Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 5/2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
TS. CAO BÁ CƯỜNG

HÀ NỘI, 5/2019


LỜI CẢM ƠN
Thực tế luôn cho thấy, sự thành công nào cũng đều gắn liền với sự hỗ
trợ giúp đỡ của những người xung quanh dù cho sự giúp đỡ đó là ít hay nhiều,
trực tiếp hay gián tiếp. Trong thời gian làm khóa luận vừa qua em đã nhận
được sự chỉ bảo, giúp đỡ, quan tâm của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Với tấm lòng biết ơn vô cùng sâu sắc, cho phép em gửi lời cảm ơn
chân thành nhất tới TS. Cao Bá Cường, người đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo,
giúp đỡ và tạo điều kiện cho em để em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận
tốt nghiệp của mình.
Tiếp theo, em xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Khoa Sinh – KTNN, Viện NCKH & ƯD, Phòng thí nghiệm sinh lý
người và động vật, cùng các thầy, cô khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện tốt
để em hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, quan tâm, động viên
của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thu Yến


LỜI CAM ĐOAN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin cam
đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đây là công trình của bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn. Kết quả
trong khóa luận này đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thu Yến


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

BH

Berberine Hydrochloride

VLC

Vật liệu cellulose

ĐHSP

Đại học Sư phạm

MTC

Môi trường chuẩn

MTD

Môi trường dừa

MTG

Môi trường gạo

NCKH & ƯD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

OD

Optical density

UV – vis

Ultraviolet visible


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 2
NỘI DUNG.................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của vật liệu cellulose.......................... 4
1.1.1.Đặc điểm cấu trúc màng cenllulose vi khuẩn......................................... 4
1.1.2. Tính chất của vật liệu cellulose............................................................. 5
1.1.3. Ứng dụng của vật liệu cellulose............................................................ 5
1.2. Giới thiệu về thuốc Berberine Hydrochloride .......................................... 6
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 6
1.2.2. Cấu trúc ............................................................................................... 6
1.2.3. Tác dụng được lý và ứng dụng.............................................................. 7
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine Hydrochloride .......... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam................................... 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine Hydrochloride .......................... 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu0.3 vật liệu cellulose............................................ 9
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 11
2.1.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................... 11


2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 11
2.1.4. Nguyên liệu – hóa chất ....................................................................... 12
2.1.5. Môi trường lên men tạo vật liệu cellulose ........................................... 12
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 13
2.2.1. Phương pháp lên men thu vật liệu cellulose từ một số môi trường...... 13

2.2.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc................................ 13
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng ........................................................ 14
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn .................................................. 15
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu
cellulose........................................................................................................ 16
2.2.6. Phương pháp qua môi trường đệm Phosphate buffered saline
(PBS)............................................................................................................ 17
2.2.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế................................................................................................. 17
2.2.8. Phương pháp xử lý thống kê ............................................................... 18
2.2.9. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 19
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 20
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý VLC từ các môi trường khác nhau............... 20
3.1.1. Thu VLC từ các môi trường lên men................................................... 20
3.1.2. Quá trình xử lý VLC trước khi hấp thu thuốc...................................... 21
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của VLC .......................................................... 21
3.2. Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc Berberine Hydrochloride của VLC
trong các môi trường khác nhau ................................................................... 22
3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các VLC...................................................... 23
3.3.1 Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng chuẩn ........................................ 23
3.3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng nước dừa già ............................ 25


3.3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng nước vo gạo.............................. 27
3.3.4. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 2 ............................................................... 29
3.3.5. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc ra VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH = 6,8..................................................................... 30
3.2.6. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 12 ............................................................. 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 34


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men tạo VLC........................ 12
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberine
Hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)................ 15
Bảng 3.1. Lượng thuốc Berberine Hydrochloride hấp thu vào VLC ở các
môi trường với độ dày khác nhau tại thời điểm 2 giờ.................... 22
Bảng 3.2. Hiệu suất hấp thu thuốc Berberine Hydrochloride vào các
VLC khác nhau với độ dày màng khác nhau ở thời điểm 2 giờ..... 23
Bảng 3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc Berberine Hydrochloride (%) từ màng
chuẩn trong các môi trường pH khác nhau (n = 3) ........................
23
Bảng 3.4. Tỷ lệ giải phóng BH của màng nước dừa già (n = 3) .................... 25
Bảng 3.5. Tỷ lệ giải phóng BH (%) từ màng gạo (n = 3) .............................. 27
Bảng 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ với pH = 2........................................................ 29
Bảng 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ với pH = 6,8..................................................... 30
Bảng 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác nhau
ở thời điểm 24 giờ tại pH = 12...................................................... 31


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose ................................ 4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Berberine .................................................... 7

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Berberine Hydrochloride............................. 7
Hình 2.1. Sơ đồ tinh chế thu VLC ................................................................ 14
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Berberine Hydrochloride ............... 16
Hình 3.3. VLC lên men từ môi trường nước vo gạo ............................... ..... 21
Hình 3.4. VLC tinh thể thu được .................................................................. 21
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của VLC........................................ 22
Hình 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc Berberine Hydrochloride từ màng
chuẩn với độ dày 0,3 cm và 0,5 cm............................................... 24
Hình 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng dừa với độ dày 0,3 cm và
0,5 cm........................................................................................... 26
Hình 3.8. Tỷ lệ thuốc BH được giải phóng từ màng gạo với độ dày 0,3
cm và 0,5 cm ................................................................................ 28
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các vật liệu cellulose ở các độ
dày khác nhau ở thời điểm 24 giờ tại pH = 2 ................................ 29
Hình 3.10. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 6,8 ............................................. 30
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau ở thời điểm 24 giờ tại pH = 12 ............................................. 31


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ngày nay, nhịp sống hiện đại đang là một trong những yếu tố khiến
cho nhiều người mắc phải các bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa. Các
bệnh này không chỉ gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe mà còn làm giảm
sút chất lượng công việc, sinh hoạt chung… Berberine là một trong những
loại thuốc được sử dụng phổ biến để chữa trị, hạn chế bệnh rối loạn đường
tiêu hóa [1].
Berberine Hydrochloride (BH) được biết đến như một chất kháng
khuẩn tự nhiên, được chiết xuất chủ yếu từ các thảo dược rất sẵn có ở nước ta

chủ yêu là cây vàng đằng. Ngoài ra, còn được tìm thấy ở một số cây họ hoàng
(hoàng liên, thỏ hoàng liên, hoàng bá…) [1],[5]. Berberine thường được sử
dụng để điều trị các bệnh lý liên quan đến rối loạn đường tiêu hóa: hội chứng
lỵ, tiêu chảy, viêm ống mật, viêm ruột [13]. Ngoài ra, Berberine còn có tác
dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp,
giảm cholesterol trong máu, hạ đường huyết và viêm đại tràng. Theo một vài
nghiên cứu gần đây Berberine còn có thể ngăn chặn sựu phát triển của các tế
bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường ở nồng độ nhất
định [21].
Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) là vi khuẩn có thể sản xuất một
loại polysacarid ngoại bào được gọi là vật liệu cellulose (VLC). VLC có cấu
trúc hóa học giống với cellulose thực vật nhưng lại có một số đặc tính tốt như:
độ bền cơ học, khả năng thấm hút cao, đường kính sợ nhỏ, độ tinh khiết cao,
khả năng polymer hóa lớn, có khả năng tát sử dụng và an toàn sinh học [2],
[7]… Do đó, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khoa
học công nghệ khác nhau. Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về VLC
như: Huang và các cộng sự đã sử dụng vật liệu cellulose nạp Berberine và
nghiên cứu giải phóng in vitro của Berberine trong môi trường dạ dày – ruột
mô phỏng; kết quả thu được cho thấy Berberine giải phóng kéo dài từ vật liệu
cellulose nạp Berberine [21]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng vật liệu
cellulose còn ở mức độ khiêm tốn, mới chỉ dừng lại ở bước đầu nghiên cứu.

1


Với mục đích tạo ra VLC lên men từ vi khuẩn G. xylinus nuôi cấy trong
một số môi trường nạp Berberine Hydrochloride, sau đó khảo sát, đánh giá sự
giải phóng thuốc. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng
giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine Hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường.”

2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo ra vật liệu cellulose đã hấp thụ Berberine Hydrochloride được lên
men từ một số môi trường.
- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng Berberine Hydrochloride từ
vật liệu cellulose đã nạp thuốc trong một số môi trường pH khác nhau nhằm
tìm ra trường hợp khả năng giải phóng Berberine Hydrochloride tối đa.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
Hydrochloride của VLC lên men từ một số môi trường.
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo vật liệu cellulose (môi
trường chuẩn, môi trường nước dừa già, môi trường nước vo gạo).
+ Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
- Phạm vi nghiên cứu: quy mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật
khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện NCKH & ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu về VLC để mở rộng hơn hiểu biết về ứng dụng của VLC,
nhằm tìm được môi trường tạo ra VLC với khả năng nạp thuốc và giải phóng
thuốc kéo dài.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn


Đề tài xác định phương hướng khắc phục được nhược điểm của
Berberine Hydrochloride thông thường: nâng cao tác dụng của thuốc, giảm
thời gian điều trị và chi phí điều trị cho người bệnh,…

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của vật liệu cellulose
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc màng cenllulose vi khuẩn
Hiện nay, Gluconacetobacter xylinus là loài vi khuẩn có khả năng tổng
hợp màng cellulose từ nguồn cabohydrat có hiệu quả nhất trong tự nhiên [15].
G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng.
G. xylinus có dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 2 µm, đứng riêng lẻ hoặc
xếp thành từng chuỗi và không có khả năng di động. Tế bào thường được tìm
thấy trong dịch rượu, giấm, nước ép hoa quả, trong đất. Ngoài ra, khả năng
tổng hợp cellulose rất lớn.
Trên môi trường nuôi cấy lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
G. xylinus sử dụng đường để chuyển hóa tạo một lớp màng cellulose dẻo dai,
dày, có màu trắng trong hơi ngả vàng. Màng này có bản chất là tập hợp các vi
khuẩn liên kết với phân tử cellulose [27].
Vật liệu cellulose và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học
tuy nhiên cấu trúc và đặc tính lại khác nhau. VLC là một chuỗi polymer do
các glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucan xếp song song
quanh trục. VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ, đường kính 1,5 nm. Các sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100
nm, rộng 3 – 8 nm [21]. Đặc tính cấu trúc của vật liệu cellulose phụ thuộc rất
nhiều vào môi trường nuôi cấy.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose


1.1.2. Tính chất của vật liệu cellulose
- Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường thể dịch, vật liệu cellulose
được tạo thành có tính chất như: khả năng kết tinh cao, độ polymer hóa lớn
nên VLC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm và hút nước tốt do đó có thể

điều chỉnh được độ xốp, độ tinh sạch cao, kích thước ổn định,.... Đặc biệt,
VLC có những đặc tính ưu việt hơn hẳn VLC thực vật: độ chịu lực, độ bền cơ
học, tính đàn hồi,…
- Chúng ta có thể kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng
của cellulose trong quá trình nuôi cấy. Theo Brown và White (1989) có thể
hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng một
khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống không khí bên trong
môi trường nuôi cấy G. xylinus, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất
xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn [30].
- Sản xuất một số sản phẩm từ VLC không cần qua bước trung gian.
- VLC có thể được tổng hợp dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng sợi
chỉ cực nhỏ.
- Đặc biệt, VLC có khả năng kháng khuẩn, vì vậy VLC được sử dụng
làm màng lọc vô khuẩn [7].
- VLC là cellulose sinh học duy nhất mà được tổng hợp không gắn
lignin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật.
1.1.3. Ứng dụng của vật liệu cellulose
Với những đặc tính nổi bật đó, VLC được nghiên cứu ngày càng nhiều
và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
- Trong lĩnh vực y học: VLC được ứng dụng trong điều trị bỏng với
đặc tính đặc biệt như khả năng kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học, khả
năng thấm nước cao. Trong trường hợp bị bỏng nặng, VLC được dùng để che
chắn vết thương, hạn chế tiếp xúc với môi trường bên ngoài để tránh nhiễm
trùng. Ở Brazil, VLC được dùng làm dược rã trong sản xuất viên nén, làm
chất nhũ hóa, chất phân tán,… Ngoài ra, VLC còn được sử dụng làm tác
nhân vận chuyển thuốc.


- Trong lĩnh vực thực phẩm: Ở Việt Nam, chế phẩm của G. xylinus rất
có ý nghĩa đối với các cơ sở sản xuất thạch dừa. Ngoài ra, sản phẩm VLC còn

được làm màng bao xúc xích, làm màng bảo quản dừa tươi, thịt tươi được sơ
chế tôi thiểu ở nhiệt độ mát, vật liệu ổn định huyền phù, có tác dụng như chất
làm đặc trong nước ép, mứt kẹo, kem, salad,…
- Trong lĩnh vực mỹ phẩm: sản phẩm VLC vừa có khả năng giữ ẩm cao
lại không bám lại trên da sau khi rửa và không gây tác dụng phụ như sản
phẩm dưỡng da khác. Vì vậy, chúng được làm mặt nạ dưỡng da, móng tay
nhân tạo, kem dưỡng da, sơn móng tay,…
- Trong lĩnh vực môi trường: VLC được ứng dụng làm miếng xốp làm
sạch những vết dầu tràn; làm chất hấp thu trong các vật liệu để loại bỏ chất
độc hại; quần áo, dày dép tự phân hủy,…
1.2. Giới thiệu về thuốc Berberine Hydrochloride
1.2.1. Nguồn gốc
Berberine, tên khác là Berberine sulfate hoặc chlorhydrate. Berberine là
một alkaloid được chiết xuất từ cây Hoằng đằng (còn có tên vàng đắng, hoàng
liên, tên khoa học là Coptis teet) là loại cây dây leo than gỗ có phân nhánh,
mọc hoang ở nhiều nơi. Trong Hoằng đằng có nhiều alkaloid dẫn xuất của
izoquinolein, chủ yếu là Berberine tỷ lệ từ 1,5 – 2,3 %. Alkaloid Berberine có
thể được tìm thấy trong thân cây, vỏ cây, rễ và thân rễ (thân cây dưới lòng
đất) của cây [5], [8], [15].
Berberine thường có lẫn các tạp chất alkaloid khác như: palmatin,
jatrorrhizine. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2 %, jatrorrhizin không
quá 5% [1], [5], [15].
1.2.2. Cấu trúc
Berberine thuộc nhóm isoquinol có khung protoberberine [1].
Isoquinolin còn được gọi là benzo pyridine hay 2 – benzamin là một họp chất
hữu cơ thơm heterocylic.
Công thức cấu tạo:


Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Berberine

Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lượng phân tử: 371,82
Tên khoa học: 5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6a-azoniaindeno
(5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Berberine Hydrochloride

Khối lượng phân tử: 372,8612 g/mol.
1.2.3. Tác dụng được lý và ứng dụng
Berberine Hydrochloride có tác dụng kháng với vi trùng: Vi khuẩn
(shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn), vi nấm, cadida, virus, kí sinh trùng gây
bệnh, thể protozoal. Ngoài ra, Berberine Hydrochloride còn có tác dụng kìm
khuẩn tả và E. coli, đặc biệt khi dùng sẽ không bị ảnh hưởng đến sự phát triển
bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở đường ruột, khi dùng với thuốc kháng
sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi
khuẩn đường ruột. Vì vậy, Berberine Hydrochloride chủ yếu được dùng trong
điều trị các bệnh rối loạn đường tiêu hóa. Bên cạnh đó, Berberine
Hydrochloride với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim, làm giãn động mạnh


vành, mặt khác, với liều lượng lớn gây ức chế hô hấp khiến trung khu hô hấp
bị tê liệt trong khi tim vẫn đập [25].
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: Berberine Hydrochloride có
thể làm giảm lượng đường trong máu, giúp ngăn ngừa và điều trị tiểu đường
type 2 và các biến chứng của nó, như biến chứng về tim mạch và thần kinh
ngoại biên [16]. Berberine Hydrochloride có tác dụng làm giảm mạnh lượng
cholesterol, LD cholesterol, triglyceride xơ vữa nhưng có cơ chế hoạt động
không giống với statin làm cho Berberine Hydrochloride không gây ra tác
dụng phụ. Không những thế, Berberine Hydrochloride còn có thể dùng trong

bệnh động kinh với khả năng chống co giật, trong các trường hợp tổn thương
não do tắc mạch máu não gây ra, Berberine Hydrochloride bảo vệ các tế bào
thần kinh và có tác dụng chống trầm cảm. Đặc biệt, Berberine Hydrochloride
còn có tác dụng chống ưng thư, nó được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển
của nhiều loại tế bào ung thư mà không gây tác động đến sự phát triển của tế
bào bình thường ở nồng độ nhất định [25].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine Hydrochloride
- Chỉ định: Viêm đường ruột, tiêu chảy, lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, các chứng đau mỏi mắt và ngứa mắt do dị ứng [10].
- Chống chỉ định: quá mẫn cảm với các thành phần của thuốc, phụ nữa
có thai và cho con bú vì có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới
thai nhi [1], [10].
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine Hydrochloride
1.3.1.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về berberin như sau:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [22].
Ryan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về berberin
trong điều trị bệnh tiểu đường [26].


Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của
berberin trong điều trị bệnh tiểu đường [23].
1.3.1.2. Ở Việt Nam
Đã có một số công trình nghiên cứu ở biệt Nam về thuốc Berberine
Hydrochloride như sau:
Đinh Thị Liên, Vũ Thanh Thảo, Trần Cát Đông, Trần Thành Đạo –
Khảo sát tác động kháng staphylococcus aureus của phối hợp berberin và
kháng sinh β – lactam [4].

Hồ Cảnh Mậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn
Văn Thuận – Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Tuấn Quang - Nghiên cứu định
lượng berberin chlorid tronng “viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao [6].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu cải tiến quy
trình sản xuất berberin từ cây vàng đắng [10].
Vũ Thị Dương, Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn
Lương – Nghiên cứu bào chế viên nén berberin giải phóng tại đích đại
tràng [17].
Nguyễn Hoài Nam, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng – Tác động của
Berberin và Palmatin trên trí nhớ hình ảnh và không gian của chuột nhắt [11].
Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012),
“Nghiên cứu vi khuẩn từ Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial Cellulose
ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 50(4),
tr.453-462 [3].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu vật liệu cellulose
1.3.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới, nhiều nước đã nghiên cứu về VLC từ vi khuẩn G.
xylinus và những ứng dụng của nó. Tác giả Brown 1989, sử dụng VLC
làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, là chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lượng tế bào [20]. Ngoài ra, ông và cộng sự sử dụng
VLC như và một


chất biến dổi độ nhớt, để tạo ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực thực phẩm thay thế thực phẩm [20]. Không những thế,
VLC còn được ông sử dụng làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy chất lượng cao,
làm cơ chất để cố định proteinhay cho sắc kí.
1.3.2.2. Ở Việt Nam
Ở nước ta, tình hình điều trị bỏng ngày càng được cải tiến. Việc điều trị

bỏng bao gồm: cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng
ối, da ếch, trung bì da lợn, màng chitosan,… Từ năm 2000, tác giả Nguyễn
Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về VLC, đây là
cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong điều trị bỏng [7].


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
Hydrochloride của vật liệu cellulose lên men từ ba môi trường (môi trường
chuẩn, môi trường nước dừa già, môi trường nước vo gạo)
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Hình thành VLC từ 2 môi trường: môi trường chuẩn, nước dừa già,
nước vo gạo.
- Nạp thuốc Berberine Hydrochloride vào VLC.
- Với các môi trường pH khác nhau, nghiên cứu giải phóng thuốc
Berberine Hydrochloride.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị:
- Máy đo quang phổ UV – Vis 2450 (shimadzu – Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật – Sartorius TE 3102 S
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA – Nhật Bản
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton – Anh)
- Bể bồn nhiệt (Đức)
- Tủ lạnh Daewoo, tử lạnh sâu

- Máy lắc (Lap companion, SKF – 2075, Hàn Quốc)
Dụng cụ


Hộp nhựa, ống nghiệm, cốc đọng thủy tinh, đũa thủy tinh, bình thủy
tinh có nút xoáy, lọ penicillin, đèn cồn, kẹp gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy
quỳ tím, bình định mức 100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml,
thước kẹp panme,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.4. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: Nước dừa già, nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
- Thuốc Berberine dạng tinh khiết (98%)
- Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphate hydro,
Na2 HPO4 , acid acetic, NaOH, HCL, đường glucose, pepton.
- Hóa chất dùng để pha môi trường pH: HCldd , KCl, acid citric,
Na2 HPO4 .12H2 O, ethanol 96°, thuốc thử Fehling.
- Các hóa chất trên đảm bảo tiêu chuẩn phân tích, có nguồn gốc từ Việt
Nam và Trung Quốc.
2.1.5. Môi trường lên men tạo vật liệu cellulose
Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men tạo VLC

Thành phần
Glucose
Pepton
Diamoni photphat hydro
Disodium phosphate hdro
Amoni sulfat
Acid citric
Cao nấm men
Acid acetic

Nước dừa già
Nước vo gạo
Nước cất 2 lần
Dịch giống G. xylinus

MTC
20 g
5g

Môi trường
MTD
30 g
10 g
0,3 g

MTG
30 g
10 g
0,3 g

2,7 g
0,5 g

0,5 g

2%
1000 ml

2%

1,5 g
5g
2%

1000 ml
1000 ml
10%

10%

10%


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu vật liệu cellulose từ một số môi trường
- Bước 1: Pha môi trường với các thành phần như bảng 2.2.
- Bước 2: Khử trùng các môi trường đó bằng cách hấp ở 113°C trong
15 phút.
- Bước 3: Sử dụng tia UV để khử trùng các môi trường trong 15 phút
rồi để nguội.
- Bước 4: Thêm 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc nhẹ và đều cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Đậy kín các bình lên men bằng vải xo, ủ tĩnh trong khoảng 7
– 10 ngày ở khoảng 26 ℃.
- Bước 6: Thu VLC thô và làm sạch màng dưới với nước.
2.2.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: loại bỏ môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình
trao đổi acid đồng thời trung hòa độc tố của vi khuẩn. Vậy nên, cần phải có
quá trình xử lý màng trước khi hấp thụ. Quy trình đó được thể hiện trong
hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ tinh chế thu VLC
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
Mục đích: Kiểm tra và đảm bảo rằng sau khi xử lý, VLC đã được loại
bỏ các chất độc hại và đã có sự tồn tại của đường glucose trong VLC.
Nguyên tắc: Sử dụng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sựu hiện
diện của đường D – glucose, nếu xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì có đường D
glucose trong màng.


Tiến hành:
- Dịch thử của VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
- Cho mỗi ống 1 ml thuốc thử Fehling vào các ống nghiệm chứa mẫu thử.
- Sau đó, đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút. Quan sát kết tủa
xuất hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch cồn 96° và các dung dịch với nồng độ Berberine
Hydrochloride ở (mg/ml) khác nhau là: 5%, 10%, 20%, 30%, 40% trong dung
dịch cồn 96°.
Đo cường độ quang phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 345 nm
bằng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 [14], [21].
Bằng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị đường chuẩn là lập
phương trình đường chuẩn Berberine Hydrochloride.
Thực hiện 3 lần đo như trên rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD 345 nm của các nồng độ thuốc khác nhau
được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberine Hydrochloride ở
các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)

Giá trị OD 345 nm (n=3)

STT

Nồng độ
(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Giá trị trung
bình

1

5

0,353

0,355

0,354

0,354 ± 0,003

2

10

0,712

0,714

0,710

0,712 ± 0,002

3

20

1,523

1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151

5

40

2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040

6

50

3,703

3,641

3,504

3,616 ± 0,102