Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sufate tạo ra từ gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

TRẦN THỊ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

TRẦN THỊ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS. Hà Thị Minh Tâm

HÀ NỘI, 2019


LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Hà Thị Minh Tâm cô đã luôn
quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận với đề
tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose
nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số
môi trường.”
Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường ĐHSP Hà Nội
2, cùng thầy cô giáo làm việc tại Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng- Trường
Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, các bạn sinh viên đã truyền đạt kiến thức và tạo điều
kiện cho em để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, em xin cảm ơn người thân và bạn bè đã giúp đỡ em trong quá trình
học tập và nghiên cứu khoa học.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thùy Trang

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung được trình bày trong khóa luận không sao chép
hay trùng lặp ở đề tài khóa luận nào. Kết quả, số liệu được nghiên cứu và thu được từ
thực nghiệm được em xử lý thống kê, đảm bảo tính trung thực và chưa được công bố
trong công trình khoa học hoặc tạo chí chuyên ngành hay các hội thảo khoa học, sách
chuyên khảo,… nào khác. Em có tham khảo một số tài liệu của các tác giả để hoàn
thành đề tài khóa luận của mình.
Nếu lời cam đoan sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 5

năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Thùy Trang


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

1

CVK

Màng cellulose khuẩn

2

CNM

Cao nấm men

3

ĐHSP

Đại học sư phạm

4

KTNN

Kỹ thuật nông nghiệp

5

NS

Neomycin sulfate

6

PBS

Phosphate buffered saline

7

NCKH & CGCN

8

MT1

Môi trường 1

9

MT2

Môi trường 2

10

MT3

Môi trường 3

11

G.xylinus

Glyconacetobacter xylinus

Nghiên cứu khoa học và chuyển giao
công nghệ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài..................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu........................................................................2
4. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................3
NỘI DUNG .............................................................................................................4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gluconacetobacter xylinus................................................................................4
1.1.1. Vị trí phân loại...............................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus ........................................................................4
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G. xylinus .................................................4
1.1.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus............................................5
1.2. Neomycin Sulfate .............................................................................................6
1.3. Lịch sử nghiên cứu đề tài..................................................................................7
1.3.1. Tình hình trong nước .....................................................................................7
1.3.2. Tình hình trên thế giới ...................................................................................8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................9
2.1. Vật liệu nghiên cứu...........................................................................................9
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................9
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất.................................................................................9
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................9
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................10

2.2.1. Chuẩn bị màng CVK....................................................................................10
2.2.1.1. Lên men thu màng CVK thô .....................................................................10
2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh chế ...........................................................................11


2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK tinh chế ...............................................11
2.2.1.4. Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4)...............................11
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành .......................................12
2.2.4. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ........................12
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS........................................................13
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết
kế ..........................................................................................................................14
2.2.7. Phương pháp xử lí thống kê .........................................................................15
2.3. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................15
2.4. Cách bố trí thí nghiệm ....................................................................................15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................16
3.1. Thu màng CVK và tinh chế màng...................................................................16
3.1.1. Thu màng CVK từ các môi trường lên men .................................................16
3.1.2. Quá trình xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc.....................................17
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK thích hợp..................17
3.1.2. Tinh chế màng CVK ....................................................................................18
3.1.3. Xác định lượng thuốc giải phóng của các màng CVK ..................................18
3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK .....................................................19
3.2.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men ............................................19
3.2.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già ............................................23
3.2.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo .............................................25
3.3. So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau trong
cùng 24 giờ tại pH=6,8 ..........................................................................................27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Hình 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK..........................................................11
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của NS trong môi trường PBS (pH=7,4) ......12
Hình 3.1. Nuôi màng CVK tại Phòng thí nghiệm Trung tâm NCKH&CGCN trường
ĐHSP Hà Nội 2. ....................................................................................................16
Hình 3.2. Môi trường dinh dưỡng lên men thu màng .............................................16
Hình 3.3. Màng CVK xả dưới vòi nước .................................................................17
Hình 3.4. Màng CVK tinh chế ..............................................................................18
Hình 3.5. Mẫu được rút ra để đo quang phổ lúc 8 giờ ............................................19
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chuẩn ở các pH và
thời gian khác nhau ...............................................................................................22
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng nước dừa già ở các
pH và thời gian khác nhau .....................................................................................24
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng nước vo gạo ở các
pH và thời gian khác nhau .....................................................................................27
Hình 3.9: Tỷ lệ (%) giải phóng thuốc từ các màng CVK ở các độ dày khác nhau cùng
24 giờ tại pH = 6,8.................................................................................................28


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần môi trường chuẩn .................................................................5
Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo .......................................................6
Bảng 1.3: Thành phần nước dừa già ........................................................................6
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường thu màng CVK...........................................10
Bảng 2.2. Môi trường đệm với pH=2; pH=4,5; pH=6,8 .........................................13
Bảng 3.2. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường chuẩn
pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) .................................................20
Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3

cm và 0,5 cm trong môi trường chuẩn có pH và thời gian khác nhau (n=3) ...........21
Bảng 3.4. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước
dừa già pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) .....................................23
Bảng 3.5. Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3
cm và 0,5 cm trong môi trường nước dừa già có pH và thời gian khác nhau (n=3) 24
Bảng 3.6. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước
vo gạo pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) ......................................25
Bảng 3.7. Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3
cm và 0,5 cm trong môi trường nước vo gạo có pH và thời gian khác nhau (n=3)..26
Bảng 3.8. Tỷ lệ (%) giải phóng thuốc từ các màng CVK dày 0,3 cm và 0,5 cm trong
cùng 24 giờ tại pH = 6,8 ........................................................................................27


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài

1


Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại
thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt. Chúng được tìm thấy trong
phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman Waksman vào năm 1945 . Neomycin
thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside chứa hai hoặc nhiều đường amino liên kết
với nhau bằng liên kết glycosidic [1].
Thuốc Neomycin thường được dùng dưới dạng thuốc bôi (Neosporin). Khi
neomycin kết hợp với thuốc khác có thể được dùng để uống. Neomycin không được
hấp thụ qua đường tiêu hóa và được sử dụng dự phòng cho bệnh não gan và tăng
cholesterol máu. Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh này giúp
giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan. Chúng hoạt động để tiêu diệt vi
khuẩn kháng streptomycin, kể cả trong trường hợp các vi khuẩn lao. Thuốc này cũng

đã được sử dụng để điều trị sự phát triển quá mức của các vi khuẩn ruột non. Chúng
không được tiêm, vì neomycin cực kỳ độc thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi
so sánh với các aminoglycosid khác . Ngoại lệ là khi neomycin được tích hợp, với
lượng rất nhỏ, như một chất bảo quản trong một số vaccine-thường là 25 μg mỗi liều.
Thuốc này được sử dụng để làm giảm nguy cơ nhiễm trùng sau khi phẫu thuật
đường ruột. Neomycin thuộc nhóm thuốc kháng sinh aminoglycoside. Nó hoạt động
bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột. Neomycin cũng có thể
được sử dụng kết hợp với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị một vấn đề nghiêm
trọng trong não (bệnh não gan). Tình trạng này được gây ra do sự tạo thành quá
nhiều một vài chất tự nhiên (amoniac). Thông thường, gan sẽ đào thải amoniac,
nhưng bệnh gan có thể tạo ra quá nhiều amoniac bện trong cơ thể. Thuốc này giúp
điều trị bệnh não bằng cách giết chết các vi khuẩn đường ruột nhất định tạo ra
amoniac [5].
Thuốc này chỉ điều trị chứng nhiễm khuẩn. Thuốc sẽ không hiệu quả cho
chứng nhiễm virus (như cảm lạnh thông thường, cúm). Việc sử dụng không cần
thiết hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc.
Cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu trúc
hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt
như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết
cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu,...[7]. Vì vậy, CVK

2


được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, môi trường, mỹ
phẩm, công nghiệp và nhiều lĩnh vực khác.
Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ
thuốc có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc neomycin sulfate trong điều
trị bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải
phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sulfate tạo ra từ

Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường”.

2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình chế tạo màng.
- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Neomycin
sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: “So sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường.”
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK từ môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo
gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ một số môi trường: môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo
gạo.
- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc qua màng CVK.
- Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Neomycin sufate từ màng CVK đã
nạp thuốc trong môi trường pH khác nhau.

3


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
- Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate
trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí
- Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của
màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả

màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh
vực khác nhau. Nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của
màng CVK, tìm ra được môi trường tạo ra màng CVK có khả năng nạp thuốc và
giải phóng kéo dài.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình tạo màng CVK.
- Từ màng CVK đã được tạo ra ở một số môi trường được dùng để so sánh khả năng
giải phóng thuốc nhằm xây dựng hệ thống giải phóng thuốc kéo dài, có thể làm tăng
khả dụng sinh học của thuốc.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gluconacetobacter xylinus
1.1.1. Vị trí phân loại
G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae.
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.[8]
Theo khóa phân loại của Bergey, G.xylinus thuộc:
•

Lớp: Schizomycetes

•

Bộ: Pseudomonadales

•

Bộ phụ: Pseudomonadieae

•

Họ: Pseudomonadaceae

1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus
G.xylinus có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng 0,60,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động,
sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi
trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh
hoặc không phân nhánh[9].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5 mm, tròn, rìa mép trơn, có
màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô
dần.
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G. xylinus
G.xylinus là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển
từ 25 – 300C. Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ thích hợp
nhất là 250 C. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối ưu để sản xuất
cellulose là 5,5.
G.xylinus sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho
hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp
hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8,9].
4


Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung
acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa

thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48 giờ lớp
màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus
Môi trường nuôi cấy G.xylinus là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng
trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường của G.xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các
sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già,
nước mía, nước vo gạo,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy G.xylinus. Trong đó có
thể sử dụng cả nước cất làm môi trường chuẩn và đây được xem là môi trường kinh
điển trong nuôi cấy G.xylinus.[9]
Bảng 1.1. Thành phần môi trường chuẩn:
Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g

Pepton

5g

Diamoni photphat

2,7 g

Cao nấm men

5g

Acid citric

1,5 g

Acid acetic

2%

Nước cất 2 lần

1000 ml

Dịch giống

10%

5


Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo
Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sulfat

0,5 g

Nước vo gạo

1000 ml

Bảng 1.3: Thành phần nước dừa già

Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g

Pepton

10 g

Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sulfat

0,5 g

Nước dừa già

1000 ml

1.2. Neomycin Sulfate
Tên quốc tế: Neomycin Sulfate
Loại thuốc: Là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh nhóm aminoglycoside
Công thức hóa học: C23H46N6O13.XH2SO4

Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại
6


thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt. Neomycin được phát hiện từ
năm 1949. Chúng được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman
Waksman. Neomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside có chứa hai hoặc
nhiều đường amino liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic [11].
Neomycin thường được sử dụng như dưới dạng thuốc bôi tại chỗ, chẳng hạn
như Neosporin. Chúng cũng có thể được uống, nếu dùng theo cách này thì neomycin
thường được kết hợp với các thuốc kháng sinh khác. Neomycin không được hấp thụ
qua đường tiêu hóa và được sử dụng như một biện pháp dự phòng cho bệnh não gan

và tăng cholesterol máu. Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh
này giúp giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan, đặc biệt là trước khi
phẫu thuật GI. Chúng hoạt động để tiêu diệt vi khuẩn kháng streptomycin, kể cả
trong trường hợp các vi khuẩn lao. Thuốc này cũng đã được sử dụng để điều trị
sự phát triển quá mức của các vi khuẩn ruột non. Chúng không được tiêm, vì
neomycin cực kỳ độc thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi so sánh với các
aminoglycosid khác[12]. Ngoại lệ là khi neomycin được tích hợp, với lượng rất nhỏ,
như một chất bảo quản trong một số vaccine-thường là 25 μg mỗi liều.
Thuốc này được sử dụng để làm giảm nguy cơ nhiễm trùng sau khi phẫu
thuật đường ruột. Neomycin thuộc nhóm thuốc kháng sinh aminoglycoside. Nó hoạt
động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột. Neomycin cũng
có thể được sử dụng kết hợp với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị một vấn đề
nghiêm trọng trong não (bệnh não gan). Tình trạng này được gây ra do sự tạo thành
quá nhiều một vài chất tự nhiên (amoniac). Thông thường, gan sẽ đào thải amoniac,
nhưng bệnh gan có thể tạo ra quá nhiều amoniac bện trong cơ thể [11]. Thuốc này
giúp điều trị bệnh não bằng cách giết chết các vi khuẩn đường ruột nhất định tạo ra
amoniac.
Thuốc này chỉ điều trị chứng nhiễm khuẩn. Thuốc sẽ không hiệu quả cho
chứng nhiễm virus (như cảm lạnh thông thường, cúm). Việc sử dụng không cần thiết
hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc.
1.3. Lịch sử nghiên cứu đề tài
1.3.1. Tình hình trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng VCK còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng
dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. CVK là đối
tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở Việt Nam đòi hỏi sản xuất CVK với quy
7


mô công nghiệp, tạo CVK với độ bền chắc hơn, phát triển nhanh trong các loại môi

trường khác nhau [13].
Tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm
nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ
Acetobacter xylinum” [14].
Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate
trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí. Màng
CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành
thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo hệ thống hấp thụ thuốc
neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn.
Neomycin sulfate có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần
thứ 4 năm 1999. Neomycin sulfate được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với
một sô hoạt chất khác. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng CVK để hấp thuốc
Neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu [14].
1.3.2. Tình hình trên thế giới
Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng màng CVK trong
nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất
ổn định thực phẩm,...) lĩnh vực y học (tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân
tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da,...).

8


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp
Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất


Nguyên liệu: nước vo gạo, nước dừa già, thuốc neomycin sulfate



Hóa chất:
Các hóa chất đặc biệt như cao nấm men, pepton.
Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphat, acid acetic,
NaOH, HCl, đường glucose.

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ




Thiết bị:
-

Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

-

Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

-

Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sĩ)

-

Cân kỹ thuật - Sartorrius TE 3102 S

-

Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

-

Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

-

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

-

Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)

-

Bể ổn nhiệt (Đức)

Dụng cụ:
-

Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml

-

Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml

-

Micropipet 20-200 µl

9


-

Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu CVK có các kích thước:
10 x15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống nghiệm và các dụng
cụ hóa sinh khác.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị màng CVK
2.2.1.1. Lên men thu màng CVK thô
Môi trường lên men thu màng CVK
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường thu màng CVK
Môi trường
MT1

MT2

MT3

Glucose

20 g

30 g

30 g

Pepton

5g

10 g

10 g

2.7 g

0.3 g

0.3 g

0.5 g

0.5 g

Thành phần

Disodium phosphate
Amoni sulfat
Cao nấm men
Acid citric
Nước cất 2 lần

5g

1.5 g
1000 ml

Nước dừa già

1000 ml

Nước vo gạo

1000 ml

Các bước lên men thu màng CVK từ một số môi trường
-

Bước 1: Môi trường được chuẩn bị theo Bảng 2.1.

-

Bước 2: Các môi trường được hấp khử trùng ở 1130C trong 15 phút.

-

Bước 3: Các môi trường sau khi lấy ra sẽ được khử trùng bằng tia UV trong
15 phút và để nguội môi trường.

-

Bước 4: Thêm 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều cho giống phân bố
đều trong dung dịch.

-

Bước 5: Bịt miệng lọ bằng gạc vô trùng sau đó ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày
ở 260C.
10


-

Bước 6: Thu màng CVK thô và rửa sạch dưới vòi nước.
Chọn màng CVK có độ dày từ 0,3 - 0,5 cm làm hấp thụ và giải phóng thuốc.

2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh chế
- Sau khi màng được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem màng CVK nhúng
vào nước cất 2 ngày, sau đó lấy màng CVK đem tinh chế bằng cách rửa nhiều lần
theo quy trình ở HÌNH 2.1:

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế
Hình 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Trong màng CVK chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy, ta ngâm màng trong
NaOH 3% giúp phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố tế bào vi khuẩn.
Sau khi ngâm màng trong NaOH ta rửa nước rồi ép màng. Sau đó để trung hòa

hết NaOH ta ngâm HCl 3%.
Màng sau khi ngâm HCl thì lấy ra rửa và ngâm nước để trung hòa hết acid thì
thu được màng CVK tinh khiết.
2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK tinh chế
Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK đảm bảo màng sau khi xử lý đã được
loại các tạp chất.
2.2.1.4. Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4)
Đo mật độ quang của các nồng độ NS khác nhau bằng máy quang phổ UV_
2450 tại Phòng thí nghiệm Trung tâm NCKH&CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2, sau
11


đó xử lý bằng phần mềm Excel cho kết quả phương trình đường chuẩn của NS là
(hình 2.2): y = 0,1574x - 0,0027 (R2 = 0,9995)

OD277nm
0.05
et
0.045
fla
0.04
us
0.035
ni
c
y ) 0.03
m
l 0.025
o
en m/ 0.02

g
c m 0.015
ố ( 0.01
u
th 0.005
ộ
đ
0
g
n
0
ồ
N

y = 0.1574x - 0.0027
R² = 0.9995

O
D277nm
Linear (OD277nm)

0.1

0.2

0.3

0.4

Mật độ hấp thụ OD 277nm

Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của NS trong môi trường PBS (pH=7,4)
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành
CVK sau khi được tách khỏi môi trường, xử lý qua công đoạn hóa học thu
được CVK tinh chế. CVK tinh chế được ép áp lực, thu được khối lượng CVK tạo
thành.
2.2.4. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK
Cắt các màng CVK có đường kính 5 cm với độ dày (0,5cm và 0,3cm) tương
đối đều nhau. Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô 50% vào 2 bình tam giác có chứa
sẵn 100 ml dung dịch Neomycin 10% ( dung môi etanol 96o). Sau đó cho vào máy
rung siêu âm ở nhiệt độ 37°C, sau khoảng thời gian 1 giờ; 1,5 giờ và 2 giờ tiến hành
rút mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong
dung dịch tại thời điểm lấy mẫu, từ đó, xác định được lượng thuốc hấp thu vào các
màng CVK theo công thức:
mht = m1 – m2 (mg) (01)
Trong đó: mht : khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng.
m1: khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch (100 mg).
m2 : khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định
màng hấp thụ thuốc.
12


Tiến hành thực hiện thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình để tính toán
Hiệu suất thuốc nạp vào màng CVK được tính theo công thức [25].
EE(%) =

(Qt− Qd)

x100% (02)

Q
Trong đó: EE - Phần trăm thuốc nạp vào màng.
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS
pH được dung trong đề tài gồm: pH=2, pH = 4,5, pH=6,8.
Nghiên cứu sự giải phóng từ chế phẩm trong 3 môi
trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng :
Bảng 2.2. Môi trường đệm với pH=2; pH=4,5; pH=6,8
Hóa chất

Cách pha

Thành phần

Khối lượng

NaCl

0,8 g

KCl

0,2 g

Lấy hóa chất cho vào cốc đong. Sau đó
thêm nước cất đến 800 ml.
Dùng HCl điều chỉnh đến môi trường
đệm cần sử dụng pH=2; pH=4,5;
pH=6,8.

Na2HPO4.12H2O

1,44 g

Na2HPO4

0,22 g

Sau đó cho nước tới 1000 ml.
Khử trùng.

13


2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được
thiết kế
Khảo sát lượng thuốc được giải phóng qua màng CVK có độ dày 0,3 cm
và 0,5cm ở trạng thái ép vào bình chứa 900ml môi trường pH tương ứng.
Lượng thuốc giải phóng từ màng được tiến hành thử nghiệm ở 3 dung dịch đệm có
pH = 2, pH = 4,5 và pH = 6,8.
Sử dụng dung dịch đệm PBS theo công thức trong bảng 2.3.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, nhiệt độ 37 ± 0.5°C.
Cách tiến hành:
Sau 2 giờ nạp thuốc, ta lấy màng CVK ra khỏi môi trường nạp thuốc. Cho màng
CVK (có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm) đó vào trong các bình tam giác chứa các dung
dịch đệm lần lượt là pH = 2; pH = 4,5 và pH = 6,8.
Sau khoảng thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 24 giờ lấy mẫu
và tiến hành đo mật độ quang phổ của mẫu từ đó tính tỷ lệ thuốc giải phóng ra khỏi
các CVK.
Mẫu rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5 ml và bổ sung lại 5 ml dung dịch đệm tương
ứng.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần sau đó ta lấy giá trị trung bình. Tỷ lệ giải
phóng thuốc được tính theo công thức [20]:

���(%) =

೔೔೔೔೔೔
×೔ ା೔∑೔೔೔
೔ ೔

೔೔ ×೔೔

೔

× 100%

(3)

Trong đó:
Ct: nồng độ của NS trong môi trường đệm tại thời điểm t;
V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau;
n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng;
V2: Lượng dung dịch đệm thêm vào;
m: khối lượng thuốc hấp thu vào màng CVK.

14


2.2.7. Phương pháp xử lí thống kê
Sử dụng Excel phân tích thống kê sự khác biệt trong các tính chất xác định của
nhóm. Kết quả nghiên cứu được trình bày dạng “số trung bình ± SD”. Những khác

biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật Khoa Sinh - KTNN, Trường ĐHSP
Hà Nội 2. Viện NCKH & ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.4. Cách bố trí thí nghiệm

-

Thí nghiệm 1: Tạo màng CVK từ 3 môi trường: môi trường chuẩn, môi trường
nước dừa già, môi trường nước vo gạo.

-

Thí nghiệm 2: Từ màng CVK vừa tạo cho nạp thuốc trong 2 giờ.

-

Thí nghiệm 3: Lấy màng CVK khỏi môi trường nạp thuốc, nghiên cứu giải
phóng thuốc ở các môi trường pH khác nhau.

15