1 điểm trên DNA  Cắt 1 điểm trên DNA  Có thể cắt đồng thời

sợi đôi
sợi đôi
nhiều vị trí
 Thiết kế cấu trúc rất  Thiết kế cấu trúc  Thiết kế cấu trúc đơn
phức tạp
phức tạp
giản
Từ bảng so sanh phía trên ta có thể rút ra được nhưng ưu điểm nổi bật của
CRISPR-Cas9 như sau:
 Là công cụ đơn giản, đặc hiệu.
 Không đòi hỏi các thí nghiệm protein tái tổ hợp phức tạp.
 Tính đặc hiệu được quyết định bởi 20 Nu -> tổng hợp đơn giản.
 Có thể chỉnh sửa đồng thời nhiều vị trí cùng lúc.
 Có thể cắt được DNA bị methyl hoá.
 Công nghệ CRISPR có chính sách mở trong giới khoa học.
 Nhược điểm:
 Công cụ CRISPR tuy khá chính xác, nhưng đôi khi nó cũng cắt sai các phần của
DNA. Và điều này sẽ gây ra hậu quả tai hại.
 Các nhà khoa học đang bày tỏ sự lo lắng về tương lai của loài người khi những
thí nghiệm biến đổi di truyền đang ngày càng bị áp dụng rộng rãi vô tội vạ. Và có thể
trở thành vũ khí sinh học nếu rơi vào các tổ chức xấu.
 Khi sử dụng CRISPR-Cas9 để loại bỏ HIV từ tế bào bạch cầu, các nhà khoa học
đã phát hiện ra vẫn có những virus trốn thoát, và thậm chí các đột biến bởi CRISPRCas9 còn khiến chúng mạnh hơn.
 Những chỉnh sửa gen chúng ta mong đợi đều gặp phải sự cạnh tranh từ các đột
biến thêm hay mất ngẫu nhiên thông qua cơ chế nối không tương đồng ở hai đầu cắt.
 Bóc tách gen ở nhầm chỗ và có thể gây ung thư.
 Phương pháp ZFN và TALEN có tính đắc hiệu cao hơn so với CRISPR và do
đó rủi ro gắn không đúng trình tự sẽ thấp hơn.Nguyên nhân đầu tiên là do các phương
pháp kia nhận biết trình tự ADN dài hơn và cần phải có 2 phân tử protein kết hợp với
nhau mới tạo thành nuclease có hoạt tính (dạng dimer). Để khắc phục điều này, một

vài nhà nghiên cứu đã biến đổi CRISPR/Cas9 nuclease thành một “nickase” có thể
được sử dụng cùng với các cặp gARNs sense và antisense, do đó giúp tăng cường độ
đặc hiệu.
 Việc sử dụng một enzyme Cas9 sẽ chỉ cắt một sợi đơn của DNA mục tiêu thay
vì sợi đôi. Điều này có nghĩa là hai enzyme Cas9 và hai RNA hướng dẫn phải ở cùng
19


một vị trí để cắt được thực hiện. Vì vậy làm giảm xác suất cắt được thực hiện ở nơi
không đúng.
 Để chỉnh sửa gen thành công cần phải chuyển đồng thời với nhiều vật liệu (như
plasmid, mARNs hoặc oligonucleotide). Việc biến nạp đồng thời khó thực hiện đối với
một số dòng tế bào như: primary T, tế bào gốc phôi người (hESCs) hoặc các tế bào gốc
đa năng (iPSCs).
4. Cơ chế tác động của công nghệ CRISPR-Cas9
4.1. Cơ chế hoạt động của CRISPR-Cas9
Crispr Cas9 là một công nghệ được các nhà nghiên cứu di truyền học sử dụng
để thay đổi cấu trúc gen bằng cách cắt, loại bỏ hay sửa chữa các thành phần của dãy
DNA.
Crispr Cas9 gồm hai thành phần chính:
Một phần hệ thống Crispr là một loại protein được gọi là Cas9. Nó như là một
cặp kéo phân tử có khả năng tìm kiếm, cắt bỏ và cuối cùng là làm rã DNA của virus
theo một cách đặc biệt.
Những nucleotit của DNA được chèn vào NST vi khuẩn, tế bào liền tạo ra một
bản sao chép nhỏ của một phân tử gọi là RNA. Đó là một bản sao chép chính xác DNA
của virus, nó cho phép tương tác với các phân tử DNA theo một trình tự phù hợp. Trên
gRNA có sự hiện diện của trình tự PAM (Protospacer-Adjacent Motif), nó có vai trò
quan trọng trong việc nhận diện và gắn chuyên biệt của enzyme Cas9. Một PAM là
một trình tự gồm 3 nucleotit-NGG (trong đó N là một nucleotit bất kỳ) được gắn liền
kề sau trình tự bổ sung của gRNA.

20


RNA

Cas9

DNA
Khi một virus lây nhiễm tế bào, chúng tiêm DNA của chúng vào trong vi
khuẩn. Và trong một con vi khuẩn, hệ thống Crispr làm DNA đó bị loại ra khỏi virus
và chèn một số nucleotit vào NST của DNA vi khuẩn, và những nucleotit tích hợp
DNA của virus được chèn vào vị trí gọi là Crispr.
Sau đó, gRNA (là một sợi đơn tạo thành hình chữ T, có khoảng 20-22 nucleotit
với đầu 5’ là trình tự bổ sung với trình tự DNA) kết hợp với protein Cas9 hình thành
một số phức hợp, chạy dọc chiều dài đoạn gen trong tế bào để tìm ra vị trí trùng hợp
với chuỗi RNA mà nó liên kết, tức là liên kết các trình tự phù hợp với trình tự PAM
của nó. Khi chúng tìm được vị trí mà gRNA kết hợp được nó sẽ chèn vào giữa hai
mạch đơn của chuỗi xoắn kép, chia đôi nó ra và kích hoạt protein Cas9 cắt đứt DNA
virus một cách chính xác. Phức hợp Cas9 RNA như một cây kéo phân tử có thể cắt đứt
DNA, nó tạo ra một đoạn gãy hai đầu trong chuỗi xoán DNA. Và quan trọng phức hợp
này có khả năng lập trình nên nó có thể lập trình để phát hiện ra những chuỗi DNA đặc
biệt và bẻ gãy DNA tại điểm đó.

21


Sau khi DNA bị vỡ, Crispr tiến hành sửa chữa chúng bằng 2 cách:
1- Giữ các DNA và nối hai mảnh lại với nhau bằng vài thay đổi nhỏ trong chuỗi tại vị
trí đó. Cách này không hiệu quả vì có vài lúc một nucleotit sẽ bị rơi ra hay một

nucleotit mới được thêm vào, kiểu này như phá hủy cấu trúc gen.
2- Lấy một đoạn DNA tương đồng ở hai đầu nhưng phần giữa có thể sai khác (có thể
thêm bớt hoặc thay thế một hay một số nucleotit), từ đó có thể hình thành đoạn gen
mới. Cách này giúp chúng ta có thể lựa chọn được gen phù hợp với từng loại bệnh như
trong việc hiệu chỉnh các đột biến gây nên bệnh thiếu hồng cầu lưỡi liềm hay
bệnhHungtington.

22


Các hệ thống khác cần các protein Cas khác nhau cho bước xử lý crRNA và
bước cắt DNA. CRISPR-Cas9 khác biệt ở chỗ nó chỉ cần một protein Cas duy nhất là
Cas9.
Dựa trên cấu trúc tự nhiên của CRISPR-Cas9, các nhà nghiên cứu đã đơn giản
hóa hệ thống này bằng cách kết hợp tracrRNA và crRNA thành một RNA định hướng
duy nhất (single guide RNA – sgRNA). Cas9 định hướng bởi sgRNA được chứng
minh là hiệu quả tương đương với Cas9 định hướng bởi tracrRNA và crRNA riêng rẽ.
Để phục vụ cho mục đích chỉnh sửa gene, các thành phần không liên quan như leader
region, các gene cas có vai trò khác, và các đoạn lặp bị loại bỏ. Gene mã hóa cho
Cas9, RNA định hướng (sgRNA) chứa trình tự mục tiêu được kết hợp vào một plasmid
biểu hiện nhỏ. Khi chuyển các plasmid này vào tế bào mục tiêu, Cas9 cùng sgRNA
được biểu hiện đồng thời. Chúng kết hợp với nhau tạo thành một hệ thống CRISPRCas9 đơn giản mà hiệu quả, có thể tạo ra điểm đứt gãy trên DNA tế bào chủ tại vị trí
mong muốn.

Các hệ thống CRISPR tự nhiên và nhân tạo. Các bước xảy ra đối với

Hệ thống CRISPR tự nhiên: 1. Phiên mã tạo ra tiền crRNA và tracrRNA 2.
tracrRNA liên kết với crRNA 3. Tạo ra các RNA định hướng từ tiền crRNA 4. nuclease
Cas9 đang ở trạng thái bất hoạt gắn kết với RNA định hướng để trở thành Cas9 hoạt
hóa.


Hệ thống CRISPR nhân tạo: 1. Phiên mã nên RNA định hướng thành một sợi
duy nhất 2. Phiên mã và dịch mã tạo nên nuclease Cas9 3. RNA định hướng gắn với
Cas9 và hoạt hóa Cas9.

23


Điểm đứt gãy sợi kép trên DNA có thể được sửa chữa theo hai hướng: nonhomologous end-joining (NHEJ – nối đầu cuối không tương đồng) hoặc homologydirected repair (HDR – sửa chữa dựa theo sự tương đồng).
NHEJ thường dẫn tới các đột biến chèn hoặc xóa đoạn nhỏ, khiến cho gene mục
tiêu bị bất hoạt. Có thể xóa một đoạn gene tương đối lớn nếu dùng hai crRNA, và có
thể tạo ra sự chuyển vị hoặc đảo ngược nhiễm sắc thể nếu dùng crRNA định hướng tới
hai nhiễm sắc thể khác nhau.
Nếu có một đoạn DNA mẫu (template DNA, hay donor DNA) tương đồng với
vị trí mục tiêu thì DSB này có thể được sửa chữa bằng cơ chế HDR. Phần DNA ở
quanh vị trí đứt gãy sẽ được thay thế bằng phần DNA tương ứng ở DNA mẫu. Nếu một
đột biến được chủ ý đưa vào DNA mẫu thì đoạn DNA sau khi sửa chữa sẽ mang đột
biến đó.
Nhưng ngay cả khi có DNA mẫu thì nhiều khả năng là không chỉ cơ chế HDR,
mà cả NHEJ, cùng xảy ra, dẫn tới hiện tượng chèn/xóa đoạn không mong muốn. Một
biến thể của Cas9 là Cas9D10A giúp hạn chế điều này. Cas9D10A chỉ có khả năng cắt
DNA ở một sợi (chứ không phải ở cả hai sợi như Cas9 thông thường), do đó không
kích hoạt cơ chế NHEJ. Khi có mặt DNA mẫu thì việc sửa chữa DNA chỉ được tiến
hành theo cơ chế HDR mà thôi. Việc sử dụng nhiều hơn một phức hợp Cas9D10A để
tạo nên các vị trí đứt gãy sợi đơn (nick) cạnh nhau giúp tăng đáng kể sự đặc hiệu mục
tiêu.
Một biến thể khác nữa của Cas9 là nuclease-deficient Cas9 (dCas9, không có
khả năng cắt DNA). Các đột biến xảy ra với HNH và RuvC domain bất hoạt khả năng
cắt DNA, nhưng vẫn giữ lại khả năng liên kết với DNA. Một ứng dụng của biến thể
này là biến dCas9 thành công cụ hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã khi dung hợp dCas9

với các domain tác động (hoạt hóa hoặc ức chế). Ngoài ra, có thể lợi dụng khả năng
bắt cặp đặc hiệu trình tự của dCas9 với DNA để hiển thị trình tự DNA mong muốn trên
genome bằng cách dung hợp dCas9 với protein huỳnh quang.

24


Chỉnh sửa hệ gene bằng hệ thống CRISPRCas9.

25