Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.02 MB, 42 trang )
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
HÀ NỘI - 2019
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các
thầy cô giáo đang làm việc tại Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng cùng
các thầy cô giáo và các bạn sinh viên đang tham gia làm việc, nghiên cứu và
học tập tại bộ môn Sinh lý học ngƣời và động vật khoa Sinh-KTNN, Trƣờng
đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã hết sức giúp đỡ cũng nhƣ tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình em nghiên cứu và hoàn thành khóa luận với
đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường chuẩn”.
Tiếp theo, em muốn dành lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Xuân Thành đã
tận tình chỉ bảo và giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tôt nghiệp.
Lời cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể các thầy cô đã giảng dạy em 4
năm học vừa qua, tất cả những kiến thức quý báu mà các thầy cô đã truyền đạt
sẽ là những hành trang vô cùng quý báu cho em trên con đƣờng sau này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Bích Ngọc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này đƣợc chính tôi thực hiện tại
Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng- Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội 2,
dƣới sự trực tiếp hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên
cứu là của cá nhân tôi, không có sự trùng lặp, không sao chép từ bất kì tài liệu
nào. Kết luận đƣợc đánh giá dựa trên kết quả thực nghiệm đã thực hiện không
bịa đặt. Trong khóa luận có đƣợc sử dụng một số tài liệu tham khảo từ các tác
giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và độ tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu mọi trách nhiệm trƣớc hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Bích Ngọc
CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG KHÓA LUẬN
Từ đầy đủ
Từ viết tắt
G. xylinus
Gluconacetobacter xylinus
BH
Berberine hydrochloride
UV - vis
Ultraviolet visible
ĐHSP
Đại học Sƣ Phạm
VLC
Vật liệu cellulose
NCKH và ƢD
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng
Nxb
Nhà xuất bản
OD
Mật độ quang phổ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Dự kiến kết quả nghiên cứu .......................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC) ....................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc màng VLC ................................................................................ 5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC .................................................................... 6
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn............................................... 7
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC ....................................................................... 7
1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride ............................................. 8
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất ............................................................... 8
1.2.2. Tác dụng dƣợc lí và ứng dụng ................................................................ 9
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine hydrochloride ............ 9
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................... 10
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose .................................................................... 10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 11
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 11
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................. 11
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 12
2.4. Môi trƣờng tạo màng VLC....................................................................... 12
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.5.1. Phƣơng pháp tạo màng VLC từ môi trƣờng chuẩn............................... 12
2.5.2. Phƣơng pháp xử lí màng VLC trƣớc khi hấp thụ thuốc........................ 14
2.5.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của màng ..................................... 15
2.5.4. Phƣơng pháp xác định khối lƣợng VLC tạo thành ............................... 15
2.5.5. Xây dựng đƣờng chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 960. ... 15
2.5.6. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng VLC....... 17
2.5.7. Phƣơng pháp pha môi trƣờng đệm PBS (Phosphate buffered saline) .. 18
2.5.8. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống đƣợc
thiết kế ............................................................................................................. 19
2.5.9. Phƣơng pháp xử lý thống kê ................................................................. 20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 21
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn..... 21
3.1.1. Màng VLC đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn.................................... 21
3.1.2. Tinh chế màng VLC .............................................................................. 22
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC .................................................. 22
3.2. Khảo sát màng VLC trong quá trình hấp thụ thuốc berberine
hydrochloride .................................................................................................. 23
3.3. Lƣợng thuốc giải phóng từ màng VLC vào các môi trƣờng pH khác nhau
......................................................................................................................... 23
3.3.1. Mật độ quang của berberin khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ..................................... 23
3.3.2. Tỉ lệ giải phóng dƣợc chất của các màng ở các môi trƣờng pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau .................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 30
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC ................................................................. 7
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng VLC ............................................................. 12
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang OD của dung dịch berberine......................... 16
hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3) ............................... 16
Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS với pH tƣơng ứng là 2; 6,8 và 12 ................ 18
Bảng 3.1. Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng VLC (n = 3) ......................... 23
Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ....................................................... 24
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride ............................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô ................................................. 13
Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC......................................................................... 14
Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của berberine hydrochloride (n=3) ..... 17
Hình 3.1. Màng VLC sau khi đƣợc thu từ môi trƣờng chuẩn ......................... 21
Hình 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ....................................................... 25
Hình 3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc berberine hydrochloride ............................. 26
Hình 3.3. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH=2 ...................................................... 27
Hình 3.4. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12. .................................................. 27
Hình 3.5. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =6,8 .................................................. 28
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe,
làm đẹp bằng việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ các nguyên
vật liệu sinh học rất phổ biến và đƣợc ƣa chuộng do có tác dụng hiệu quả
cũng nhƣ độ an toàn cao. Chính vì độ an toàn, khả năng tái tạo, sự phân
hủy sinh học và thân thiện với môi trƣờng của các loại vật liệu sinh học
mà chũng đã đƣợc rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và sử dụng
rộng rãi. Một trong số những vật liệu sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi và
phổ biến là vật liệu Cellulose.
Vật liệu Cellulose (VLC) đƣợc tạo ra từ 1 loại vi khuẩn là chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [3,8]. Cấu tạo của chủng
vi khuẩn này bao gồm các phân tử glucose đƣợc nối với nhau nhờ liên
kết ß- 1 4 glucozit, đây là một loại màng sinh học (VLC) đƣợc tạo nên
nhờ liên kết hóa học này, loại màng này có cấu trúc và đặc tính tƣơng tự
cellulose ở thực vật. Tuy nhiên, chúng lại có nhiều những đặc điểm ƣu
việt và ứng dụng hơn nhƣ: dù ở trạng thái ẩm vẫn có khả năng hút nƣớc
cao, độ bền và tính dẻo dai của màng cao, độ tinh khiết cao. Cellulose vi
khuẩn còn có những đặc tính vƣợt trội hơn hẳn khi so sánh với cellulose
thực vật: không có các hợp chất cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến. Đặc biệt, màng VLC có thể đƣợc sản xuất trên quy
mô lớn vì nguồn nguyên liệu dễ kiếm, giá thành rẻ. Vì vậy, có thể thấy
vật liệu cellulose là một loại nguyên liệu mới sẽ đƣợc ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực nhƣ y học, thực phẩm, mỹ phẩm,… [11,18].
Một trong các lĩnh vực mà màng VLC đƣợc ứng dụng nhiều nhất
và rất thành công đó là y học. Màng VLC đƣợc nghiên cứu vào việc ứng
dụng làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da, từ đó phát
huy đƣợc ƣu điểm và khắc phục các nhƣợc điểm của thuốc khi sử dụng
một cách thông thƣờng. Ƣu điểm vƣợt trội nhất của việc sử dụng màng
VLC là khả năng làm lành lại vết thƣơng, đặc tính bảo vệ và hấp thụ
dịch tiết. Một số hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc thời
1
gian dài thƣờng có ít lớp hoặc một lớp duy nhất nên quy trình sản xuất
đƣợc đơn giản hóa và giảm chi phí sản xuất. Vậy nên có thể sản xuất các
sản phẩm dùng trực tiếp qua da từ nhiều loại vật liệu khác nhau [11,18].
Việt Nam là đất nƣớc: nóng ẩm, mƣa nhiều nên rất nhiều các loại vi
sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm, mốc, kí sinh trùng phát triển rất mạnh, cùng
với đó là việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cũng nhƣ vệ sinh môi
trƣờng sống còn thấp nên dễ tạo điều kiện cho các loại vi sinh vật có hại
gây nên các bệnh liên quan đến đƣờng ruột nhƣ rối loạn tiêu hóa, tiêu
chảy…, ngoài ra còn gây một số bệnh nhƣ đau mắt hột. Berberine
hydrochloride là một hợp chất đƣợc tìm thấy từ thực vật, dễ tìm, an toàn
và giá thành thấp, có hoạt tính chống viêm [2]. Chúng đƣợc dùng nhiều
trong việc điều trị các bệnh liên quan đến đƣờng tiêu hóa.
Tuy nhiên, berberine hydrochloride đƣợc sử dụng chủ yếu qua
đƣờng uống với sinh khả dụng thấp, gây tác dụng phụ cho việc vận
chuyển thuốc bên ngoài đƣờng tiêu hóa [24]. Khi sử dụng thuốc có thể
bị các tác nhân khác làm ảnh hƣởng đến hiệu quả sử dụng thuốc. Ngoài
ra, thuốc còn có tác dụng phụ liên quan đến các nhóm cơ và tinh mạch.
Vậy nên cần phải nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberine
hydrochloride.
Với mục đích tạo ra màng VLC bằng chủng vi khuẩn G. xylinus, từ
đó tạo ra màng sinh học sử dụng để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng giúp kéo dài thời gian giải phóng, phát huy những ƣu điểm và
khắc phục những tác dụng không mong muốn, của VLC trong việc điều
trị các bệnh.
Vì vậy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
của vật liệu cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
hydochloride từ màng VLC đã nạp thuốc ở môi trƣờng chuẩn có độ pH
khác nhau.
2
3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng Berberine hydrochloride
của vật liệu Cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn.
- Vật liệu nghiên cứu bao gồm: màng VLC tạo ra từ môi trƣờng
chuẩn.
- Phạm vi nghiên cứu: Các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên quy mô
phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Phòng thí nghiệm sinh lý học ngƣời và động vật Trƣờng đại học
Sƣ phạm Hà Nội 2.
+ Viện nghiên cứ khoa học và ứng dụng Trƣờng đại học Sƣ phạm
Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
+ Hiểu đƣợc ứng dụng của màng VLC trong cuộc sống.
+ Việc hạn chế những nhƣợc điểm của thuốc Berberine
hydrochloride khi sử dụng màng VLC sẽ đƣa ra một hƣớng nghiên cứu mới
trong nghiện cứu khoa học, không chỉ ứng dụng để khắc phục hạn chế của
thuốc này mà màng VLC có thể đƣợc sử dụng ở rất nhiều loại thuốc khác
giúp cho sự phát triển không ngừng của y học trong thời gian tới.
3
-Ý nghĩa thực tiễn:
+ Sản xuất ra màng VLC từ môi trƣờng chuẩn.
+ Xác định khả năng giải phóng thuốc Berberine hydrochloride từ
đó xác định đƣợc khả năng giải phóng thấp nhất, cao nhất tại các thời gian
khác nhau.
5. Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tạo đƣợc màng VLC từ vi khuẩn G. xylinus trong môi trƣờng
chuẩn.
- Xử lý màng thô để thu đƣợc màng VLC tinh sạch
- Thực hiện quá trình giải phóng thuốc của màng VLC đƣợc tạo ra
trong môi trƣờng chuẩn ở các độ pH khác nhau.
4
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một trong những đại phân tử hữu cơ tồn tại phổ biến
trên trái đất, là thành phần chính tạo nên sinh khối của thực vật, đại diện
cho các polymer ngoại bào của các loại vi sinh vật. Cellulose có thể trao đổi
sơ cấp và tạo màng bảo vệ [[8].
Ngày nay, Gluconacetobacter xylinus đƣợc chứng minh là một
trong số những loại vi khuẩn tạo ra màng VLC hiệu quả nhất trong tự
nhiên. Đây là loại vi khuẩn gram âm, sống hiếu khí không bắt buộc, không
có khả năng sinh bào tử và là loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi
một tế bào của G. xylinus chuyển hóa đƣợc tới 108 phân tử glucose và phân
tử cellulose chỉ trong vòng 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn.
G. xylinus dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, có thể di chuyển
hoặc không di chuyển và không sinh bào tử. Khi tế bào của vi khuẩn này
già đi hay do tác động của môi trƣờng thì gram của chúng có thể bị biến
đổi. G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng
trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả
năng tạo màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [12].
Trong môi trƣờng rắn nuôi cấy khoảng 3 đến 7 ngày, khuẩn lạc
G. xylinus phát triển nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng để 1 tuần thì
khuẩn lạc phát triển to, đục, khô dần.
Ở môi trƣờng lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì có 1 lớp màng
dày đục xuất hiện, sau từ 36- 48 giờ hình thành một lớp màng trong và càng
dày.
1.1.1. Cấu trúc màng VLC
Màng VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống với cellulose có nguồn
gốc thực vật (plant cellulose– PC), tuy nhiên chúng lại khác nhau ở cấu trúc
đại thể. Các sợi mới của mang VLC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi
sơ cấp (subfibril), rộng khoảng 1.5nm. Các sợi sơ cấp này sẽ kết thành vi sợi
5
nằm trong các bó sau đó hình thành các dải với độ dày 3-4nm, chiều rộng 70
– 80nm; 3.2 x 133nm. Cấu trúc của VLC đƣợc quyết định bởi điều kiện nuôi
cấy [22]. Cấu trúc hóa học của VLC đƣợc thể hiện ở hình 1.1.
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC
Độ tinh khiết cao: VLC là loại cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng
hợp không có lignin hay hemicellulose. Vậy nên có thể sử dụng VLC là
nguyên liệu tái sinh, an toàn với môi trƣờng vì nó có thể đƣợc phân hủy hoàn
toàn bởi vi khuẩn.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cơ học rất lớn, khả
năng chịu đƣợc lực kéo cao, khối lƣợng nhẹ, độ bền cao.
Khi ở trạng thái ẩm màng VLC vẫn có khả năng hút nƣớc cực cao, và
có thể giữ đƣợc lƣợng nƣớc lớn, có thể hút gấp 60 – 700 lần trọng lƣợng của
nó [18].
Quá trình sinh tổng hợp hình thành trực tiếp nên màng VLC vậy nên
việc sản xuất giấy và sợi không cần qua các bƣớc trung gian.
Màng VLC đƣợc định hƣớng trong khi tổng hợp: có khả năng tạo các
bền theo một trục do sự hình thành các sợi biến động. Theo Brown và White
(1989) [31] gang tay cellulose có thể đƣợc hình thành mà không cần khâu
bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí xuyên qua đƣợc và dìm
xuống không khí bên trong môi trƣờng nuôi cấy G. xylinus, các tế bào vi
khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose nhƣ hình dạng
mong muốn.
6
Trong quá trình tổng hợp màng VLC đƣợc biến đổi trực tiếp: màng
này có thể thay đổi thuộc tính khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào
trong quá trình tổng hợp.
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trường chuẩn
Trên thế giới, màng từ vật liệu cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn
đƣợc sử dụng rộng rãi và rất phổ biến vì nó bền hơn các loại màng cellulose
lên men từ các môi trƣờng khác.
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC
Màng VLC có rất nhiều ƣu điểm: độ kết tinh, độ tinh sạch, độ bền sức
căng, độ bền đàn hồi, độ co dãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả hút
nƣớc và giữ nƣớc cao, bị phân hủy sinh học, có tính tƣơng thích sinh học, tính
trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [18].
Với những ƣu điểm đó thì màng VLC đƣợc con ngƣời ứng dụng trong
rất nhiều lĩnh vực [4, 10, 11, 12, 18, 22, 23, 25, 30] trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC
Lĩnh vực đƣợc
Sản phẩm
ứng dung
ứng dụng
Lớp màng chữa bỏng
Y dƣợc
Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Thực phẩm
Thức ăn tráng miệng (thạch)
Thịt nhân tạo
Móng nhân tạo
Mỹ phẩm
Vải, túi tự phân hủy
Miếng xốp làm sạch vết loang tràn dầu
Môi trƣờng
Sử dụng làm màng lọc
Lĩnh vực khác
7
1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride
Berberine hydrochloride là hoạt chất chiết từ cây hoàng đắng (tên gọi khác
là vàng đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta) là loại cây leo thân gỗ có
phân nhánh, chúng mọc hoang ở rất nhiều nơi. Berberine hydrochloride timg thấy
nhiều nhất ở thân và rễ cây hoàng đằng với tỉ lệ 1,5 – 3%, chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần.
Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
Loại thuốc: kháng khuẩn, chống lại các bệnh về đƣờng ruột do vi khuẩn,
các loại kí sinh trùng đƣờng ruột
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất
Berberine hydrochloride là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có
khung protoberberine [1]. Isoquinolin còn có tên gọi khác là benzo pyridine hay
2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo:
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lƣợng phân tử: 371,82
Tên
khoa
học:
5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6aazoniaindeno (5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
Tính chất vật lý:
Tinh thể hay bột có kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng. Độ
chảy khi ở dạng base là 145oC (bị phân hủy) [17]. Tan chậm trong nƣớc ở
độ tan dạng base 1/500 [27], trong ethanol ít tan, khó tan trong ether [17].
8
Dễ tan trong nƣớc ở dạng muối sulfat với tỉ lệ 1/30. Không có đồng phân
quang học do không có C bắt đôi [11,17].
Tính chất hóa học:
Tính chất hóa học của N: Tƣơng tự 1 base yếu, thay thế nhóm OH để
tạo muối, muối berberine tạo thành có loại phân tử nƣớc giống muối của
hydroxyd kim loại mà không giống muối của các alkaloid khác [17].
Tính chất hóa học của oxy: Berberine ổn định thấp trong môi trƣờng
kiềm mạnh, trong môi trƣờng kiềm mạnh dễ mở vòng cho chức aldehyd do
N không bền vững gọi là Berberinal [7].
Tính chất hóa học mạch kép: Berberine có thể mất mạch kép tại nhân
giữa để cho các hydro alkaloid không màu [7].
1.2.2. Tác dụng dược lí và ứng dụng
Tác dụng chính của Berberine hydrochloride là kháng khuẩn, dùng
chủ yếu ở các bệnh liên quan đến rối loạn đƣờng tiêu hóa [27]. Chống nhiễm
các loại nấm, các loại kí sinh trùng và nhiễm khuẩn do vi khuẩn hay virut gây
ra. Một vài loại thuốc nhỏ mắt chữa đau mắt hột cũng có thành phần là
Berberine hydrochloride.
Nếu sử dụng thuốc với lƣợng nhỏ còn có tác dụng kích tim, làm giãn
mạch vành, sử dụng với liều lớn gây ức chế hô hấp, làm tê liệt trung khu hô
hấp khi tim vẫn đập. Ngoài ra thuốc còn có một số tác dụng khác nhƣ hạ
nhiệt, gây tê, an thần, lợi mật, kháng lợi niệu.
Một vài nghiên cứu gần đây cho thấy: Berberine hydrochloride có
thể giúp hạ đƣờng huyết hiệu quả nhƣ metformin [30]. Berberine
hydrochloride làm giảm mạnh lƣợng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid
và sơ vữa [22], ngoài ra còn thể điều trị chứng co giật và bệnh động kinh [23].
Bảo vệ các tế bào thần kinh và chống trầm cảm [23].
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine hydrochloride
9
Chỉ định: tiêu chảy, nhiễm trùng đƣờng ruột, hội chứng lỵ, lỵ trực
tràng, viêm đƣờng ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết
hột, các trƣờng hợp ngứa mắt do bị dị ứng.
Chống chỉ định: mẫn cảm với bất kì thành phần nào của thuốc, phụ
nữ có thai và cho con bú
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose
Trên thế giới
Những công trình nghiên cứu về thuốc berberine hydrochloride nhƣ:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả an toàn của berberine
hydrochloride trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣởng loại 2 [19].
Pyan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về
berberine hydrochloride trong bệnh tiểu đƣờng [28].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu và tác dụng và cơ chế của
berberine hydrochloride trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [20].
Tại Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberine hydrochloride ở Việt Nam có một
số công trình nghiên cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
Nguyễn Liêm – chiết xuất berberine hydrochloride bằng áp lục nóng
[9].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu và cải tiến
quy trình sản xuất berberine hydrochloride từ cây vàng đắng [9].
Hồ Đắc Trinh – sử dụng dung dịch acid sulfuric loãng để chiết
berberine clorid trong vàng đắng [15].
Trần Công Khánh – gớp phần nghiên cứu phƣơng pháp sản xuất
berberine hydrochloride từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [5].
10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc berberine
hydrochloride của màng vật liệu cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn.
Vật liệu nghiên cứu: Màng VLC, thuốc berberine hydrochloride ở dạng
tinh khiết
Phạm vi nghiên cứu: các thí nghiệm trong nghiên cứu đƣợc thực hiện ở
phòng thí nghiệm
2.2. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng VLC từ môi trƣờng chuẩn.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberine hydrochloride từ hệ
thống màng VLC đã đƣợc nạp thuốc berberine hydrochloride.
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích;
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
11
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng
Hóa chất:
Hóa chất đặc biệt: Pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberine hydrochloride (độ tinh khiết 98%), cao nấm men, cồn 96º, đƣờng
glucose, pepton, acid axetic, KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaOH, acid
HCl đậm đặc, nƣớc cất và một số hóa chất khác.
2.4. Môi trƣờng tạo màng VLC
Môi trƣờng tạo VLC đƣợc trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường tạo màng VLC
STT
Hóa chất
Khối lƣợng
1
Nƣớc cất 2 lần
1000ml
2
Glucose
20g
3
Cao nấm men
5g
4
Pepton
5g
5
Na2HPO4
2,7g
6
Axit citric
1,5g
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tạo màng VLC từ môi trường chuẩn
- Lên men tĩnh: Môi trƣờng dinh dƣỡng để lên men G. xylinus đƣợc
đựng vào các khay lên men có bề mặt rộng, thoáng. Trong thời gian lên
men, các khay này đƣợc phủ đậy bởi lớp giấy báo có độ xốp để tạo độ
thông khí. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp để lên men vào khoảng 28 –
30oC. Sau đó sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa không khí và môi
trƣờng lỏng. Cellulose tiếp tục đƣợc tổng hợp và bám lên màng cellulose
phía bên trên. Khoảng 7 – 10 sau đó sẽ thu đƣợc màng VLC [14].
12
- Cụ thể quy trình VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc thực
hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [14].
Nƣớc cất 2 lần
Bổ sung dinh dƣỡng cần thiết
(bảng 2.1)
Hấp thanh trùng
(113ºC, 20 phút)
Để nguội
Đổ giống và acid acetic vào bình nuôi
cấy thực hiện trong buồng cấy vô trùng
( 10% giống + 2% acid)
Đậy bình bằng vài xô
sạch, đê nơi thoáng mát
Lên men 7-8 ngày
Thu màng VLC
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô
13
2.5.2. Phương pháp xử lí màng VLC trước khi hấp thụ thuốc
Màng VLC sau khi thu đƣợc chứa một lƣợng lớn môi trƣờng lên men
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trƣớc khi hấp
thụ thuốc ta cần phải tiến hành tinh sạch xử lí màng để quá trình hấp thụ và
giải phóng đƣợc chính xác.
Quy trình xử lí màng [13] đƣợc trình bày trên sơ đồ 2.2.
Tách màng VLC thô
Ép loại nƣớc
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu màng VLC tinh chế
Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC
Tách VLC: Trong nuôi cấy tĩnh VLC tạo thành màng dày ở mặt môi
trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.
14
Ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải
phóng nội độc tố của vi khuẩn và trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn.
Ngâm HCl: sau khi ngâm màng bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép màng. Sau
đó, ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm, rửa với nƣớc rồi ép màng. Ngâm
nƣớc đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48h thu đƣợc VLC tinh khiết.
2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng
Mục đích: Đảm bảo màng VLC đã đƣợc tinh sạch, loại bỏ hết tạp
chất gây độc hại, kiểm tra sự có mặt của đƣờng glucose trong màng VLC.
Nguyên tắc: sử dụng thuốc thử Fehling mới pha chế để kiểm tra sự
có mặt của đƣờng D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
- Dịch thử của màng VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Ngâm trong nƣớc đun sôi 10 - 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành
VLC sau khi đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng, sau đó xử lí theo công
đoạn hóa học [15] thu đƣợc VLC tinh chế. VLC tinh chế đƣợc ép áp lực, thu
đƣợc khối lƣợng VLC tạo thành.
2.5.5. Xây dựng đường chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 960.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º.
- Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc berberin ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% trong cồn 96º.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - Vis để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở bƣớc sóng 345nm [24].
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
15
berberin để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc berberine hydrochloride.
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc berberine hydrochloride ở các
nồng độ khác nhau đƣợc thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang OD của dung dịch berberine
hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3)
Giá trị OD 345nm (n = 3)
STT
Nồng
độ
(mg/ml)
Giá trị trung bình
Lần 1
Lần 2
Lần 3
1
5
0,353
0,355
0,354
0,354 ± 0,003
2
10
0,712
0,714
0,710
0,712 ± 0,002
3
20
1,523
1,522
1,532
1,526 ± 0,006
4
30
2,031
2,299
2,286
2,205 ± 0,151
5
40
2,966
3,004
3,046
3,005 ± 0,040
6
50
3,703
3,641
3,504
3,616 ± 0,102
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn berberine hydrochloride
bằng phần mềm Excel 2010. kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.3.
16
