Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP
THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS. Cao Bá Cường

HÀ NỘI, 2019


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn TS. Cao Bá Cường, Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, người đã hướng dẫn, chỉ dạy và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Tổ bộ môn Sinh lý người và
động vật, Khoa Sinh – KTNN, và các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và
ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho em trong việc
thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Mặc dù đã cố gắng rất nhiều nhưng bài khóa luận tốt nghiệp này vẫn còn
nhiều những hạn chế, sai sót. Vì vậy, em rất mong nhận được các ý kiến nhận xét từ
thầy cô và các bạn để bài khoá luận của em hoàn thiện hơn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Hoàng Thị Trang


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Khoá luận “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc
neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy
trong một số môi trường” là nghiên cứu do cá nhân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn
của TS. Cao Bá Cường cùng các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và ứng
dụng. Các kết quả mà tôi trình bày trong khoá luận là trung thực, khách quan, không
trùng lặp với các nghiên cứu trước đây.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Hoàng Thị Trang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài.....................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu...............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................2
NỘI DUNG ................................................................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC) ......................................................................3
1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose .......................................................................3
1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus ............................................................3
1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn ......................................5
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp
thuốc ..........................................................................................................................6
1.2.1.Trên thế giới .......................................................................................................6
1.2.2.Tại Việt Nam ......................................................................................................6
1.3.Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate .................................................................7
1.3.1. Công thức ..........................................................................................................7
1.3.2. Tính chất lí hoá..................................................................................................7
1.3.3. Dược lý và dược động học ................................................................................7
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ...............................................................................8
1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam....................8
1.4.1.Trên thế giới .......................................................................................................8
1.4.2.Tại Việt Nam......................................................................................................9

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU10
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................10
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu.........................................................10
2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................10


2.3.1. Chủng vi khuẩn ...............................................................................................10
2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất..................................................................................10
2.3.3. Thiết bị và dụng cụ..........................................................................................10
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................10
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường ....10
2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc...........11
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC ................................................12
2.4.4. Chế tạo VLC hấp thụ neomycin sulfate ..........................................................12
2.4.4.1. Chuẩn bị bộ đệm ..........................................................................................12
2.4.4.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate. ...........................12
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ vào màng
Cellulose vi khuẩn.....................................................................................................13
2.4.6. Xử lý thống kê.................................................................................................14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................15
3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4) ..........15
3.2. Tạo VLC của Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường..................16
3.3. Thu màng VLC thô từ môi trường .....................................................................16
3.4. Xử lý màng VLC thô trước khi hấp thụ thuốc ...................................................17
3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng ........................................................................18
3.6. Tỷ lệ hấp thu Neomycin sulfate vào màng CVK trong 3 môi trường ...............18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................24
1. Kết luận .................................................................................................................24
2. Kiến nghị ...............................................................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................25

PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Cs:

Cộng sự

MTC:

Môi trường chuẩn

G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

MTD:

Môi trường dừa

MTG:

Môi trường gạo

NS:

Neomycin sulfate

PBS:

Phosphate bufered saline

VLC:

Vật liệu Cellulose


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn ........................................................................5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1]..............................................7
Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong môi trường PBS
(pH = 7,4). .................................................................................................................15
Hình 3.2. VLC được nuôi cấy trong một số môi trường...........................................16
Hình 3.3. VLC thô có độ dày khác nhau 0,3 cm, 0,5 cm..........................................17
Hình 3.4. Màng Cellulose sau khi hấp trong NaOH và xả dưới vòi nước 1 ngày ....17
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của glucose................................................18
Hình 3.6. VLC tinh khiết hình dạng viên thuốc (đường kính 1,5 cm)......................18
Hình 3.7. VLC đang hấp thụ neomycin sulfate ở 400C ............................................19
Hình 3.8. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS của các loại VLC.................................................23


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21] .........................................3
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10]..........................................4
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ..................................................4
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose ...............................................11
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ..........................................................12
Bảng 3.1. Bảng giá trị đo OD trung bình của dung dịch thuốc NS ở các nồng độ ...15
Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch thuốc Neomycin Sulfate khi ngâm VLC (n=3) ở
các môi trường...........................................................................................................20

Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK tại thời điểm 2 giờ (n=3)........21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chăm
sóc sức khoẻ, vì có khả năng tái tạo, tính tương thích sinh học, phân huỷ sinh học
của chúng. Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên là vật liệu
Cellulose vi khuẩn (VLC), đã được các nhà khoa học trong và nước ngoài nghiên
cứu. Vật liệu cellulose là một loại vật liệu mới, đã được ứng dụng trong các lĩnh
vực như y học, hoá mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm,... Theo nhiều kết quả nghiên
cứu cho thấy màng cellulose vi khuẩn được tạo ra từ các nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền
như nước vo gạo, nước dừa già có thể thực hiện được trên quy mô lớn so với các
vật liệu Cellulose khác thì VLC được tạo ra từ vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn, có
khả năng phân huỷ sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, màng
cellulose vi khuẩn còn có độ bền tinh thể cao, khả năng đàn hồi tốt, khối lượng thấp
và kích thước ổn định; VLC có cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano nên nó có khả
năng hút và giữ nước tốt, có tính xốp, độ ẩm cao và giải phóng nước kéo dài. Vì
vậy VLC đã được dùng làm vật liệu hấp thụ và giải phóng thuốc qua nhiều con
đường khác nhau như da, đường uống và ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học…[4],
[6], [10].
Ngày nay khi nền công nghiệp ngày càng phát triển, dẫn đến môi trường
ngày càng ô nhiễm thì các bệnh liên quan về da cũng xuất hiện ngày càng nhiều,
như các bệnh viêm da do dị ứng, viêm da do nhiễm trùng, hay nhiễm trùng đường
tiêu hoá. Để chữa các bệnh này thì thường dùng các loại thuốc kháng sinh trong đó
có neomycin sulfate.
Neomycin sulfate là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycosid, có tác dụng
với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn
ngoài da. Chế phẩm của Neomycin sulfate như dưới dạng viên nén, dung dịch uống,
dịch nhỏ mắt, nhỏ tai, mỡ tra mắt, mỡ và kem bôi ngoài da. Tuy nhiên, khi ở dạng

chế phẩm thì khả năng thẩm thấu qua da của thuốc không cao chỉ đạt 45%, thuốc
nhanh khô bề mặt; hay ở dạng dung dịch uống thì kém hấp thu qua đường tiêu hoá
97% liều uống được bài tiết ra ngoài dưới dạng không đổi [1].
Để tăng hiệu quả của Neomycin sulfate, làm giảm các nhược điểm của thuốc,
khắc phục hạn chế của neomycin sulfate thì giải pháp cần đặt ra là sử dụng vật liệu
có khả năng giữ ẩm vết thương và cản trở vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương,…
Vật liệu Cellulose (VLC) có tiềm năng như hệ thống vận chuyển và phân phối
thuốc do cấu trúc siêu mảnh và kích thước nano của nó vì vậy hệ mạng lưới cấu trúc
1


CVK được nạp Neomycin sunlfate có thể tạo hệ trị liệu phóng thích kéo dài để giảm
thiểu những tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc Neomycin sunlfate.
Từ những nghiên cứu về CVK, và đặc điểm của neomycin sulfate trong điều
trị bệnh về da, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ
thuốc Neomycin Sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong một số môi trường ”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của màng VLC lên men từ
một số môi trường ( môi trường chuẩn, môi trường nước vo gạo, môi trường
nước dừa già), để nâng cao hiệu quả chữa các bệnh về da do nhiễm khuẩn ở người
của thuốc neomycin sulfate. Tìm ra được loại vật liệu cellulose lên men từ ba loại
môi trường thì môi trường nào hấp thu thuốc cao hơn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng và xử lý màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn
(MTC), môi trường nước vo gạo (MTG), môi trường nước dừa già (MTD).
- Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK thu từ một số môi trường.
- Khảo sát so sánh sự hấp thụ thuốc neomycin sulfate của VLC thu từ 3 môi
trường.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học
Việc nghiên cứu và ứng dụng màng cellulose vi khuẩn để làm giảm tác dụng
không mong muốn của thuốc neomycin sulfate sẽ mở ra hướng đi mới [5]. Việc hạn
chế được nhược điểm của neomycin sẽ mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho
nhiều thuốc khác nhau, từ đó giúp nền y học phát triển hơn.
Từ quá trình thực hiện nghiên cứu có thể phát hiện ra ưu và nhược điểm của
VLC, từ đó sẽ tìm được cách phát huy những ưu điểm và hạn chế được nhược điểm
của màng Cellulose vi khuẩn.
Tìm ra được thời gian hấp thu thuốc Neomycin sulfate cao hơn trong ba loại
VLC.
Ý nghĩa thực tiễn
Khắc phục những nhược điểm của Neomycin sulfate như hấp thu qua da
kém, bề mặt khô nhanh,… nhờ vào việc sử dụng VLC lên men từ một số môi
trường nghiên cứu, được dùng làm vật liệu nạp thuốc Neomycin sulfate.
Có thể áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn.

2


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC)
1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose
VLC là sản phẩm thải của vi khuẩn có khả năng sinh màng thải ra trên bề mặt
môi trường nuôi cấy như những loài thuộc chi Acetobacter, Achromobacter,
Gluconacetobarter, Rhizobium, trong đó có chi Gluconacetobacter xylinus tạo
cellulose hiệu quả nhất. Các giống vi khuẩn trong chi Acetobacter trước đây được
dùng để lên men thu màng Cellulose vi khuẩn đều được chuyển sang chi
Gluconacetobacter dựa trên nghiên cứu trình tự gen 16S rARN và đặc tính sinh
màng của nó [6].

Giống vi khuẩn G. xylinus sử dụng được mua giống từ Nhật Bản.
1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus
Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, để nuôi cấy
được G. xylinus cần cung cấp các nhân tố sinh trưởng, các vitamin cho sự phát triển
của chúng [7]. Môi trường nuôi cấy G. xylinus là các môi trường tổng hợp và bán
tổng hợp như môi trường cao nấm men (MTC), môi trường nước dừa già và môi
trường nước vo gạo. Các môi trường trên là những môi trường có đầy đủ chất hữu
cơ cần thiết như cacbon hiđrat, protêin, lipit,…các chất vô cơ chứa các nguyên tố vi
lượng như Zn, Mn, Fe, Cu, Mn, P, S,… các chất hữu cơ khác như axit amin,
vitamin,… thích hợp cho nuôi cấy G.xylinus. Thành phần dinh dưỡng của 3 loại
môi trường trên được trình bày ở Bảng 1.1, 1.2, 1.3.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21]
Thành phần
Hàm lượng trong 100 g
Prôtêin

24 g

Cacbohyđrat

20 g

Vitamin B12

0,5 µg

Các nguyên tố vi lượng

Fe (4 mg), Mg (180 mg), Ca (67 mg), Kali (2,1
mg)

1,6 g

Đường

Thành phần dinh dưỡng có trong cao nấm men thích hợp cho sự nuôi cấy vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
Nhu cầu sử dụng đường của G. xylinus là rất lớn giữ vai trò quan trọng trong
quá trình tạo màng, trong khi đó môi trường nước dừa già có hàm lượng đường khá
lớn thích hợp cho nuôi cấy G. xylinus [9].
3


Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10]
Thành phần
Hàm lượng
Nước

94,99%

Prôtêin

7,2%

Chất béo

0,2%

Cacbohyđrat

3,17%

Đường

2,16%

Vitamin B6

0,032 (mg/100 g)

Vitamin C

7,68 mg/l

Canxi

24 mg/100 g

Magie, Sắt

25 mg/100 g, 0,29 mg/100 g

Phot pho, Kali

0,29 mg/100 g; 250 mg/100 g

Đồng, Mangan, Selen

0,04 mg/100 g; 0,142 mg/100 g; 1 mg/100 g

Thành phần dinh dưỡng có trong nước dừa già có chứa nhiều khoáng chất,

các chất hữu cơ thiết yếu cần cho chu trình sống của G. xylinus để tạo vật liệu
Cellulose vi khuẩn.
Ngoài ra, nước vo gạo cũng được dùng để nuôi cấy G. xylinus vì trong nước
vo gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, đường, nhiều loại vitamin nhóm
B, acid amin, và khoáng chất phù hợp với sự nuôi cấy G. xylinus. Thành phần các
chất dinh dưỡng có trong nước vo gạo được trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần
Hàm lượng
Protein

15,7%

Đường

2%

Sắt

7% -8%

Kẽm

12% - 13%

Acid amin

Leucine, Valine, Lysine

Vitamin nhóm B (B1,B2,B5,B6)

30% -60%

Trong vòng ba tiếng sau khi vo, nước vo gạo phải được sử dụng, không sử
dụng nước đã để quá lâu có mùi chua, vì các chất dinh dưỡng có trong nước gạo đã
mất, dẫn đến hiệu quả nuôi vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus kém.

4


1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mảnh, đường kính sơi nhỏ hơn đường
kính của cellulose thực vật, và các sợi nhân tạo khác được tổng hợp hoá học.
Cellulose vi khuẩn là một polyme không phân nhánh gồm các gốc glucopyranose
nối với nhau bằng liên kết β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản đã cho thấy cấu trúc của
Cellulose vi khuẩn giống cấu trúc cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau
về cấu trúc cao phân tử và một số đặc tính [14]. Theo AJ. Brown (1886) Cellulose vi
khuẩn được cấu tạo từ các sợi sơ cấp (subfibril) là những sợi mảnh nhất đường kính
1,5 nm, có nguồn gốc tự nhiên, các sợi này lại kết hợp với nhau thành các vi sợi
(microfibril), các vi sợi tập hợp thành bó (bundle), cuối cùng tạo thành các dải
(rinbon), mỗi dải dài khoảng 100 nm, rộng 3 – 8 nm [3,9].

Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn
Một số tính chất của Cellulose vi khuẩn như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ
học, độ bền hoá học cao, có khả năng giữ nước, giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới
cellulose, có thể bị thủy phân bởi enzyme, có thể tái chế và dễ dàng bị một số nhóm
vi sinh vật phân huỷ, thân thiện với môi trường, an toàn sinh học... Màng Cellulose
vi khuẩn đã được công nhận là an toàn bởi FAD (Park et al. 2009; Ullahet al. 2016a),
và nó đã được sử dụng làm phụ gia thực phẩm (Khan etal. 2007) [20]. Ngoài ra,
màng cellulose vi khuẩn còn được sử dụng để làm mặt nạ dưỡng da,... từ những

nghiên cứu trên đã xác nhận màng Cellulose vi khuẩn là an toàn và phù hợp để sử
dụng trong các công thức thuốc, và được sử dụng như để phân phối thuốc là nguyên
liệu cho y sinh và dược phẩm [18]. Trong y học, VLC thu được từ điều kiện nuôi
cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo để điều trị vết thương lớn do
bỏng, làm mạch máu nhân tạo, sử dụng trong nha khoa. Ở Philipines, màng
Cellulose vi khuẩn được dùng nhiều trong thực phẩm, bao gồm BC gel, và được tiêu
thụ như một món tráng miệng truyền thống ở đây [15]. Trường Đại học Y dược
Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng VLC có tẩm dầu mù u làm màng
trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy VLC giúp vết thương nhanh lành
và làm giảm sự nhiễm trùng vết thương
5


do các yếu tố ngoài môi trường gây ra [7]. Ngoài ra, VLC còn được sử dụng như vật
liệu thay thế gạc thông thường trong băng bó vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô,
cơ quan [10].
1.2.

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu
nạp thuốc
1.2.1. Trên thế giới
Celllose vi khuẩn có tính chất hút nước và giữ nước cao, độ tinh khiết cao,
tính an toàn cao và cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano, nên nó được sử dụng để vận
chuyển và phân phối thuốc đến vết thương.
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng nạp thuốc của
màng Cellulose vi khuẩn, như nghiên cứu của tác giả Hanif Ullah và Cs (2017) [19];
đã nghiên cứu và chế tạo vỏ nang bao thuốc từ màng Cellulose vi khuẩn thay cho vỏ
nang bao thuốc thông thường bằng gelatin; nghiên cứu này chỉ ra VLC có khả năng
cản khuẩn để tránh sự nhiễm trùng từ bên ngoài, làm giảm đau, giúp vết thương mau
lành, giảm sự hình thành sẹo, giúp cho việc tháo ra, kiểm tra vết thương một cách dễ

dàng ( Cazaja et al (2006)). Ngoài ra, VLC không làm mất độ ẩm của da, tránh tình
trạng da bị khô đối với những vết thương lớn, rộng, nhiễm trùng trên da.
Muhammad Mustafa Abern và Cs (2014) đã có nghiên cứu đánh giá về hệ
thống phân phối thuốc dựa trên màng cellulose vi khuẩn, kết quả của nghiên cứu cho
thấy VLC có tính linh hoạt và tiềm năng của nó đối với điều trị tại chỗ, đúng vị trí bị
bệnh, một trong những ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn trong dược phẩm và y
sinh đó là nó được áp dụng chủ yếu cho các công thức qua da để cải thiện kết quả
lâm sàng [17].
Các đánh giá của các tác giả trên cho thấy tính khả thi và lợi ích tiềm năng
lớn của VLC trong việc phát triển hệ thống phân phối thuốc của nhiều loại thuốc
khác nhau.
1.2.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam tác giả Đinh Thị Kim Nhung và Cs đã tiến hành nuôi cấy màng
Cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng trên thỏ. Kết quả
nghiên cứu cho thấy màng Cellulose vi khuẩn dùng để băng vết thương có tỉ lệ lành
vết thương cao hơn so với dùng gạc có tẩm các chất có hoạt tính tương ứng, màng
CVK làm giảm hiện tượng nhiễm trùng, hoại tử vết thương, so với việc bôi trực tiếp
kem nghệ và tinh dầu mù u lên vết thương [6]. Tác giả Nguyễn Văn Thanh (2006),
“Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum” đã tạo ra
được màng trị bỏng từ
6


màng Cellulose tinh chế có tẩm tinh dầu mù u, kháng khuẩn tốt hơn so với gạc thông
thường, khả năng lành vết thương nhanh hơn.
Kết quả nghiên cứu của các tác giả trên cho thấy tiềm năng của VLC trong
việc sử dụng màng Cellulose vi khuẩn như hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc.
Đây cũng là một hướng trong nghiên cứu sử dụng VLC để hấp thu thuốc neomycin
sulfate nhằm hạn chế những tác dụng phụ không mong muốn của thuốc đối với cơ
thể.

1.3.

Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate
Neomycin sunlfate là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside.
Neomycin sulfate có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương
gây nên các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da.
1.3.1. Công thức
Công thức phân tử:C23H46N6O13.xH2SO4. Khối lượng phân tử: 712,72 g/mol

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1]
1.3.2. Tính chất lí hoá
Ở dạng tinh khiết, neomycin sulfate có màu trắng hoặc trắng ngà, hút ẩm, tan
dễ trong nước, khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton. Quang phổ hấp
thụ cực đại của neomycin sulfate ở bước sóng Abs 277 nm. Các chế phẩm của thuốc
ở dạng viên nén, dung dịch, kem bôi da, để tiến hành định tính neomycin sulfate
trong các chế phẩm dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng [1].
1.3.3. Dược lý và dược động học
Neomycin sulfate là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có tác
dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm
khuẩn ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin như: Staphylococcus

7


aureus, Escherichia coli,
dụng với

Klebsiella, Enterobacter, Neomycin không có tác

8

Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus bao gồm cả Streptococcus pneumonia hoặc
Streptococcus tan máu.
* Cơ chế tác dụng: Neomycin là chất ưa nước, tan trong nước, thuộc nhóm
kháng sinh aminoglycoside. Cơ chế tác dụng là ức chế quá trình tổng hợp protein
của vi khuẩn, bằng cách liên kết với tiểu đơn vị 30S của Ribosome của vi khuẩn,
làm đọc sai thông tin của t-ARN, làm cho vi khuẩn không thể tổng hợp được các
protein quan trọng đối với sự phát triển của nó. Ngoài ra, còn làm tách các
polysomes thành các monosome phi chức năng [1,13].
* Dược động học: Neomycin được hấp thu kém qua đường tiêu hoá, khảng
97% liều uống được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3 g, nồng
độ huyết thanh đạt được 4 microgam/ml và khi thụt sự hấp thu cũng tương tự. Hấp
thu thuốc có thể tăng lên khi niêm mạc bị viêm hoặc bị tổn thương. Khi thuốc đã
được hấp thu, nó sẽ giải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt tính. Thời gian bán thải
của Neomycin khoảng 2-3 giờ [2].
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
Neomycin sulfate được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da,
tai và mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm với neomycin sulfate. Thuốc
còn được chỉ định để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật và làm giảm vi
khuẩn NH3 trong ruột khi bị hôn mê gan. Không được sử dụng neomycin sulfate
qua đường tiêm hoặc toàn thân, tránh sử dụng thuốc quá lâu tại một chỗ vì với liều
lượng cao vì thuốc có thể gây khô da, khiến da dễ mẫn cảm, và gây ra hiện tượng
kháng chéo với các thuốc thuộc nhóm kháng sinh aminoglycosid khác [1-2].
1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về Neomycin sulfate như: Amita H.
Patel, và Riddhi M. Dave, có công trình xác định và đánh giá sự giải phóng bền
vững của Neomycin sulfate trong Situophthalmic gel, thuốc có khả năng kháng
khuẩn tốt trong hệ thống gelling tại chỗ [12]. Ngoài ra nghiên cứu Blanchard C.

(2015) [16] cho rằng khi có sự phối hợp giữa neomycin và sulfate thì ít gây dị ứng
cho da hơn khi chỉ có neomycin đơn thuần.
Bên cạnh đó, Anjali, D. V. Gowda, Gowrav M. P., Atul Srivastava and Riyaz
Ali M. Osmani (2016), đã nghiên cứu về các hạt nano Chitosan chứa Neomycin
sulfate để chữa các vết thương, chỉ ra rằng các polyme tự nhiên được sử dụng làm
vật liệu để phân phối thuốc và điều trị các bệnh khác nhau. Sự kết hợp giữa
Neomycin sulfate và các sợi nano trong cấu trúc của polyme tự nhiên đã cải thiện
được nhược
9


điểm của Neomycin sulfate, làm vết thương nhanh lành so với việc chỉ sử dụng kem
neomycin đơn thuần [13].
1.4.2. Tại Việt Nam
Neomycin sulfate là một loại thuốc thiết yếu có trong “Danh mục thuốc tân
dược thiết yếu lần thứ” được bộ y tế chỉnh sửa và ban hành năm 2009 [2]. Chế
phẩm của neomycin như dạng viên nén, dạng kem bôi da, thuốc nhỏ mắt.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp
thuốc và vận chuyển thuốc đang còn khá mới. Các nghiên cứu về màng Cellulose vi
khuẩn hầu như chỉ dừng lại ở điều kiện phòng thí nghiệm, việc sản xuất màng CVK
với quy mô lớn chưa nhiều.
Trong những năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu về màng cellulose vi
khuẩn làm vật liệu mang thuốc, đã có nghiên cứu về thuốc Neomycin sulfate nhưng
cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu chưa ứng dụng được vào trong thực tế.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu:
Khả năng hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của VLC (tạo ra từ các môi trường
nuôi cấy khác nhau).
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu
* Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở phòng thí nghiệm.
* Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetobarter xylinus lên men tạo vật liệu Cellulose,
được mua tại Nhật Bản
2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: nước dừa già, nước vo gạo, nước cất hai lần, cao nấm men.
Hóa chất:
- Thuốc Neomycin sulfate dạng tinh khiết.
- Vật liệu Cellulose (99% là nước) được thu nhận từ việc nuôi cấy
gluconacetobacter trong các môi trường nuôi cấy khác nhau.
- Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali
đihidrophotphat, axit clohidric,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.3.3. Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản).
- Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ)
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu,…
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường
Bước 1: Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy G. xylinus như Bảng 2.1
MT1: Môi trường chuẩn (MTC); MT2: môi trường nước già (MTD); MT3: môi
trường nước vo gạo (MTG).

11


Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose
Môi trường
Thành phần
MTC
MTD
Glucose
20 g
30 g
Pepton
Diamoni photphat khan

5g

0,5 g

0,5 g

0,3 g

0,3 g

1,5 g

Nước dừa già

1000 ml

Nước vo gạo
Nước cất 2 lần

10 g

5g

Diamoni photphat
Acid citric

10 g

2,7 g

Amoni sulfat
Cao nấm men

MTG
30 g

1000 ml
1000 ml

Môi trường ở sau khi pha được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút. Sau khi
hấp môi trường xong, đưa môi trường vào buồng cấy và khử trùng bằng tia UV
trong
15 phút.
Bước 2: Đưa các môi trường vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1130C trong 15 phút.
Bước 3: Vệ sinh buồng cấy bằng cồn 700, sau đó tiến hành khử trùng buồng cấy

bằng tia UV trong 30 phút.
Bước 4: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút, để nguội môi
trường.
Bước 5: Thêm 20-25% dịch giống, lắc đều tay cho dịch giống phân bố đều.
Bước 6: Dùng gạc vô trùng bịt kín miệng bình, nuôi cấy tĩnh trong thời gian 5 -14
ngày ở nhiệt độ 260C.
Bước 7: Thu màng CVK thô, rửa sạch dưới vòi nước.
2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc.
Mục đích: Đảm bảo không còn tồn dư các chất hoá học của môi trường nuôi
cấy trong VLC, phá huỷ thành tế bào và các độc tố của vi khuẩn.
Phương pháp:
Màng Cellulose vi khuẩn thô sau khi thu được từ một số môi trường, màng có
màu vàng, ép vật liệu loại bỏ môi trường.
Trong vật liệu Cellulose thô có chứa nhiều vi khuẩn, nên cần hấp khử trùng
màng trong NaOH nóng 3% ở 113°C trong 15 phút, làm cho thành tế bào của vi
khuẩn bị vỡ và giải phóng độc tố của vi khuẩn.
12


Màng Cellulose vi khuẩn sau khi ngâm màng trong NaOH nóng, lấy màng ra
và xả dưới vòi nước chảy cho đến khi màng chuyển thành màu trắng trong. Kiểm tra
pH bề mặt của vật liệu CVK bằng quỳ tím, bề mặt vật liệu cần đạt pH trung tính thì
thu được VLC tinh khiết.
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC
Mục đích: Đảm bảo VLC không còn các tạp chất có thể gây độc. Tạp chất
được khảo sát là D – glucose.
Tìm sự có mặt của glucose trong màng Cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của D – glucose bằng thuốc thử Fehling mới pha,
kết quả nếu xuất hiện kết tủa nâu đỏ chứng tỏ VLC còn D – glucose.
Tiến hành:

Mẫu thử: Màng Cellulose vi khuẩn được tạo ra từ một số môi trường đã được
xử lý bằng hoá học
Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
Nhỏ vào ống nghiệm đựng mẫu thử 1 ml thuốc thử Fehling rồi ngâm trong
cốc
nước nóng.
Quan sát kết quả.
Vật liệu Cellulose vi khuẩn dùng để hấp thụ thuốc neomycin sulfate phải đạt
được những tính chất sau: mềm mại, độ đàn hồi tốt, mỏng, che phủ tốt, bám tốt trên
bề mặt da, cản khuẩn tốt. VLC phải có độ ẩm thích hợp, hút nước và dịch mô tốt,
và pH phải trong khoảng trung tính.
2.4.4. Chế tạo VLC hấp thụ neomycin sulfate
2.4.4.1. Chuẩn bị bộ đệm
Chuẩn bị môi trường đệm Photphat buffered saline (PBS) [7] với thành phần và cách
pha được trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4
Hoá chất
Cách pha
Thành phần

Khối lượng

NaCl

0,8 g

KCl

0,2 g

Na2HPO4.12H2O

1,44 g

Na2HPO4

0,22 g

Cân và cho hoá chất vào cốc đong.
Thên nước cất đến mức 800 ml.
Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCl.
Bổ sung nước tới 1000 ml.

2.4.4.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate.

13


Phương pháp xây dựng đường chuẩn: Dùng máy quét quang phổ UV2450, để đo mật độ quang của neomycin sulfate, ở các nồng độ khác nhau tối thiểu
là 6 nồng độ: 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,3 mg
/ml.
Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis để
ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Neomycin sulfate.
Chuẩn bị 6 mẫu có chứa neomycin sulfate với các nồng độ khác nhau như trên
Sử dụng dung dịch đệm PBS (pH =7,4) làm dung môi.
Đo mật độ quang phổ của các mẫu dung dịch ở bước sóng Abs 277 nm. Tiến hành
đo 3 lần lấy giá trị OD trung bình dựng đường chuẩn
Tiến hành dựng phương trình đường chuẩn bằng Microsoft Excel 2010.
2.4.5.Phương pháp xác định lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ vào màng
Cellulose vi khuẩn.

Vật liệu Cellulose nạp thuốc được tạo ra từ ba môi trường: MTC, MTD,
MTG. Sử dụng VLC có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm để nạp Neomycin sulfate.
Màng Cellulose vi khuẩn ướt sau khi tinh chế được loại bỏ 60% nước, ngâm
ngập trong 100 ml dung dịch chứa thuốc Neomycin sulfate, sử dụng dung môi là
dung dịch đệm PBS (pH = 7,4), rung động ở 180 vòng/phút và 400C trong 1 giờ; 1,5
giờ; 2 giờ, đảm bảo VLC nạp thuốc tối đa. Lấy VLC đã nạp thuốc cho vào bao
nilon, hàn bao nilon và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh.
Chuẩn bị 6 bình tam giác, mỗi bình chứa 100 ml dung dịch Neomycin
sulfate, nồng độ 2mg/ml (dung môi là dung dịch đệm PBS).
Bình 1,2,3: Cho màng CVK có độ dày 0,3 cm
Bình 3,4,5: Cho màng CVK có độ dày 0,5 cm
Hấp thụ thuốc Neomycin của VLC ở điều kiện rung động 180 vòng/phút ở
400C.
Sau 1 giờ, 1,5h, 2 giờ, lấy 3 µl dung dịch trong mỗi bình thí nghiệm pha loãng
bằng dung dịch đệm PBS với tỷ lệ hợp lý (dùng tỷ lệ như đã xây dựng đường
chuẩn), dùng máy UV – Vis để đo quang phổ xác định lượng thuốc hấp thụ vào
màng cho đến khi giá trị OD không đổi, lấy giá trị OD thay vào phương trình đường
chuẩn, tính được khối lượng thuốc hấp thụ vào màng. Tiến hành thực hiện thí
nghiệm 3 lần lấy kết quả OD trung bình để tính toán lượng thuốc neomycin sulfate
đã được VLC hấp thụ, ta lấy giá trị OD trung bình đo được thay vào phương trình
đường chuẩn. Lượng thuốc hấp thụ vào các VLC được tính theo công thức [11]:
mht = m1 – m2 (mg) (1)
Trong đó:
14


mht: Khối lượng thuốc Neomycin sulfate đã hấp thụ vào màng
m1: Khối lượng thuốc Neomycin sulfate ban đầu trong dung dịch
m2: Khối lượng thuốc Neomycin sulfate sau khi màng hấp thu thuốc
Hiệu suất thuốc nạp vào màng được tính theo công thức:

EE(%) = mht /m0 × 100% (2)
Trong đó:
EE (%): Hiệu quả hấp thu thuốc neomycin sulfate của màng CVK
mht (mg/cm3): Khối lượng thuốc hấp thu trong 1 đơn vị thể tích màng
m0 (mg/cm3): Khối lượng thuốc có trong một đơn vị thể tích dung dịch ban đầu
2.4.6. Xử lý thống kê
Xử lý số liệu thông qua phần mềm kiểm định giả thuyết t – Test: Two Sample
Assuming Unequal Variances, Excel 2010.
Các kết quả nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch
chuẩn. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn 0,05,
hoặc | t Stat | > t Critical two-tail.


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4)
Sau khi tiến hành đo mật đo mật độ quang hấp thụ của neomycin sulfate ở
Abs
277 nm bằng máy đo UV – 2450 ( Shimadzu – Nhật Bản ) tại Phòng thí nghiệm
Viện NCKH & UD Trường ĐHSP Hà Nội 2, lấy kết quả trung bình của 3 lần đo,
dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate bằng phần mền Excel.
Kết quả đo OD của dung dịch thuốc neomycin sulfste ở các nồng độ khác
nhau, được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng giá trị đo OD trung bình của dung dịch thuốc NS ở các nồng độ
Nồng độ
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3

(mg/ml)
Giá trị
OD(trung
bình)

0,0049

0,013

0,021

0,029

0,037

0,044

±0,0001

±0,001

±0,0015

±0,001

±0,002

±0,012

Từ giá trị OD trung bình thu được ở bảng 3.1 tiến hành dựng phương trình

đường chuẩn của neomycin sulfate bằng phần mền Exel 2010, cho kết quả phương
trình đường chuẩn của neomycin sulfate hình 3.1 là:
Phương trình đường chuẩn: y = 0,1574x – 0,0027 (R2 = 0,9995)
Trong đó x: nồng độ neomycin sulfate (mg/ml)
y: mật độ hấp thụ thuốc tại OD 277 nm
R2 hệ số tương quan bình phương
Mật độ hấp thụ OD 277 nm

OD277nm
0.05

y = 0.1574x - 0.0027
R² = 0.9995

0.04
0.03
0.02

OD277nm

0.01

Linear (OD277nm)

0
0

0.1

0.2

0.3

0.4

Nồng độ thuốc Neomycin sulfate (mg/ml)

Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong môi trường
PBS (pH = 7,4).