Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các
thầy cô giáo đang làm việc tại Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng cùng
các thầy cô giáo và các bạn sinh viên đang tham gia làm việc, nghiên cứu và
học tập tại bộ môn Sinh lý học người và động vật khoa Sinh-KTNN, Trường
đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã hết sức giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình em nghiên cứu và hoàn thành khóa luận với
đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường chuẩn”.
Tiếp theo, em muốn dành lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Xuân Thành đã
tận tình chỉ bảo và giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tôt nghiệp.
Lời cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể các thầy cô đã giảng dạy em 4
năm học vừa qua, tất cả những kiến thức quý báu mà các thầy cô đã truyền đạt
sẽ là những hành trang vô cùng quý báu cho em trên con đường sau này.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này được chính tôi thực hiện tại

Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng- Trường đại học Sư phạm Hà Nội 2,
dưới sự trực tiếp hướng dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên
cứu là của cá nhân tôi, không có sự trùng lặp, không sao chép từ bất kì tài liệu
nào. Kết luận được đánh giá dựa trên kết quả thực nghiệm đã thực hiện không
bịa đặt. Trong khóa luận có được sử dụng một số tài liệu tham khảo từ các tác
giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và độ tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu mọi trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc


CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG KHÓA LUẬN

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

BH

Berberine hydrochloride

UV - vis

Ultraviolet visible

ĐHSP

Đại học Sư Phạm

VLC

Vật liệu cellulose

NCKH và ƯD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang phổ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3

5. Dự kiến kết quả nghiên cứu .......................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC) ....................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc màng VLC ................................................................................ 5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC .................................................................... 6
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trường chuẩn............................................... 7
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC ....................................................................... 7
1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride ............................................. 8
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất............................................................... 8
1.2.2. Tác dụng dược lí và ứng dụng ................................................................ 9
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine hydrochloride ............ 9
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước............................................... 10
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose .................................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 11
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu........................................ 11
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................. 11


2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 12
2.4. Môi trường tạo màng VLC....................................................................... 12
2.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.5.1. Phương pháp tạo màng VLC từ môi trường chuẩn............................... 12
2.5.2. Phương pháp xử lí màng VLC trước khi hấp thụ thuốc........................ 14
2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng ..................................... 15
2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành ............................... 15
0

2.5.5. Xây dựng đường chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 96 . ... 15
2.5.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng VLC....... 17
2.5.7. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered saline) .. 18
2.5.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được
thiết kế ............................................................................................................. 19
2.5.9. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................... 21
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng VLC lên men từ môi trường chuẩn..... 21
3.1.1. Màng VLC được lên men từ môi trường chuẩn.................................... 21
3.1.2. Tinh chế màng VLC.............................................................................. 22
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC.................................................. 22
3.2. Khảo sát màng VLC trong quá trình hấp thụ thuốc berberine
hydrochloride .................................................................................................. 23
3.3. Lượng thuốc giải phóng từ màng VLC vào các môi trường pH khác nhau
......................................................................................................................... 23
3.3.1. Mật độ quang của berberin khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau ..................................... 23
3.3.2. Tỉ lệ giải phóng dược chất của các màng ở các môi trường pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau.................................................... 25


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 30


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC................................................................. 7
Bảng 2.1. Môi trường tạo màng VLC ............................................................. 12
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang OD của dung dịch berberine......................... 16

hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3) ............................... 16
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS với pH tương ứng là 2; 6,8 và 12 ................ 18
Bảng 3.1. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng VLC (n = 3) ......................... 23
Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau ....................................................... 24
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride ............................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô................................................. 13
Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC......................................................................... 14
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của berberine hydrochloride (n=3) ..... 17
Hình 3.1. Màng VLC sau khi được thu từ môi trường chuẩn......................... 21
Hình 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau ....................................................... 25
Hình 3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc berberine hydrochloride ............................. 26
Hình 3.3. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH=2...................................................... 27
Hình 3.4. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12. .................................................. 27
Hình 3.5. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =6,8.................................................. 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe,
làm đẹp bằng việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ các nguyên
vật liệu sinh học rất phổ biến và được ưa chuộng do có tác dụng hiệu quả
cũng như độ an toàn cao. Chính vì độ an toàn, khả năng tái tạo, sự phân
hủy sinh học và thân thiện với môi trường của các loại vật liệu sinh học
mà chũng đã được rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và sử dụng
rộng rãi. Một trong số những vật liệu sinh học được sử dụng rộng rãi và
phổ biến là vật liệu Cellulose.
Vật liệu Cellulose (VLC) được tạo ra từ 1 loại vi khuẩn là chủng vi

khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [3,8]. Cấu tạo của chủng
vi khuẩn này bao gồm các phân tử glucose được nối với nhau nhờ liên
kết ß- 1 4 glucozit, đây là một loại màng sinh học (VLC) được tạo nên
nhờ liên kết hóa học này, loại màng này có cấu trúc và đặc tính tương tự
cellulose ở thực vật. Tuy nhiên, chúng lại có nhiều những đặc điểm ưu
việt và ứng dụng hơn như: dù ở trạng thái ẩm vẫn có khả năng hút nước
cao, độ bền và tính dẻo dai của màng cao, độ tinh khiết cao. Cellulose vi
khuẩn còn có những đặc tính vượt trội hơn hẳn khi so sánh với cellulose
thực vật: không có các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến. Đặc biệt, màng VLC có thể được sản xuất trên quy
mô lớn vì nguồn nguyên liệu dễ kiếm, giá thành rẻ. Vì vậy, có thể thấy
vật liệu cellulose là một loại nguyên liệu mới sẽ được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm,… [11,18].
Một trong các lĩnh vực mà màng VLC được ứng dụng nhiều nhất
và rất thành công đó là y học. Màng VLC được nghiên cứu vào việc ứng
dụng làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da, từ đó phát
huy được ưu điểm và khắc phục các nhược điểm của thuốc khi sử dụng
một cách thông thường. Ưu điểm vượt trội nhất của việc sử dụng màng
VLC là khả năng làm lành lại vết thương, đặc tính bảo vệ và hấp thụ
dịch tiết. Một số hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc thời

1


gian dài thường có ít lớp hoặc một lớp duy nhất nên quy trình sản xuất
được đơn giản hóa và giảm chi phí sản xuất. Vậy nên có thể sản xuất các
sản phẩm dùng trực tiếp qua da từ nhiều loại vật liệu khác nhau [11,18].
Việt Nam là đất nước: nóng ẩm, mưa nhiều nên rất nhiều các loại vi
sinh vật như vi khuẩn, nấm, mốc, kí sinh trùng phát triển rất mạnh, cùng
với đó là việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như vệ sinh môi

trường sống còn thấp nên dễ tạo điều kiện cho các loại vi sinh vật có hại
gây nên các bệnh liên quan đến đường ruột như rối loạn tiêu hóa, tiêu
chảy…, ngoài ra còn gây một số bệnh như đau mắt hột. Berberine
hydrochloride là một hợp chất được tìm thấy từ thực vật, dễ tìm, an toàn
và giá thành thấp, có hoạt tính chống viêm [2]. Chúng được dùng nhiều
trong việc điều trị các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa.
Tuy nhiên, berberine hydrochloride được sử dụng chủ yếu qua
đường uống với sinh khả dụng thấp, gây tác dụng phụ cho việc vận
chuyển thuốc bên ngoài đường tiêu hóa [24]. Khi sử dụng thuốc có thể
bị các tác nhân khác làm ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng thuốc. Ngoài
ra, thuốc còn có tác dụng phụ liên quan đến các nhóm cơ và tinh mạch.
Vậy nên cần phải nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberine
hydrochloride.
Với mục đích tạo ra màng VLC bằng chủng vi khuẩn G. xylinus, từ
đó tạo ra màng sinh học sử dụng để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng giúp kéo dài thời gian giải phóng, phát huy những ưu điểm và
khắc phục những tác dụng không mong muốn, của VLC trong việc điều
trị các bệnh.
Vì vậy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
của vật liệu cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
hydochloride từ màng VLC đã nạp thuốc ở môi trường chuẩn có độ pH
khác nhau.


3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng Berberine
hydrochloride của vật liệu Cellulose lên men từ môi trường chuẩn.

- Vật liệu nghiên cứu bao gồm: màng VLC tạo ra từ môi trường
chuẩn.
- Phạm vi nghiên cứu: Các nghiên cứu được thực hiện trên quy
mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Phòng thí nghiệm sinh lý học người và động vật Trường đại học
Sư phạm Hà Nội 2.
+ Viện nghiên cứ khoa học và ứng dụng Trường đại học Sư phạm
Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
+ Hiểu được ứng dụng của màng VLC trong cuộc sống.
+ Việc hạn chế những nhược điểm của thuốc Berberine
hydrochloride khi sử dụng màng VLC sẽ đưa ra một hướng nghiên cứu mới
trong nghiện cứu khoa học, không chỉ ứng dụng để khắc phục hạn chế của
thuốc này mà màng VLC có thể được sử dụng ở rất nhiều loại thuốc khác
giúp cho sự phát triển không ngừng của y học trong thời gian tới.


-Ý nghĩa thực tiễn:
+ Sản xuất ra màng VLC từ môi trường chuẩn.
+ Xác định khả năng giải phóng thuốc Berberine hydrochloride từ
đó xác định được khả năng giải phóng thấp nhất, cao nhất tại các thời gian
khác nhau.
5. Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tạo được màng VLC từ vi khuẩn G. xylinus trong môi trường
chuẩn.
- Xử lý màng thô để thu được màng VLC tinh sạch
- Thực hiện quá trình giải phóng thuốc của màng VLC được tạo ra
trong môi trường chuẩn ở các độ pH khác nhau.

4


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một trong những đại phân tử hữu cơ tồn tại phổ biến
trên trái đất, là thành phần chính tạo nên sinh khối của thực vật, đại diện
cho các polymer ngoại bào của các loại vi sinh vật. Cellulose có thể trao đổi
sơ cấp và tạo màng bảo vệ [8].
Ngày nay, Gluconacetobacter xylinus được chứng minh là một
trong số những loại vi khuẩn tạo ra màng VLC hiệu quả nhất trong tự
nhiên. Đây là loại vi khuẩn gram âm, sống hiếu khí không bắt buộc, không
có khả năng sinh bào tử và là loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi
một tế bào của G. xylinus chuyển hóa được tới 108 phân tử glucose và phân
tử cellulose chỉ trong vòng 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn.
G. xylinus dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, có thể di chuyển
hoặc không di chuyển và không sinh bào tử. Khi tế bào của vi khuẩn này
già đi hay do tác động của môi trường thì gram của chúng có thể bị biến
đổi. G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng
trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí và có khả
năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [12].
Trong môi trường rắn nuôi cấy khoảng 3 đến 7 ngày, khuẩn lạc
G. xylinus phát triển nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng để 1 tuần thì
khuẩn lạc phát triển to, đục, khô dần.
Ở môi trường lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì có 1 lớp màng
dày đục xuất hiện, sau từ 36- 48 giờ hình thành một lớp màng trong và càng
dày.
1.1.1. Cấu trúc màng VLC

Màng VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống với cellulose có nguồn
gốc thực vật (plant cellulose– PC), tuy nhiên chúng lại khác nhau ở cấu trúc
đại thể. Các sợi mới của mang VLC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi
sơ cấp (subfibril), rộng khoảng 1.5nm. Các sợi sơ cấp này sẽ kết thành vi sợi

5


nằm trong các bó sau đó hình thành các dải với độ dày 3-4nm, chiều rộng 70
– 80nm; 3.2 x 133nm. Cấu trúc của VLC được quyết định bởi điều kiện nuôi
cấy [22]. Cấu trúc hóa học của VLC được thể hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC
Độ tinh khiết cao: VLC là loại cellulose sinh học duy nhất được tổng
hợp không có lignin hay hemicellulose. Vậy nên có thể sử dụng VLC là
nguyên liệu tái sinh, an toàn với môi trường vì nó có thể được phân hủy hoàn
toàn bởi vi khuẩn.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cơ học rất lớn, khả
năng chịu được lực kéo cao, khối lượng nhẹ, độ bền cao.
Khi ở trạng thái ẩm màng VLC vẫn có khả năng hút nước cực cao, và
có thể giữ được lượng nước lớn, có thể hút gấp 60 – 700 lần trọng lượng của
nó [18].
Quá trình sinh tổng hợp hình thành trực tiếp nên màng VLC vậy nên
việc sản xuất giấy và sợi không cần qua các bước trung gian.
Màng VLC được định hướng trong khi tổng hợp: có khả năng tạo các
bền theo một trục do sự hình thành các sợi biến động. Theo Brown và White
(1989) [31] gang tay cellulose có thể được hình thành mà không cần khâu
bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí xuyên qua được và dìm
xuống không khí bên trong môi trường nuôi cấy G. xylinus, các tế bào vi

khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose như hình dạng
mong muốn.
6


Trong quá trình tổng hợp màng VLC được biến đổi trực tiếp: màng
này có thể thay đổi thuộc tính khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào
trong quá trình tổng hợp.
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trường chuẩn
Trên thế giới, màng từ vật liệu cellulose lên men từ môi trường chuẩn
được sử dụng rộng rãi và rất phổ biến vì nó bền hơn các loại màng cellulose
lên men từ các môi trường khác.
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC
Màng VLC có rất nhiều ưu điểm: độ kết tinh, độ tinh sạch, độ bền sức
căng, độ bền đàn hồi, độ co dãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả hút
nước và giữ nước cao, bị phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học, tính
trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [18].
Với những ưu điểm đó thì màng VLC được con người ứng dụng trong
rất nhiều lĩnh vực [4, 10, 11, 12, 18, 22, 23, 25, 30] trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC
Lĩnh vực được

Sản phẩm

ứng dung

ứng dụng
Lớp màng chữa bỏng

Y dược

Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo

Thực phẩm

Thức ăn tráng miệng (thạch)
Thịt nhân tạo

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo
Vải, túi tự phân hủy
Miếng xốp làm sạch vết loang tràn dầu

Môi trường
Lĩnh vực khác

Sử dụng làm màng lọc

7


1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride
Berberine hydrochloride là hoạt chất chiết từ cây hoàng đắng (tên gọi khác
là vàng đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta) là loại cây leo thân gỗ có
phân nhánh, chúng mọc hoang ở rất nhiều nơi. Berberine hydrochloride timg thấy
nhiều nhất ở thân và rễ cây hoàng đằng với tỉ lệ 1,5 – 3%, chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần.
Tên quốc tế: Berberine hydrochloride

Loại thuốc: kháng khuẩn, chống lại các bệnh về đường ruột do vi khuẩn,
các loại kí sinh trùng đường ruột

1.2.1. Công thức hóa học và tính chất
Berberine hydrochloride là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có
khung protoberberine [1]. Isoquinolin còn có tên gọi khác là benzo pyridine hay
2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lượng phân tử: 371,82

Tên
khoa
học:
5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6aazoniaindeno (5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
Tính chất vật lý:
Tinh thể hay bột có kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng. Độ
o

chảy khi ở dạng base là 145 C (bị phân hủy) [17]. Tan chậm trong nước ở
độ tan dạng base 1/500 [27], trong ethanol ít tan, khó tan trong ether [17].
8


Dễ tan trong nước ở dạng muối sulfat với tỉ lệ 1/30. Không có đồng phân
quang học do không có C bắt đôi [11,17].
Tính chất hóa học:
Tính chất hóa học của N: Tương tự 1 base yếu, thay thế nhóm OH để

tạo muối, muối berberine tạo thành có loại phân tử nước giống muối của
hydroxyd kim loại mà không giống muối của các alkaloid khác [17].
Tính chất hóa học của oxy: Berberine ổn định thấp trong môi trường
kiềm mạnh, trong môi trường kiềm mạnh dễ mở vòng cho chức aldehyd do
N không bền vững gọi là Berberinal [7].
Tính chất hóa học mạch kép: Berberine có thể mất mạch kép tại nhân
giữa để cho các hydro alkaloid không màu [7].
1.2.2. Tác dụng dược lí và ứng dụng
Tác dụng chính của Berberine hydrochloride là kháng khuẩn, dùng
chủ yếu ở các bệnh liên quan đến rối loạn đường tiêu hóa [27]. Chống nhiễm
các loại nấm, các loại kí sinh trùng và nhiễm khuẩn do vi khuẩn hay virut gây
ra. Một vài loại thuốc nhỏ mắt chữa đau mắt hột cũng có thành phần là
Berberine hydrochloride.
Nếu sử dụng thuốc với lượng nhỏ còn có tác dụng kích tim, làm giãn
mạch vành, sử dụng với liều lớn gây ức chế hô hấp, làm tê liệt trung khu hô
hấp khi tim vẫn đập. Ngoài ra thuốc còn có một số tác dụng khác như hạ
nhiệt, gây tê, an thần, lợi mật, kháng lợi niệu.
Một vài nghiên cứu gần đây cho thấy: Berberine hydrochloride có
thể giúp hạ đường huyết hiệu quả như metformin [30]. Berberine
hydrochloride làm giảm mạnh lượng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid
và sơ vữa [22], ngoài ra còn thể điều trị chứng co giật và bệnh động kinh [23].
Bảo vệ các tế bào thần kinh và chống trầm cảm [23].
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine hydrochloride

9


Chỉ định: tiêu chảy, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng lỵ, lỵ trực
tràng, viêm đường ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết
hột, các trường hợp ngứa mắt do bị dị ứng.

Chống chỉ định: mẫn cảm với bất kì thành phần nào của thuốc, phụ
nữ có thai và cho con bú
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose
Trên thế giới
Những công trình nghiên cứu về thuốc berberine hydrochloride như:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả an toàn của berberine
hydrochloride trong điều trị bệnh nhân tiểu đưởng loại 2 [19].
Pyan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về
berberine hydrochloride trong bệnh tiểu đường [28].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu và tác dụng và cơ chế của
berberine hydrochloride trong điều trị bệnh tiểu đường [20].
Tại Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberine hydrochloride ở Việt Nam có một
số công trình nghiên cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
Nguyễn Liêm – chiết xuất berberine hydrochloride bằng áp lục nóng
[9].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu và cải tiến
quy trình sản xuất berberine hydrochloride từ cây vàng đắng [9].
Hồ Đắc Trinh – sử dụng dung dịch acid sulfuric loãng để chiết
berberine clorid trong vàng đắng [15].
Trần Công Khánh – gớp phần nghiên cứu phương pháp sản xuất
berberine hydrochloride từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [5].

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc berberine
hydrochloride của màng vật liệu cellulose lên men từ môi trường chuẩn.
Vật liệu nghiên cứu: Màng VLC, thuốc berberine hydrochloride ở dạng
tinh khiết
Phạm vi nghiên cứu: các thí nghiệm trong nghiên cứu được thực hiện ở
phòng thí nghiệm
2.2. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng VLC từ môi trường chuẩn.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberine hydrochloride từ hệ
thống màng VLC đã được nạp thuốc berberine hydrochloride.
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích;
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.


2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: nước cất 2 lần, gạc vô trùng
Hóa chất:
Hóa chất đặc biệt: Pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thường có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:

berberine hydrochloride (độ tinh khiết 98%), cao nấm men, cồn 96º, đường
glucose, pepton, acid axetic, KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaOH, acid
HCl đậm đặc, nước cất và một số hóa chất khác.
2.4. Môi trường tạo màng VLC
Môi trường tạo VLC được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường tạo màng VLC
STT

Hóa chất

Khối lượng

1

Nước cất 2 lần

1000ml

2

Glucose

20g

3

Cao nấm men

5g

4

Pepton

5g

5

Na2HPO4

2,7g

6

Axit citric

1,5g

2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tạo màng VLC từ môi trường chuẩn
- Lên men tĩnh: Môi trường dinh dưỡng để lên men G. xylinus được
đựng vào các khay lên men có bề mặt rộng, thoáng. Trong thời gian lên
men, các khay này được phủ đậy bởi lớp giấy báo có độ xốp để tạo độ
thông khí. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp để lên men vào khoảng 28 –
30oC. Sau đó sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa không khí và môi
trường lỏng. Cellulose tiếp tục được tổng hợp và bám lên màng cellulose
phía bên trên. Khoảng 7 – 10 sau đó sẽ thu được màng VLC [14].


- Cụ thể quy trình VLC lên men từ môi trường chuẩn được thực

hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [14].
Nước cất 2 lần

Bổ sung dinh dưỡng cần thiết
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
(113ºC, 20 phút)
Để nguội
Đổ giống và acid acetic vào bình nuôi
cấy thực hiện trong buồng cấy vô trùng
( 10% giống + 2% acid)
Đậy bình bằng vài xô
sạch, đê nơi thoáng mát
Lên men 7-8 ngày

Thu màng VLC

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô


2.5.2. Phương pháp xử lí màng VLC trước khi hấp thụ thuốc
Màng VLC sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trước khi hấp
thụ thuốc ta cần phải tiến hành tinh sạch xử lí màng để quá trình hấp thụ và
giải phóng được chính xác.
Quy trình xử lí màng [13] được trình bày trên sơ đồ 2.2.

Tách màng VLC thô
Ép loại nước

Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu màng VLC tinh chế

Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC
Tách VLC: Trong nuôi cấy tĩnh VLC tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.


Ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải
phóng nội độc tố của vi khuẩn và trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn.
Ngâm HCl: sau khi ngâm màng bằng NaOH rửa nước rồi ép màng. Sau
đó, ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
Ngâm nước: Màng sau khi ngâm, rửa với nước rồi ép màng. Ngâm
nước đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48h thu được VLC tinh khiết.
2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng
Mục đích: Đảm bảo màng VLC đã được tinh sạch, loại bỏ hết tạp
chất gây độc hại, kiểm tra sự có mặt của đường glucose trong màng VLC.
Nguyên tắc: sử dụng thuốc thử Fehling mới pha chế để kiểm tra sự
có mặt của đường D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
- Dịch thử của màng VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Ngâm trong nước đun sôi 10 - 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.

2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành
VLC sau khi được tách ra khỏi môi trường, sau đó xử lí theo công
đoạn hóa học [15] thu được VLC tinh chế. VLC tinh chế được ép áp lực, thu
được khối lượng VLC tạo thành.
0

2.5.5. Xây dựng đường chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 96 .
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º.
- Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc berberin ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% trong cồn 96º.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - Vis để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha như trên ở bước sóng 345nm [24].
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc


berberin để xây dựng đường chuẩn của thuốc berberine hydrochloride.
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc berberine hydrochloride ở các
nồng độ khác nhau được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang OD của dung dịch berberine
hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3)
Giá trị OD 345nm (n = 3)
STT

Nồng độ
(mg/ml)
Lần 1

Giá trị trung bình
Lần 2

Lần 3

1

5

0,353

0,355

0,354

0,354 ± 0,003

2

10

0,712

0,714

0,710

0,712 ± 0,002

3

20

1,523

1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151

5

40

2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040

6

50

3,703

3,641

3,504

3,616 ± 0,102

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn berberine hydrochloride
bằng phần mềm Excel 2010. kết quả được đồ thị như hình 2.3.