Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu xây cellulose nạp Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

`

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, Tháng 5 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NAP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

`

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn
TS. Nguyễn Xuân Thành

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể các thầy cô giáo
đang làm việc tại Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng, cùng toàn thể các
quý thầy cô giáo và tập thể các bạn sinh viên đang tham gia làm việc và học
tập tại bộ môn Sinh lý học người và động vật, khoa Sinh-KTNN, trường đại
học Sư phạm Hà Nội 2 đã hết sức quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu xây cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo”. Đặc biệt, em muốn dành lời cảm ơn sâu sắc của
mình tới TS. Nguyễn Xuân Thành đã tận tình giúp đỡ để em có thể hoàn
thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Lời cuối em xin cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, cùng các quý
thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy em trong suốt bốn năm học qua,
những kiến thức thầy cô truyền đạt trên ghế nhà trường sẽ là hành trang quý
báu cho em trong suốt cuộc đời.
Trong thời gian thực nghiệm khóa luận em đã không ngừng học hỏi để
hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất tuy nhiên các nhân em vẫn còn rất
nhiều thiếu sót vì vậy em mong sẽ nhận được nhiều ý kiến đóng góp từ quý
thầy cô và các bạn để khóa luận hoàn thiện tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Lê Thị Hoàng Anh


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này do chính tôi thực hiện tại Viện
nghiên cứu khoa học và ứng dụng - Trường đại học Sư phạm Hà Nội 2, dưới
sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên cứu là
của riêng tôi, không trùng lặp, không sao chép từ bất cứ khóa luận nào. Kết
luận được đánh giá bằng kết quả thực nghiệm đã thực hiện hoàn toàn trung
thực, không bịa đặt. Trong khóa luận có tham khảo một số tài liệu từ một số
tác giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Lê Thị Hoàng Anh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT

Nội dung

Ký hiệu viết tắt

1

Vật liệu cellulose

VLC

2

Gluconacetobacter xylinus

G. xylinus

3

Môi trường gạo

MTG

4

Môi trường chuẩn

MTC

5

Berberine hidrochoride

BH

6

VLC tạo ra từ môi trường nước vo gạo

VLC - MTG

6

Giờ

h


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng VLC ................. 6
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. xylinus ...................................................... 13
Bảng 2.2. Kết quả đo đường chuẩn của thuốc BH ở bước sóng 345nm (n=3)
......................................................................................................... 16
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS với pH tương ứng là 2; 12; 6,8cm ............... 18
Bảng 3.1. Khối lượng và tỉ lệ thuốc BH hấp thụ vào VLC (n = 3)................. 24
Bảng 3.2. Giá trị OD345nm trung bình của Berberin giải phóng từ VLC qua
các thời điểm khác nhau (n=3)........................................................ 26
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc BH từ VLC – MTG hấp thụ BH, trong các
độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3) .................. 28


DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Cấu trúc của cellulose vi khuẩn ......................................................... 3
Hình 1.2 Cấu trúc sợi của màng Cellulose vi khuẩn......................................... 4
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Berberine ....................................................... 7

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Berberine hydrochloride................................ 7
Sơ đồ 2.1. Quy trình tạo VLC thô ................................................................... 14
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế VLC ....................................................................... 15
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của BH (n = 3)..................................... 17
Hình 3.1. VLC được nuôi cấy trong môi trường gạo...................................... 21
Hình 3.2. VLC tinh chế ................................................................................... 22
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của màng ........................................ 23
Hình 3.4. VLC hấp thụ thuốc BH 10% ........................................................... 23
Hình 3.5. VLC ngâm trong dung dịch đệm .................................................... 25
Hình 3.6. Giải phóng VLC – MTG nạp BH trong máy khuấy từ gia nhiệt .... 25
Hình 3.7. Mẫu dung dịch đệm thu được sau các giờ khác nhau ..................... 26
Hình 3.8. Khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng VLC – MTG
nạp BH trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau ... 27
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc BH ở pH = 6,8 ............................................ 29
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 2 ...................................................... 29
Hình 3.10. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 12 .................................................. 30


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 1
3. Nội dung của nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3
1.1. Vật liệu Cellulose (VLC) ........................................................................... 3
1.1.1. Vật liệu cellulose ( VLC) ......................................................................... 3
1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose ................................................................. 5

1.1.3. Môi trường nuôi cấy................................................................................ 6
1.2. Tổng quan về thuốc Berberine hidrochloride (BH ) .................................. 6
1.2.1. Công thức cấu tạo và công thức phân tử của BH ................................... 6
1.2.2. Tính chất lí hóa của BH .......................................................................... 8
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng ..................................................................... 8
1.2.4. Tác dụng và hạn chế của BH .................................................................. 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian.............................................. 11
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
2.3.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 11
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 11
2.3.3. Thiết bị................................................................................................... 11
2.3.4. Dụng cụ ................................................................................................. 12
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.4.1. Phương pháp lên men thu VLC từ môi trường nước vo gạo ................ 12


2.4.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc ................................. 14
2.4.3. Phương pháp xác định đường chuẩn .................................................... 15
2.4.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành ............................... 17
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào VLC ................ 17
2.4.6. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered
saline) .............................................................................................................. 18
2.4.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế .................................................................................................... 19
2.4.8. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 20
2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 21
3.1. Thu VLC .................................................................................................. 21

3.1.1. VLC thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước.............................. 21
3.1.2. Tinh chế VLC......................................................................................... 22
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của VLC ............................................................... 22
3.3. VLC hấp thụ thuốc BH ............................................................................ 23
3.4. Xác định lượng thuốc giải phóng từ VLC vào các môi trường pH
khác nhau......................................................................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Đã có một số nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter xylinus tạo màng
cellulose trong các môi trường khác nhau như môi trường gạo, môi trường
dừa, môi trường chuẩn và đã có kết quả khá tốt. Nếu thay vi khuẩn là
Gluconacetobacter xylinus thì liệu màng có tạo được và cách làm có thay
đổi? Khả năng giải phóng thuốc Berberine hydrochloride với các pH khác
nhau như thế nào ( pH này được mô tả theo đường ruột )? pH nào là tốt hơn
và đạt hiệu quả giải phóng hơn? Đó toàn bộ là những yêu cầu cần đặt ra khi
làm nghiên cứu về đề tài trên.
Một số loài vi khuẩn, chủ yếu là Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus)
có thể tạo nên vật liệu cellulose (VLC). VLC do G. xylinus tạo ra cấu tạo bởi
những chuỗi polymer β-1,4 glucopyranose mạch thẳng. Cấu trúc hóa học của
VLC tương đối giống với cellulose thực vật, tuy vậy chúng cũng có một số tính
chất lí hóa khác như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao, đường
kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn. Tiềm năng ứng
dụng của VLC vào thực tiễn là rất lớn, trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như:
công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin, đặc biệt là
trong lĩnh vực y học. Trong lĩnh vực y học, VLC đã được các nhà khoa học
nghiên cứu sử dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo

[1]. VLC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển
thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật và một số
ứng dụng y sinh học khác, đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển thuốc.Thuốc Berberine hydrochloride là hoạt chất có nguồn gốc thực
vật, dễ kiếm, rẻ tiền, an toàn, có tác dụng điều trị tốt các bệnh tiêu chảy, nhiễm
khuẩn đường ruột, đau mắt hột... đặc biệt, với bệnh lý viêm đại tràng.Với mục
đích nghiên cứu để đánh giá về khả năng giải phóng của thuốc Berberine
hydrochloride của VLC, chúng tôi đã chọn đề tài:“Nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus
nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu

1


- Tạo VLC từ môi trường chuẩn. Tạo màng hấp thụ thuốc Berberine
hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
- Đánh giá được khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo.
3. Nội dung của nghiên cứu
- Tạo VLC lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Tại VLC nạp thuốc Berberine hydrochloride
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.

tạo

ra

- Tạo VLC nạp thuốc BH.
- Nghiên cứu được khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo ở các môi trường khác nhau: pH= 2; pH= 6,8;
pH=12.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có
những hiểu biết về tiềm năng giải phóng của VLC. Việc nghiên cứu ứng dụng
VLC nhằm làm cho thuốc được giải phóng kéo dài, qua đó có thể khắc phục
hạn chế của thuốc BH dạng thương mại sẽ mở ra một hướng sản xuất thuốc
hiệu quả, mang lại lợi ích cho việc điều trị.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn: Trong lĩnh vực y học, VLC đã được các nhà
khoa học nghiên cứu sử dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu
nhân tạo.
Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể cơ sở cho một số nghiên cứu khác
liên quan.

2


NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vật liệu cellulose (VLC)
1.1.1. Vật liệu cellulose ( VLC)
1.1.1.1. Đặc điểm của Celulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn có cấu tạo bởi một chuỗi polymer do các
glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Cấu trúc của VLC
phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy tĩnh, VLC phụ
thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy, VLC có những tính chất rất đặc biệt
như: có độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học

cao, có thể bị phân hủy sinh học, không đọc và không gây dị ứng, có khả
năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt có khả năng kháng khuẩn.[2,3,4]

Hình 1.1 Cấu trúc của cellulose vi khuẩn
1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của Cellulose vi khuẩn
Cấu trúc cellulose vi khuẩn được xác định nhờ kỹ thuật và công nghệ
hiện đại. Phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân,… là
các kĩ thuật xác định cấu trúc tinh thể của màng cellulose.
VLC được tạo từ 2 cấu trúc tinh thể là cellulose Ia và Iß. Trong vi sợi
của cellulose có 2 cấu trúc vi thể này. Trong cellulose thực vật có thể tách
chiết được tinh thể Iß, Còn tinh thể Ia thì không có cách bào để tách chiết
được. Ở cấu trúc VLC có đến 64% - 71% tinh thể Ia nhiều hơn Ia cấu trúc
cellulose thực vật chỉ chiếm 20%. Cấu trúc tinh thể được coi như một yếu tố
quan trọng ảnh hưởng đến xác định cấu trúc của cellulose. Tuy nhiên có rất ít

3


nghiên cứu về sự tương quan giữa tinh thể đặc tính của cellulose đang nghiên
cứu.
1.1.1.3 Tính chất của cellulose vi khuẩn
- Có cấu trúc giống Cellulose thực vật , nhưng có một số tính chất lý
hóa đặc biệt như:
+ Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.[1]
+ Khả năng giữ và hấp thụ nước tích cực.[1]
+ Có thể bị phân hủy bởi một số vi sinh vật là nguồn tài nguyên có thể
phục hồi.
+ Độ polymer hóa lớn.[1]
Quan sát VLC trên kính hiển vi điện tử quét ( SEM) loại PE – SEM
S4800 HITACHI với độ phân giải 1nm, từ đấy thấy được trong cấu trúc màng

cellulose vi khuẩn chứa các sợi rất nhỏ, các sợi này chúng liên kết với nhau
một cách chặt chẽ, và ở mỗi sợi có độ mảnh và đồng nhất.

Hình 1.2 Cấu trúc sợi của màng vật liệu cellulose
1.1.1.4. Đặc tính của màng VLC
Thực hiện nuôi cấy VLC nhờ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G.
xylinus) trong nuôi cấy tĩnh. VLC được tạo thành trên bề mặt dinh dưỡng lỏng
trong môi trường gạo hoặc môi trường chuẩn hoặc môi trường dừa thành các
lớp mỏng như da. Sản phẩm này có có những tính chất đặc biệt như: độ tinh
sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị
4


phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không
gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn. Với
tính chất này VLC được sử dụng nhiều trong các ngành công nhiệp khac nhau
[1], [2].
1.1.1.5. Ứng dụng của màng VLC
VLC được ứng dụng như trong lĩnh vực thực phẩm, y học hay môi
trường, mỹ phẩm công nghiệp và một số lĩnh vực khác.[1],[2].
Trong lĩnh vực thực phẩm: làm thạch dừa, kem, nước uống siro không
có cholesterol.
Trong lĩnh vực y học: VLC có thể sử dụng làm mạch máu nhân tạo, màng
sinh học trị bỏng, tá dược, đặc biệt làm hệ vận tải phân phối thuốc.[1]
Trong lĩnh vực mỹ phẩm: có thể tạo màng làm mặt nạ dưỡng da.[1]
1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose
Có nhiều vi sinh vật tổng hợp nên nên màng cellulose vi khuẩn như vi
khuẩn Acetobacter xylinum là một loại vi khuẩn chủ yếu được sử dụng để tạo
màng VLC. Ngoài ra còn có các vi sinh vật khác như: Achromobacter,
Aerobacter,

Agrobacterium,
Alcaligenes,
Rhizobium,
Sarcina,
Gluconacetobacter xylinus mỗi loại vi khuẩn có những đặc trưng khác nhau.
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn nổi tiếng tạo màng VLC.
1.1.2.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
G. xylinus là vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này gồm
các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,
Gluconobacter và Kozakia. G. xylinus thường được phân lập từ các nguồn
khác nhau như từ nước quả, hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ, từ
giấm, từ thạch dừa, từ nấm Kombucha, trà,... [8].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus
G. xylinum là vi khuẩn Gram âm dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có
thể di động hay không di động, không sinh bào tử, chúng có thể đứng riêng rẽ
hay xếp thành.

5


1.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi nuôi cấy G. xylinus là môi trường tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng giúp vi khuẩn có thể tạo màng tối ưu như nguồn cacbon,
nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Để tổng hợp tối ưu màng VLC thì nhu cầu sử dụng đường của vi khuẩn G.
xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo VLC được thể hiện ở bảng
1.1.
Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng VLC
MTG

Thành phần
Glucose

20g

Pepton

10g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Nước vo gạo

1000ml

Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu
bằng 10% thể tích môi trường. pH của môi trường của môi trường được đo và
hiệu chỉnh bằng 4-6 (pH tốt nhất cho sự phát triển của G. xylinus là 6 pH thấp
sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác)
1.2. Tổng quan về thuốc Berberine hidrochloride (BH )
1.2.1. Công thức cấu tạo và công thức phân tử của BH
Berberine là một loại muối amoni bậc 4 thuộc nhóm Protoberberine của
các alcaloid benzylisoquinoline được tìm thấy trong các cây như Berberine.

Berberine thường được tìm thấy trong rễ, thân rễ, thân và cỏ cây. Berberine
có màu vàng.
Công thức:
Berberine:

6


+ Công thức phân tử: C20H18NO4+
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Berberine
+ Khối lượng phân tử: 336,3612 g/mol.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 1450C.
Berberine hydrochloride:
+ Công thức phân tử: C20H18Cl NO4
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Berberine hydrochloride
+ Khối lượng phân tử: 372,8612 g/mol.
Berberine là hoạt chất được chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta)…(là loại cây dây leo thân gỗ
có phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi). Trong hoàng đằng có nhiều alkaloid

7


dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là Berberine hydrochloride tỷ lệ từ 1,5 đến
2 – 3%.
Hiện nay, nhiều hãng dược sản xuất Berberine hydrochloride với tên

khác nhau như: Berberine sulfate hoặc Clorhydrate với các biệt dược là thuốc
có hoạt tính kháng sinh, chống viêm với dạng viên nén 10 mg và 50 mg. Có
rất nhiều nghiên cứu đến từ học viên quân y nghiên cứu về tác dụng thuốc đối
với một số bệnh như: bệnh lí về đại tràng...
Berberine hydrochloride an toàn cho hầu hết người lớn sử dụng ngắn
hạn khi dùng bằng đường uống hoặc bôi lên da. Liều cao Berberine trên 500
mg (tương ứng với 8-100 g rễ cây vàng đắng khô) có thể gây ra đau bụng,
buồn nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó thở, nhịp tim chậm, suy tim,
hạ huyết áp, co giật, tê liệt, co thắt và dẫn đến tử vong.
1.2.2. Tính chất lí hóa của BH
1.2.2.1. Lý tính
BH tồn tại ở dạng bột màu vàng hay dạng tinh thể. Có độ tan chảy với
dạng Base là 145oC, với độ tạn BH tan trong Ethanol và rất khó tan trong
ether và tan rất chậm trong nước tỉ lệ 1/500. [13,14,15]
1.2.2.2. Hóa tính
Tính chất hóa học của N trong phân tử BH có tính chất giống một base
yếu và có thể tạo muối bằng cách thay thế nhóm OH trong phân tử BH. BH
cũng có thể tạo muối bằng cách loại phân tử nước thành giống muối
hydroxyd.[10-15]
Tính chất hóa học của oxy trong phân tử BH: kém ổn định trong môi
trường kiềm mạnh, N không bền vững, trong môi trường kiềm mạnh dễ biến
mở vòng, cho chức aldehyd gọi là Berberin al 6, 7, 14.
Tính chất hóa học mạch kép của BH: khi Hydro alkaloid không màu là
do BH có thể do mất mạch kém ở nhân.
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng

8


BH là dược phẩm điều trị tốt các bệnh về dường ruột như tiêu chảy,

viêm đại tràng, ký sinh trùng đường ruột. Ngoài ra BH còn được điều chế
thành thuốc nhỏ mắt trị một số bệnh về mắt như: đau mắt hột, đau mắt đỏ..
Đặc biệt BH còn ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm. Gần đây có những
nghiên cứu chứng minh rằng BH có thể ngừa ung thư như: ung thư vú, ung
thư biểu mô, ung thư dạ dày... Hay nghiên cứu chứng minh BH kết hợp với
một số thuốc kháng sinh có thể giảm thiểu tác dụng phụ từ kháng sinh gây ra.
BH được sản xuất dưới dạng viên nén 10mg và 50mg.
BH thường dùng chủ yếu theo đường uống, bôi lên da và an toàn với
hầu hết nguời sử dụng. Nguyên liêu sản xuất từ rễ của cây vàng đắng khô với
8-100g sản xuất được 500g BH. BH liều cao trên 500mg có thể gây ra các
biểu hiện sau đây: đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó
thở. Huyết áp tụt, gây co giật, co thắt và dẫ đến tử vong.
Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống BH nếu bạn đang mang thai. Bởi vì có một số nghiên
cứu cho thấy rằng BH có thể đi qua nhau thai đến trẻ sơ sinh qua sãu mẹ từ đó
gây hại cho trả sơ. BH có ở thai nhi hoặc trẻ nhỏ gây vàng da nhân
(kernicterus), đây là một loại tổn thương não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp
xúc với BH.
1.2.4. Tác dụng và hạn chế của BH
1.2.4.1. Tác dụng của thuốc BH
Các tác dụng của chủ yếu của BH là chống bệnh tiêu chảy do vi khuẩn
Ecoli gây ra hoặc do ký sinh trùng gây bệnh đường ruột. Hiện nay dược học
đã bào chế BH thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt hột và đau
mắt đỏ... Độc đáo của BH còn có thể ngăn ngừa các nhiễm nấm, chống lại các
bi khuẩn tả , đặc biệt với các bệnh lí viêm đại tràng và ngăn ngừa ung
thư.[10,11]
Nếu kháng sinh kết hợp với BH sẽ làm giảm hoặc mất tác dụng phụ của
kháng sinh.[12]

9

Các kết quả nghiên cứu từ mô hình Morris Water Maze và Object
Recognition ( ở cả 2 quá trình) thấy được BH kết hợp Plamatin giúp cải thiện
khả năng học hỏi và tăng trí nhớ không gian và hình ảnh của chuột.[12]
1.2.4.2. Hạn chế của thuốc BH
Berberine hydrochloride (BH) sở hữu các tính chất dược lý khác nhau
bao gồm cả chất chống ung thư; Thật không may, nó có sinh khả dụng đường
uống thấp và các tác dụng phụ tiềm năng cho việc tiêm.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hệ thống giải phóng thuốc Berberine hydrochloride của VLC lên men
từ môi trường nước vo gạo.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
Địa điểm: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trường đại học sư
phạm Hà Nội 2.
Thời gian: 10/2018 – 5/2019.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn G. xylinus thuần chủng được viện nghiên cứu công
nghệ và khoa học, trường ĐHSP Hà Nội 2 mua từ nhật bản.
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất
- Nguyên liệu: nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng, giấy đánh
dấu…

- Hóa chất:
+ Dùng tạo VLC: Đường glucose, acid acetic, diamoni photphat,
Amoni sulfat, pepton, acid acetic, dịch giống G. xylinus.
+ Dùng trong hấp thu thuốc: Berberin 95%, etanol.
+ Dùng trong pha dung dịch đệm giải phóng: NaCl, KCl,
Na2HPO4.12H2O4, Na2HPO4.
2.3.3. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Cân kỹ thuật (Đức)

11


- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức).
- Nước cất
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu.
- Tủ lạnh bảo quản mẫu (Y)
2.3.4. Dụng cụ
Dụng cụ cho tạo VLC: hộp nhựa, cốc đong thủy tinh, bình thủy tinh
(500ml), bình thủy tinh 1000ml, đũa thủy tinh, đèn cồn, cốc đong chia vạch
10ml, khăn mỏng, dây chun, thước kẻ…
Dụng cụ giải phóng: bình thủy tinh 1000ml, bình thủy tinh 500ml, pipet
chính xác 1ml – 5ml- 10ml thước kẹp panme, giấy lọc, lọ thủy tinh 10ml, cốc
đong 100ml và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu VLC từ môi trường nước vo gạo
- Lên men thu VLC từ môi trường nước vo gạo G. xylinus nuôi cấy dựa
vào môi trường chuẩn Hestrin-Schramm được cải tiến bằng cách thay cao
nấm men bằng nước vo gạo có thành phần chứa nhiều vitamin B, các chất
khoáng như sắt, đồng,... được trình bày như trong bảng 2.1

12


Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. xylinus
Khối lượng

Thành phần
Nước vo gạo

1000ml

Glucose

30g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Pepton

10g

Acid acetic

2%

Dịch giống G. xylium

10%

Pha môi trường theo bảng 2.1. Đầu tiên ta pha môi trường chuẩn để
nhân dịch giống, với môi trường chuẩn thì ta chỉ cần thay nước vo gạo thành
nước cất và pha tỉ lệ hóa chất giống bảng 2.1. khi thu được lượng dịch giống
vừa đủ. Ta tiến hành tạo VLC - MTG: cho các hóa chất trên theo đúng tỉ lệ
vào bình 1000ml, sau đó lấy 1000ml nước gạo đã loại bỏ tạp chất cho vào
bình đã có hóa chất rồi tiếp tục thực hiện rung trong 30 phút cho tan hết hóa
chất. Sau đó đậy kín bình bằng giấy bạc rồi đem hấp vào máy khử trùng ở
1130C trong 15 phút. Môi trường cần để nguội và đưa vào khử trùng bằng tia
UV trong 30 phút. Sau đó thực hiện thao tác đổ môi trường, và ủ tĩnh.
Thao tác đổ môi trường: thực hiện trong phòng sạch, sát trùng tay và đồ
dùng, chuẩn bị cồn và vải mỏng để đậy khay. Hơ miệng bình trước khi thực
hiện: bổ sung ít nhất 10% dịch giống vào môi trường, sau đó đậy khăn lên
khay. Cuối cùng ủ tĩnh trong khoảng 6 – 14 ngày ở nhiệt độ phòng thu được
VLC thô. Cụ thể quy trình tạo VLC từ vi khuẩn G. xylinus trong môi trường
nước vo gạo như sơ đồ 2.1 dưới đây.

13

Nước vo gạo
(đã lọc bã, rác)

Bổ sung dinh dưỡng
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
( 121°C , 20 phút)

Để nguội

Đổ giống và ( ít nhất 10%
dịch giống )

Ủ tĩnh 6 - 14 ngày ở 26°C

Thu VLC thô
Sơ đồ 2.1. Quy trình tạo VLC thô
2.4.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc
VLC sau khi có độ dày thích hợp để giải phóng như 0,3cm hoặc 0,5cm
thì có thể thu màng. VLC thô chứa một lượng lớn môi trường lên men và một
số sản phẩm từ quá trình trao đổi chất. Vì vậy nhất thiết phải xử lý VLC trước
khi hấp thụ thuốc, loại hết các tạp chất và loại bỏ và trung hòa các độc tố của
vi khuẩn.

14


Quy trình tinh chế VLC theo sơ đồ 2.2[3,4] dưới đây:

Tách VLC thô

Rửa bằng nước cất

Bình 1000ml NaOH 0,3M
( 20 – 30 màng d=1,5cm)

Hấp trong 1130C, 15 phút

Xả nước, 12- 24 giờ

VLC tinh khiết

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế màng VLC
- Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC: Sử dụng thuốc thử
Fehling nhằm phát hiện sự có mặt của đường D – glucose, nếu có D - glucose
sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa nâu đỏ.
2.4.3. Phương pháp xác định đường chuẩn
Nguyên tắc: Chọn mẫu chuẩn ban đầu, và 6 mẫu đánh giá.
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º

15


Với C1 = 100%, ta cân 0,01g BH rồi cho vào bình 100ml có chứa cồn
96% hoàn tan BH trong dung dịch thu được C1 = 100%
Với C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ của BH là 50%; 40%;
30%; 20%; 10%; 5% ta thực hiện pha loãng C1 sao cho phù hợp.
Dùng máy đo quang phổ UV-Vis để đo cường độ quang phổ của các

dung dịch đã pha ở bước sóng 345nm [16].
Tiến hành pha thuốc và đo quang phổ 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD345nm của các nồng độ thuốc khác nhau được
thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả đo đường chuẩn của thuốc BH ở bước sóng 345nm
(n=3)
Giá trị OD 345nm (n=3)

STT

Nồng độ
(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

5

0,354

0,356

0,34

0,35 ± 0,0025

2

10

0,711

0,715

0,7

0,709 ± 0,0022

3

20

1,522

1,523

1,531

1,525 ± 0,0061

4

30

2,030

2,300

2,285

2,204 ± 0,1526

5

40

2,965

3,005

3,045

3,006 ± 0,0489

6

50

3,702

3,642

3,503

3,6149 ± 0,10321

Giá trị trung bình

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn BH bằng phần mềm Excel
2010, kết quả được đồ thị như hình 2.3.

16