ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ của BA PHƯƠNG PHÁP KHỬ PROTEIN TRONG XƯƠNG bò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HÀ MAI LINH

§¸NH GI¸ HIÖU QU¶ CñA BA PH¦¥NG
PH¸P
KHö PROTEIN TRONG X¦¥NG Bß

LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ


Hà Nội - Năm 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HÀ MAI LINH

§¸NH GI¸ HIÖU QU¶ CñA BA PH¦¥NG
PH¸P
KHö PROTEIN TRONG X¦¥NG Bß
Chuyên ngành: Mô- phôi
Mã số : 62720101

LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Ngô Duy Thìn

Hà Nội - Năm 2017

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ALP
: Alkaline Phosphate
API
: Atmospheric Pressure Ionization
BMP
: Bone Morphogenetic protein
BSE
: Bovine Spongiform Encephalopathy
CBFA- 1 : Core Binding Factor Alpha- 1
GTR
: Guided Tissue Regeneration
HA
: Hydroxyapatite
HLA
: Human Leukocyte Antigen
HPLC
: High Performance Liquid Chromatography
IGFs
: Insulinlike growth factors
IL
: Interleukin
MGP
: Matrix Gla- protein
MHC
: Major Histocompatibility Complex

MS
: Mass Spectrometry
OP- 1
: Osteogenic protein 1
PDGFs
: Platelet- derived Growth Factors
SEM
: Scan Electron Microscopy
TCA
: Tricloacetic acid
TGF- β
: Transforming Growth Factor β


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ghép xương là phương pháp phổ biến để sửa chữa các khuyết tật
xương trong phẫu thuật chỉnh hình và tái tạo [1]. Ứng dụng này dựa trên ba cơ
chế hỗ trợ hàn gắn tổn thương của mô ghép, đó là: khả năng cảm ứng tạo
xương, khả năng dẫn xương và khả năng tạo xương. Trong đó, khả năng cảm
ứng tạo xương là khả năng kích thích các tế bào tạo xương của cơ thể nhận
biệt hóa thành tế bào xương; khả năng dẫn xương là mảnh ghép đóng vai trò
như một bộ khung cho sự hình thành xương mới còn khả năng tạo xương là
khả năng mảnh ghép cung cấp cho tổn thương những tế bào cần thiết cho sự
tạo xương, khả năng này chỉ có ở xương ghép tự thân [2].
Ghép xương tự thân luôn là tiêu chuẩn vàng cho sự tái tạo xương [3],
tuy nhiên, nguồn xương ghép tự thân hết sức hạn chế, đồng thời, việc lấy
mảnh mô ghép đòi hỏi một phẫu thuật thứ hai gây ra tổn thương tại vị trí lấy
mảnh ghép, kéo dài thời gian phẫu thuật và nâng giá thành [4]. Do đó, việc

tìm và phát triển những nguyên liệu ghép xương thay thế là rất cần thiết. May
mắn là xương của các loài động vật khác có thành phần hóa học và cấu trúc
mô học tương tự như xương người [5],[6] thêm vào đó, chúng cũng bộc lộ
khả năng dẫn xương và cảm ứng tạo xương [6], có khả năng thỏa mãn những
yêu cầu của một vật liệu ghép lý tưởng.
Năm 1668, ca phẫu thuật ghép xương dị loài trên người đầu tiên được
thực hiện thành công bởi nhà phẫu thuật người Hà Lan Job Janszoon van
Meekeren. Trong nhiều năm qua, mô xương từ nhiều loài động vật khác nhau
đã được nghiên cứu để ghép trên người. Trong số đó, xương bò là loại vật liệu
được ưa thích do nguồn nguyên liệu phong phú và việc sử dụng xương bò
không gặp phải các trở ngại về đạo đức y học [5].


2
Ghép xương dị loài khắc phục được những hạn chế của ghép xương tự
thân tuy nhiên việc ghép xương dị loài cũng có nguy cơ gây ra phản ứng miễn
dịch và lây truyền các bệnh truyền nhiễm cho người nhận [7],[8]. Do đó, xây
dựng các quy trình loại bỏ những kháng nguyên có khả năng tạo phản ứng
miễn dịch trong mảnh ghép là rất quan trọng trong phát triển vật liệu thay thế
sử dụng xương dị loài.
Xương bò khử protein đã được chứng minh là không những loại bỏ
được nguy cơ kích thích phản ứng miễn dịch mà còn giữ lại được khả năng
cảm ứng tạo xương và dẫn xương [2], nhờ đó, nó kích thích sự hàn gắn và tái
tạo xương sau phẫu thuật. Tuy nhiên hiện nay, ứng dụng của xương bò khử
protein trong phẫu thuật chỉnh hình rất hạn chế do quá trình khử protein làm
giảm sức mạnh cơ học của xương [9]. Ngược lại, bột xương bò khử protein
ngày càng được ưa chuộng trong nha khoa do sự gia tăng của nhu cầu tái tạo
ổ răng và xương hàm [5].
Phương pháp khử protein trong xương lần đầu tiên được đề xuất bởi
Bauermeister và cộng sự từ năm 1957 bằng cách ngâm mảnh xương trong

H2O2 [10]. Cho đến nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp khử protein
trong xương bò được nghiên cứu và ứng dụng, tạo ra nhiều sản phẩm thương
mại bột xương bò khử protein khác nhau [5]. Tại Việt Nam chưa có nhiều
nghiên cứu về phương pháp khử protein trong xương bò và ứng dụng của nó
trong y học. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá hiệu
quả của ba phương pháp khử protein trong xương bò” với hai mục tiêu:
1. So sánh hiệu quả khử protein trong xương bò từ ba phương pháp
khử protein khác nhau.
2. Nhận xét khả năng dung nạp của xương bò khử protein trên thỏ
thực nghiệm.


3
Chương I
TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cấu tạo mô học của xương

Mô xương là hình thái thích nghi đăc biệt của mô liên kết [11]. Giống như
các loại mô liên kết khác, mô xương bao gồm các tế bào và chất nền ngoại
bào [12]. Tuy nhiên, khác với các loại mô liên kết khác, thành phần ngoại bào
của mô xương bị calci hóa làm cho chất căn bản trở nên rất cứng rắn, phù hợp
với chức năng chống đỡ và bảo vệ của xương [12].
1.1.1. Chất nền ngoại bào
Chất nền ngoại bào của xương bao gồm thành phần hữu cơ, chủ yếu là
collagen và thành phần vô cơ, chủ yếu là hydroxyapatite (HA) và các muối
khác của calci và phosphate. Các sợi collagen tạo cho xương sức bền trước
lực kéo trong khi các tinh thể HA tạo cho xương sức bền trước lực ép. Ở các
loài động vật có vú, thành phần vô cơ chiếm khoảng 65%, thành phần hữu cơ

và nước lần lượt chiếm 25% và 10% trọng lượng mô xương. Xương người có
50 – 75% trọng lượng là thành phần vô cơ, 20 – 40% là thành phần hữu cơ và
5 – 10% là nước [13]. Ở xương bò, protein chiếm khoảng 38% trọng lượng
mô xương [6].
1.1.1.1. Thành phần hữu cơ
85 – 90% Lượng protein trong chất nền ngoại bào của xương là
collagen, trong đó chủ yếu là collagen type I và một lượng nhỏ collagen type
V [14]. Môt số type collagen khác như collagen type III, XI và XIII cũng
được tìm thấy trong chất nền ngoại bào xương ở dạng vết [12]. Collagen typ I
không chỉ tạo bộ khung cho sự khoáng hóa của xương mà còn có vai trò quan
trọng trong quá trình gắn và tăng sinh của các tế bào. Trong các loại vật liêu
sử dụng trong ghép xương, collagen được cho là ít gây phản ứng miễn dịch


4
[15], hỗ trợ sự gắn và phát triển của tế bào xương và sự tái tạo mô xương
[16].
Chất nền ngoại bào của xương cũng chứa các loại protein khác, chúng
tạo nên chất căn bản của xương và chiếm khoảng 10 – 15% lượng protein của
chất nền ngoại bào [14]. Các protein này đóng vai trò rất quan trọng trong quá
trình tăng trưởng, phát triển, sửa chữa và đổi mới của xương. Ở mô xương, cả
collagen và chất căn bản đều bị khoáng hóa [12]. Bốn nhóm protein không
phải collagen trong chất căn bản xương bao gồm:
- Các đại phân tử proteoglycan: bao gồm một lõi protein gắn với nhiều
chuỗi

bên

glycosaminoglycan

bằng

liên

kết

cộng

hóa

trị.

Các

glycosaminoglycan chủ yếu gồm hyaluronan, chondroitin sulfat và keratin
sulfat. Chúng giúp làm tăng sức chịu nén của xương đồng thời cũng có vai trò
gắn với các yếu tố tăng trưởng và có thể ức chế sự khoáng hóa [12].
- Các glycoprotein kết nối: có chức năng gắn các tế bào xương và các
sợi collagen với chất căn bản đã khoáng hóa. Một số glycoprotein quan trọng
là osteonectin (có vai trò như một lớp keo gắn collagen và tinh thể HA) và các
sialoprotein như osteopontin (trung gian gắn kết các tế bào với chất nền),
sialoprotein I và II (trung gian gắn kết các tế bào và khởi phát sự hình thành
canxi phosphate trong quá trình khoáng hóa) [12].
- Các protein phụ thuộc vitamin K đặc biệt của xương: bao gồm
osteocalcin (giữ calci từ hệ tuần hoàn, thu hút và cảm ứng hủy cốt bào trong
quá trình tu sửa xương), protein S (hỗ trợ trong việc loại bỏ các tế bào thông
qua apoptosis), và Gla- protein trong chất nền (MGP) (tham gia vào sự vôi
hóa mạch máu) [12].
- Các yếu tố tăng trưởng và các cytokines: chúng là các protein điều
hòa nhỏ bao gồm các yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGFs), yếu tố hoại tử

khối u α (TNF- α), yếu tố tăng trưởng biến đổi β (TGF- β), các yếu tố tăng
trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGFs), protein tạo hình xương (BMP), và


5
các interleukin (IL- 1, IL- 6). Đáng chú ý nhất trong nhóm này là các BMP, do
chúng kích thích các tế bào trung mô biệt hóa thành tạo cốt bào và tế bào tạo
xương [12].
1.1.1.2. Thành phần vô cơ
Thành phần vô cơ của xương chủ yếu là HA Ca 10(PO4)6(OH)2) và một
lượng nhỏ các muối carbonate, magnesium và acid phosphate. Các tinh thể
HA hoàn thiện trong xương có hình đĩa, kích thước dài và rộng trung bình của
đĩa là 50 x 25nm, chiều dày khoảng 2 – 3 nm [17]. Khoảng 4 – 6% các nhóm
PO42- được thay thế bởi nhóm CO32-. Các tinh thể carbonate apatite nhỏ (kích
thước tinh thể 10 – 60nm) và dễ hòa tan, cho phép chúng dễ dàng tham gia
vào quá trình chuyển hóa chất khoáng của cơ thể [14]. Trong khi đó,
magnesium được chứng minh là ức chế quá trình hình thành tinh thể HA trong
dung dịch, nó có thể thay thế cho calci trong cấu trúc của tinh thể HA và chủ
yếu được hấp thu ở bề mặt của tinh thể, magnesium giúp ổn định cấu trúc tinh
thể HA [18].
Các tinh thể HA đã được chứng minh là có khả năng tương thích sinh
học cao, phân hủy chậm, khả năng dẫn xương và khả năng cảm ứng tạo
xương tốt [17],[19], do đó, các sản phẩm HA tự nhiên hoặc tổng hợp ngày
càng được ứng dụng rộng rãi để kích thích tạo xương, bao bọc các implant
hoặc sử dụng như một chất làm đầy trong xương và răng [20],[21].
1.1.2. Các tế bào
Trong xương đang hoạt động phát triển tích cực, có thể phân biệt 4 loại
tế bào: tiền tạo cốt bào, tạo cốt bào, tế bào xương và hủy cốt bào [11]. Ngoại
trừ hủy cốt bào, các tế bào còn lại được xem như các dạng biệt hóa khác nhau
của cùng một dòng tế bào, chúng trải qua quá trình biến đổi từ dạng kém biệt

hóa sang các dạng biệt hóa cao hơn, kèm theo đó là sự biến đổi về mặt chức
năng. Ngược lại, hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào khác có chức


6
năng hủy muối khoáng và các protein của chất nền ngoại bào, chức năng này
có vai trò rất quan trọng trong quá trình sửa chữa và tái tạo xương [12].
1.1.2.1. Tiền tạo cốt bào
Tiền tạo cốt bào có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô. Chúng thường
xuất hiện ở lớp trong của màng xương, lợp mặt trong ống Havers. Tiền tạo cốt
bào là những tế bào có nhân hình bầu dục hoặc hơi dài, bào tương bắt màu
acid kém, đôi khi hơi ưa base. Các tế bào này hoạt động rất tích cực trong quá
trình phát triển bình thường của xương, ở cơ thể trưởng thành, chúng tích cực
tham gia vào sự sửa chữa xương và hàn gắn xương gãy. Khi thực hiện các
chức năng này, các tiền tạo cốt bào tăng nhanh về số lượng bằng cách gián
phân rồi biệt hóa thành các tạo cốt bào [11].
Yếu tố chính khởi phát quá trình biệt hóa của tiền tạo cốt bào là yếu tố
phiên mã core binding factor alpha- 1 (CBFA- 1). Protein này kích thích sự
biểu hiện các gen quy định các đặc tính của tạo cốt bào. Như đã trình bày ở
trên, BMP cũng có vai trò trong sự biệt hóa của tiền tạo cốt bào [12].
1.1.2.2. Tạo cốt bào
Tạo cốt bào là những tế bào đa diện, nhân lớn hình cầu, bào tương ưa
base và có nhánh nối với nhau hoặc với những tê bào nằm trong tủy xương,
chúng thường xếp thành một hàng trên mặt các bè xương đang hình thành
[11].
Nơi nào có sự tạo xương thì ở nơi đó tạo cốt bào xuất hiện [11]. Chúng
tạo ra collagen type I và các protein của chất căn bản. Tạo cốt bào cũng tham
gia vào quá trình calci hóa của chất nền ngoại bào. Osteocalcin và các
sialoprotein khác do tạo cốt bào bài tiết ra có vai trò gắn Ca 2+ làm tăng nồng
độ tại chỗ của ion này. Nồng độ cao của Ca 2+ kích thích tạo cốt bào bài tiết

alkaline phosphate (ALP), enzyme này làm tăng nồng độ tại chỗ của ion
PO42-. Nồng độ ion PO42- cao lại kích thích làm tăng nồng độ ion Ca 2+ tại vị trí


7
xảy ra sự khoáng hóa của chất nền. Ở giai đoạn nồng độ Ca 2+ và PO42- ngoại
bào cao, các tạo cốt bào giải phóng các túi bài tiết nhỏ (đương kính 50 –
200nm) vào chất nền. Các túi này rất giàu ALP và pyrophosphatase, hai
enzyme này có tác dụng tách PO 42- ra khỏi các phân tử khác của chất nền. Sự
tích tụ Ca2+ và PO42- tại chỗ tạo ra các điểm đẳng điện, dẫn đến hình thành các
tinh thể CaPO4 xung quanh các túi bài tiết. Các tinh thể CaPO 4 gây ra sự
khoáng hóa chất nền bằng cách hình thành và lắng đọng các tinh thể
hydroxyapatite trong chất nền xung quanh tiền tạo cốt bào [12].
Trong quá trình tạo xương mới, một số tạo cốt bào tự vùi trong chất căn
bản do chúng tạo ra và trở thành tế bào xương [11].
1.1.2.3. Tế bào xương
Trong xương đã được hình thành hoàn thiện, tế bào xương là những tế
bào chính và chủ yếu [11].
Thân tế bào xương dài khoảng 20 – 30µm, nằm trong các hốc gọi là ổ
xương. Từ thân tế bào có nhiều nhánh bào tương nhỏ, các nhánh bào tương
này đi trong các tiểu quản xương tới tiếp xúc với những nhánh bào tương của
tế bào bên cạnh bằng các liên kết khe. Dưới kính hiển vi quang học không thể
quan sát được hình ảnh các nhánh bào tương này, để quan sát chúng phải sử
dụng kính hiển vi điện tử [11].
Các tế bào xương có ảnh hưởng rất rõ ràng đến đặc tính của chất nền
[11]. Chúng đảm nhận vai trò đáp ứng với các lực cơ học tác dụng lên xương
bằng các hoạt động hóa học (mechanotransduction). Các kích thích cơ học
khác nhau (như trạng thái không trọng lực hoặc tình trạng tăng chịu lực)
không chỉ ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen mà còn làm thay đổi cơ chế
chết theo chương trình của tế bào xương. Tế bào xương có thể tổng hợp chất

nền mới cũng như tham gia vào quá trình phân hủy chất nền, các hoạt động
này giúp duy trì cân bằng nồng độ calci nội môi [12]. Các tế bào xương chết


8
do tổn thương, già hết chức năng hoặc chết theo chương trình gây ra sự tái
hấp thu chất nền nhờ hoạt động của hủy cốt bào, tiếp sau đó là sự sửa chữa
hoặc hình thành mô xương mới nhờ hoạt động của tạo cốt bào [12].
1.1.2.4. Hủy cốt bào
Khác với các loại tế bào trên, hủy cốt bào có nguồn gốc từ tế bào tiền
thân định hướng dòng bạch cầu hạt – đại thực bào trong tủy xương [11].
Chúng là những tế bào rất lớn, đường kính 20 – 100µm, có nhiều nhân
(50 – 60 nhân), bào tương ưa acid [11].
Chỗ nào sụn hay xương cần phá hủy thì chỗ đó hủy cốt bào xuất hiện.
Chúng hủy muối khoáng, tiêu hủy protein của chất nền bằng các enzyme
trong lysosme [11]. Giai đoạn đầu tiên của quá trình phân hủy chất nền là sự
acid hóa bề mặt xương, gây ra sự tan rã của chất khoáng trong chất nền. Bào
tương của các hủy cốt bào có chứa carbonic anhydrase II, enzyme này tạo ra
carbonic acid (H2CO3) từ carbonic và nước. Sau đó, acid carbonic phân ly
thành bicarbonate (HCO3-) và proton (H+). H+ được bơm ra ngoại bào thông
qua bơm proton phụ thuộc ATP, tạo ra pH thấp (4 – 5) trong vi môi trường mà
tại đó xảy ra sự tái hấp thu. pH acid của môi trường gây ra sự giáng hóa của
các thành vô cơ trong xương (chủ yếu là HA) thành ion calci, phosphate và
nước. Sau đó, các enzyme thủy phân trong lysosome của hủy cốt bào
(cathepsine K và matrix metalloproteinase) sẽ thủy phân collagen và các
protein khác của chất nền. Khi quá trình tái hấp thu các sản phẩm giáng hóa
của chất nền hoàn tất, các hủy cốt bào sẽ trải qua quá trình chết theo chương
trình [12].
1.1.3. Cấu trúc mô xương
Trong quá trình hình thành xương, tạo cốt bào tiết ra chất căn bản các

phân tử procollagen gồm 3 chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau thành cấu trúc
xoắn ba. Trong chất căn bản, procollagen peptidase tách các “petid điều


9
khiển” khỏi procollagen để hình thành các phân tử tropocollagen. Các phân tử
tropocollagen tập hợp rồi trùng hợp theo một trình tự nhất định để hình thành
nên các xơ collagen – đơn vị hình thái của sợi collagen. Theo chiều dài, các
phân tử tropocollagen gần nhau trên cùng một hàng cách nhau một khoảng
40nm. Theo chiều ngang, các phân tử xếp song song với nhau, hai phân tử
trên hai hàng sát nhau đứng so le nhau một khoảng 28nm (do đó tạo nên hình
ảnh vân ngang có chu kỳ 68nm của xơ collgen trên kính hiển vi điện tử) [11].
Quá trình khoáng hóa chất nền tạo ra các tinh thể hydroxyapatite, các
tinh thể nằm trong các khoảng trống ở giữa hai đầu các phân tử tropocollagen,
trục của các tinh thể song song với trục dài của các sợi collagen.
Các sợi collagen và các thành phần khác của chất nền ngoại bào đã bị
khoáng hóa tạo nên các lá xương dày 3 – 7µm, trong mỗi lá xương, các sợi
collagen xếp song song với nhau và tạo góc với các sợi collagen thuộc lá
xương sát cạnh [22].
Ở xương đặc, các lá xương quây xung quanh một ống trung tâm gọi là
ống Havers, khoảng 3 – 8 lá xương đồng tâm và song song với trục dài của
xương, quây quanh một ống Havers tạo thành một hệ thống Havers [11],[22].
Xương xốp được tạo bởi các lá xương không đều nhau, ngoằn ngoèo,
cuộn lại, tạo thành các bè xương hình que hoặc hình bè, các bè xương này liên
kết với nhau tạo nên một bộ khung ngăn cách không hoàn toàn các hốc
xương. Trong các hốc xương có chứa tủy tạo huyết [11],[22].
Xương đặc và xương xốp do tủy xương tạo thành [11].
Ở xương cốt mạc, loại xương được hình thành bởi màng xương, các lá
xương tiếp tuyến với bề mặt ngoài của xương (mà không hình thành nên hệ
thống Havers), bao quanh chu vi của miếng xương [11],[22].

Xương mà có cấu trúc lá xương được xếp vào loại xương lá.
Trong quá trình cốt hóa và quá trình liền xương, loại xương mà chất
nền ngoại bào không tạo nên cấu trúc lá xương và các sợi collagen sắp xếp


10
không có định hướng bao giờ cũng xuất hiện trước, xương này gọi là xương
lưới hay xương nguyên phát. Sau đó, xương lưới sẽ dần được thay thế bằng
xương lá (xương thứ phát) [11],[22].
Trong các lá xương có những ổ xương chứa tế bào xương. Từ các ổ
xương có những ống nhỏ tỏa ra xung quanh liên hệ với những ổ xương bên
cạnh, gọi là vi quản xương. Trong vi quản xương có các nhánh của tế bào
xương liên hệ với các nhánh của tế bào xương lân cận [11].
1.1.4. Tủy xương
Là mô liên kết nằm trong các hốc tủy ở đầu xương dài, xương xốp và
cả trong ống tủy ở thân xương dài. Ở trẻ sơ sinh, toàn bộ tủy xương là tủy đỏ,
có chức năng tạo máu. Trong quá trình con người trưởng thành, khoảng một
nửa tủy xương sẽ chuyển thành tủy vàng, giàu tế bào mỡ và không tham gia
tạo máu. Tuy nhiên khi cơ thể thiếu O 2, tủy vàng có thể chuyển thành tủy đỏ
[11].
1.1.5. Màng xương
- Màng ngoài: là một màng liên kết bao bọc miếng xương, trừ ở mặt khớp.
Màng ngoài xương gồm hai lớp, trong đó lớp ngoài chủ yếu tạo bởi các bó sợi
collagen, lớp trong có nhiều tiền tạo cốt bào và tạo cốt bào, có vai trò tạo ra
xương cốt mạc, do đó nó còn được gọi là lớp sinh xương [11].
- Màng trong: lót bên trong các khoang xương, bao gồm một lớp tiền tạo cốt
bào, vì vậy nó cũng có chức năng sinh xương [11].
1.2.

Các phương pháp khử protein của xương

1.2.1. Khử protein bằng hydrogen peroxide
Hydrogen peroxide có công thức hóa học là H 2O2, là một chất dạng lỏng
trong suốt, hơi nhớt hơn nước. H2O2 có tính oxy hóa mạnh, tương đối bền và
không tích điện do đó có thể dễ dàng đi qua màng tế bào [23]. Nồng độ sắt rất


11
thấp trong hầu hết các loại dịch trong cơ thể cũng đủ để xúc tác sự tạo thành
gốc tự do hydroxyl (∙OH) từ H2O2 (Phản ứng Fenton). Gốc tự do này phản ứng
với hầu hết các thành phần trong tế bào [23].
Đối với lipid, các gốc tự do có thể tác động trực tiếp vào chuỗi acid béo
không no trên màng tế bào và hình thành lipid peroxidation. Ảnh hưởng chính
của lipid peroxidation là làm giảm tính lỏng của màng tế bào do đó làm thay
đổi đặc tính của màng và phá vỡ liên kết giữa màng tế bào và các protein
màng. Phản ứng này cũng tạo ra thêm nhiều gốc tự do, và nhiều acid béo
không no bị giáng hóa thành nhiều sản phẩm, trong đó có các aldehyde. Các
aldehyde này rất hoạt động và có thể tác dụng với nhiều phân tử khác như
protein [24].
Đối với AND, các gốc tự do tác động cả lên gốc đường và base, tạo nên
các đoạn đứt gẫy dạng chuỗi đơn hoặc chuỗi kép, các sản phẩm của base và
đường và hình thành liên kết ngang với các phân tử khác, do đó ngăn chặn
quá trình phiên mã [25].
Đối với protein, nhiều loại tổn thương dưới tác dụng của các gốc oxi hóa
tự do đã được ghi nhận, bao gồm: oxi hóa nhóm sulfhydryl, giáng hóa các
hợp chất disulfide, oxi hóa các acid amin gần vì trí gắn kim loại do kim loại
xúc tác quá trình oxi hóa, phản ứng với các aldehyde, biến đổi các nhóm chức
hoặc các nhóm kim loại, hình thành liên kết ngang giữa các protein và gây ra
sự đứt gẫy chuỗi peptid.
Năm 1957, German Bauermeister và cộng sự tìm ra phương pháp xử lý

xương bê bằng cách ngâm trong ducng dịch hydrogen peroxide 30% và sát
khuẩn bằng khí ethylene oxide, sản phẩm tạo thành được gọi là xương Kiel
[10]. Mặc dù lượng protein trong xương Kiel còn lại tới 31% [10], sản phẩm
này đã được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng tại Đức, Mỹ, Anh, với những kết
quả khả quan đã được ghi nhận. Loại xương tại vị trí nhận ghép được xem là
yếu tố quyết định sự thành công của ghép xương Kiel. Dưới điều kiện lý


12
tưởng, khi mà cả xương ghép và xương tại vị trí nhận ghép đều là xương xốp,
xương Kiel được đánh giá là đem lại hiệu quả tương đương với xương ghép
tự thân [26]. Ghép xương Kiel cũng được ghi nhận là không gây ra phản ứng
miễn dịch và mảnh xương ghép có sự liên kết chặt chẽ và hợp nhất với xương
của người nhận [27]. Một yếu tố quan trọng khác quyết định đến sự thành
công của ghép xương Kiel là mức độ tổn thương, xương Kiel có vẻ thích hợp
để lấp đầy các lỗ hổng nhỏ của xương xốp, trong khi những tổn thương lớn ở
vùng chịu lực thì nên sử dụng xương ghép tự thân [27]. Nguyên nhân của hiện
tượng này có thể giải thích do tốc độ tạo xương sau ghép xương Kiel chậm
hơn sau ghép xương tự thân khi kiểm tra bằng phim chụp X- quang dẫn tới
giảm độ vững của xương Kiel so với xương ghép tự thân [27].
1.2.2. Khử protein bằng dung dịch kiềm
Trong gần 40 năm qua, nhiều nghiên cứu sử dụng các dung dịch kiềm
để tách các thành phần hữu cơ và vô cơ trong chất căn bản đã được tiến hành.
Phương pháp khử protein bằng hydrazine (N2H4) lần đầu tiên được đề
xuất bởi Termine và cộng sự năm 1973 [28]. Đây là một trong những phương
pháp hiệu quả nhất để tách thành phần vô cơ ra khỏi thành phần hữu cơ trong
xương mà không làm thay đổi đáng kể các đặc tính lý hóa của chúng. Song do
hydrazine là một chất rất độc nên phương pháp này chủ yếu được sử dụng
trong nghiên cứu thành phần khoáng của xương.
Fattibene và cộng sự (2006) tiến hành đánh giá phương pháp khử

protein trong ngà răng bằng dung dịch Natri hydroxide (NaOH). Tuy nhiên
phương pháp này gây ra những biến đổi trong tính chất lý hóa của vật liệu
đồng thời làm tăng độ nhạy với bức xạ của ngà răng [29].
Natri hypochlorite (NaOCl) cũng được sử dụng để khử protein trong
xương bò. NaOCl là một chất oxy hóa mạnh và được sử dụng rộng rãi trong y
tế như một chất khử khuẩn. Mặc dù một số nghiên cứu trước đây cho rằng


13
NaOCl gây ra những biến đổi trong cấu trúc xương [30], nghiên cứu của Chen
và cộng sự năm 2011 đã chứng minh khả năng khử hoàn toàn protein trong
mẫu xương bò của NaOCl, đồng thời, xương bò khử protein bằng NaOCl duy
trì được cấu trúc vi thể và siêu vi thể của pha khoáng khi so sánh với sản
phẩm xương bò khử protein bằng nhiệt hiện được sử dụng rộng rãi trên thị
trường – Bio- OSS [31]. Nghiên cứu này cũng cho thấy xương bò khử protein
có cấu trúc mạng lưới bè xương giống như xương không qua xử lý và xương
khử khoáng [31], điều này góp phần củng cố giả thuyết cho rằng pha khoáng
của xương cũng tạo thành các cấu trúc dạng tấm và liên kết chặt chẽ với các
sợi fibrin. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đánh giá khả năng dung nạp và
tác dụng của xương bò khử protein đối với quá trình tạo xương trên động vật
thực nghiệm cũng như trên lâm sàng.
1.2.3. Khử protein bằng nhiệt
Dựa vào nhiệt độ của quá trình khử protein của xương, người ta phân
loại xương bò khử protein bằng nhiệt thành 2 loại: nung kết và không nung
kết [5].
Phân tích khối phổ kế các khí sinh ra trong quá trình khử protein xương
bằng nhiệt đã xác định được 3 khoảng nhiệt:
- Từ nhiệt độ phòng tới khoảng 2000C: nước và các chất hòa tan bị loại
bỏ.
- Trên 3000C: các chất hữu cơ như collagen, mô mỡ, các protein bắt đầu

phân hủy và ở nhiệt độ 4000C, chỉ còn lại chất khoáng.
- Từ 4000C – 9000C: carbonat apatite cũng bị phân hủy.
Do đó, xử lý nhiệt ở 3000C không ảnh hưởng đến cấu trúc tinh thể và
thu được chất khoáng xương bò không nung kết với hàm lượng calci và
phospho lần lượt là 37% và 18% (tỷ lệ Ca:P = 2,1 ± 0,1), có chứa những tinh
thể carbonate apatite nhỏ, tương tự với mô xương người bình thường. Chất


14
khoáng thu được cũng duy trì được các đặc điểm cấu trúc đại thể của xương
bò (kích thước lỗ 300 – 1500 µm, độ xốp 70 – 75%, diện tích bề mặt riêng
97m2/g).
Mặt khác, khi xử lý ở nhiệt độ > 10000C thu được chất khoáng xương
bò nung kết chứa những tinh thể HA lớn và thiếu hụt CO 32-. Thêm vào đó,
những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng chất khoáng xương bò nung kết
cũng làm thay đổi cấu trúc đại thể của xương xốp do kích thước các lỗ xốp
của chất khoáng xương bò nung kết nhỏ hơn nhiều so với chất khoáng xương
bò không nung kết [5].
1.2.4. Khử protein bằng pepsin
Pepsin là loại men tiêu hóa do tế bào chính của các tuyến đáy vị nằm
trong lớp đệm của tầng niêm mạc dạ dày bài tiết. Trong cơ thể, pepsin được
bài tiết dưới dạng không hoạt động là pepsinogen. Pepsinogen được hoạt hóa
bởi HCl. Enzyme này hoạt động mạnh nhất ở pH từ 2 đến 3 và bị bất hoạt ở
pH > 5. Pespsin là một endopeptidase có tác dụng thủy phân protein thành các
proteose, pepton và polipeptid. Pepsin cũng có tác dụng thủy phân collagen
trong mô liên kết [32].
Năm 2015, Pengfei và cộng sự đề xuất phương pháp khử protein trong
xương bò bằng pepsin. Kết quả nghiên cứu cho thấy so với xử lý bằng H 2O2,
xương bò khử protein bằng pepsin không có sự khác biệt về cấu trúc hình thái
và tính chất vật lý. Tuy nhiên, sản phẩm khử protein xương bò bằng pepsin có

hàm lượng protein thấp hơn và hàm lượng collagen typ I cao hơn. Nghiên cứu
thực nghiệm trên thỏ cũng cho thấy rằng xương bò khử protein bằng pepsin
bộc lộ khả năng kích thích tạo xương tốt hơn so với khử protein bằng H 2O2 [6].
Kết quả này giúp củng cố giả thuyết cho rằng collagen là vật liệu ít gây phản
ứng miễn dịch và có vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương.


15
1.3.

Các phương pháp đánh giá hàm lượng protein trong xương
Để xác định hàm lượng protein còn lại trong xương sau quá trình xử lý,

các phương pháp sau thường được lựa chọn:
1.3.1. Phương pháp Kjeldahl
Phương pháp Kjeldahl dựa trên lý thuyết là lượng nitrogen có trong các
protein là gần giống nhau và không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn
protein, do đó ta có thể xác định gián tiếp lượng protein thông qua định lượng
nitrogen [33].
Để định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl, trước tiên người ta
vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và chất xúc tác.
t
R – CH – COOH + H2SO4Xúc tác
CO2 + H2O + (NH4)2SO4
NH2
Sau đó dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4.
(NH4)2SO4 + 2 NaOH

Na2SO4 + 2NH3 + 2 H2O

NH3 tạo thành từ phản ứng trên được hứng vào bình chứa dung dịch H 2SO4 đã
biết trước nồng độ.
NH3 + H2SO4

(NH4)2SO4 + H2SO4 dư

Cuối cùng, đem chuẩn độ lượng H 2SO4 còn dư, từ đó tính được lượng
nitrogen có trong mẫu.
Lượng protein được tính bằng lượng nitrogen nhân với 6,25 với giả thiết rằng
protein luôn chứa 16% nitrogen [33].
1.3.2. Phương pháp Lowry
Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản
phẩm khử của phosphomolipden – phosphowolframate (thuốc thử Folin –
ciocalteau) với phức hợp đồng – protein. Phức hợp màu xanh tạo thành có thể
đo ở bước sóng 675nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với


16
nồng độ protein, dựa vào đồ thị chuẩn protein ta có thể tính được hàm lượng
protein trong mẫu nghiên cứu [33].
Phương pháp Lowry có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein
trong dung dịch ở nồng độ 1g/ml do đó được sử dụng rộng rãi để xác định
nhiều loại protein. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là màu của
phản ứng bị thay đổi bởi một số tạp chất, do đó, phương pháp này chỉ cho kết
quả chính xác khi protein đã được tinh sạch.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (HPLC – MS)
Phương pháp này ứng dụng kết hợp 2 kỹ thuật khác nhau là sắc ký lỏng
cao áp (high performance liquid chromatoghraphy – HPLC) và đo khối phổ
(mass spectrometry – MS).
Sắc ký lỏng cao áp ra đời từ năm 1967 trên cơ sở phát triển và cải tiến

từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Sắc ký là là một họ các kỹ thuật hóa phân
tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau
của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Phương pháp này bao gồm việc cho
mẫu chứa chất cần phân tích trong “pha động” thường là dòng chảy của dung
môi, di chuyển qua “pha tĩnh”. Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành
phần trong mẫu. Do các thành phần khác nhau di chuyển qua hệ thống với tốc
độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. HPLC là một sắc
ký cột đi kèm với một đầu dò nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra
trong quá trình sắc ký. Phương pháp này sử dụng một hệ thống bơm cao áp để
đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 300atm nhằm tạo dòng chảy với lưu
lượng khoảng vài ml/phút. Số lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần
khoảng 200µl.
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách
đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển
động của các ion trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỷ số giữa


17
khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đến sự chuyển động này
của các ion. Nếu biết được điện tích của các ion ta sẽ dễ dàng xác định được
khối lượng của ion đó. Khi phân tích khối phổ của một chất, chất đó sẽ được
chuyển sang trạng thái hơi sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích
hợp. Các ion được tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối
của máy khối phổ.
Tuy nhiên, phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao,
nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ;
trong khi hệ thống HPLC hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi
tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Do đó,
cần phải có một kỹ thuật trung gian: kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển
(Atmospheric Pressure Ionization – API), ưu điểm nổi bật của phương pháp

này là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay tại buồng ion hóa.
Đây là một phương pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh, tuy nhiên
phương pháp này có giá thành khá cao, trang thiết bị đắt tiền.
1.4.

Cơ chế sinh học của ghép xương

Ghép xương là phương pháp điều trị có hiệu quả cao do mô xương không
giống như phần lớn các mô khác trong cơ thể, có khả năng tái tạo hoàn toàn
nếu được cung cấp một không gian thích hợp. Giống như sự phát triển bình
thường của xương, mô xương sẽ phát triển và thay thế hoàn toàn vật liệu
ghép, tạo ra một vùng xương mới hình thành [34]. Cơ chế sinh học của ghép
xương dựa trên ba hiện tượng: sự cảm ứng tạo xương, sự dẫn xương, và sự tạo
xương [2].
1.4.1. Sự cảm ứng tạo xương
Ngoài những tế bào đã biệt hóa như tế bào xương, hủy cốt bào, trong
mô xương và mô liên kết còn chứa những tế bào chưa hoặc kém biệt hóa.
Những tế bào này rất quan trọng trong quá trình sửa chữa tổn thương xương


18
hoặc hàn gắn mô ghép do chúng có thể được chiêu mộ và biệt hóa thành
những tế bào có chức năng tạo xương. Bằng những kích thích phù hợp (yếu tố
cảm ứng), một tế bào trung mô chưa biệt hóa có thể được chiêu mộ đến vùng
tổn thương và biệt hóa thành tiền tạo cốt bào – quá trình này gọi là sự cảm
ứng tạo xương [35].
Trong nhiều năm qua, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để xác định
các yếu tố cảm ứng sự tạo xương, trong đó BMP có lẽ là yếu tố được quan
tâm nhất. Cho đến nay, 15 loại BMP đã được phát hiện và mô tả, trong đó
BMP 2, 4, 5, 6 và 7 đã được chứng minh là yếu tố quan trọng trong sự hình

thành và sửa chữa mô xương. Các BMP khác nhau có khả năng kích thích tạo
xương không gống nhau. Ví dụ, để tạo ra một lượng xương tương đương, cần
một số lượng BMP- 5 nhiều hơn so với BMP- 2 và BMP- 7 [36]. BMP- 7 của
người tái tổ hợp, còn được gọi là protein- 1 osteogenic (OP- 1), hiện được sử
dụng trên lâm sàng để kích thích sự phát triển xương sau phẫu thuật các
khiếm khuyết lớn xương, phẫu thuật cột sống, hoặc sau phẫu thuật ghép
xương [12].
BMP được giải phóng tự nhiên trong quá trình đáp ứng với tổn thương
và sửa chữa mô xương và là yếu tố cảm ứng tạo xương duy nhất được biết rõ.
Tuy nhiên, nhiều kích thích vật lý như lực ép hoặc các loại tín hiệu điện đã
được chứng minh là có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự cảm ứng tạo
xương [35].
Mặc dù đã bị loại bỏ bớt thành phần hữu cơ, xương bò khử protein đã
được chứng minh rằng vẫn giữ được khả năng cảm ứng tạo xương bằng các
thử nghiệm trên động vật. Người ta thấy rằng, xương bò khử protein kích
thích sự tạo xương ở vị trí ngoài khung xương mà không cần thêm vào vị trí
ghép các tế bào tạo xương hay BMP [37]. Việc cấy ghép vào mô mềm đã
chứng minh khả năng cảm ứng tạo xương tuy nhiên, cơ chế cảm ứng tạo
xương của xương bò khử protein vẫn chưa được làm rõ. Nhiều báo cáo gần


19
đây chỉ ra rằng, các vật liệu sinh học có tỷ lệ calci/ phosphor và cấu trúc xốp
hợp lý bộc lộ khả năng cảm ứng tạo xương [38],[39].
1.4.2. Sự dẫn xương
Sự dẫn xương xuất hiện khi vật liệu ghép cung cấp một “bộ khung” cho
sự hình thành xương mới [2].
Sự phát triển của xương trên vật liệu ghép phụ thuộc vào hoạt động của
các tế bào xương đã biệt hóa, do đó có thể nói sự dẫn xương phụ thuộc vào
mức độ của hoạt động cảm ứng tạo xương trước đó. Thêm vào đó, sự phát

triển của xương không thể xảy ra nếu thiếu các mạch máu nuôi dưỡng [35].
Xương bò khử protein không những loại bỏ được các thành phần hữu
cơ có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch mà còn duy trì được cấu trúc tự
nhiên, cung cấp một bộ khung thích hợp cho các tế bào và mạch máu xâm
nhập và phát triển [4].
Trong các nghiên cứu in vitro, xương bò khử protein thể hiện khả năng
hỗ trợ các tạo cốt bào phân lập từ xương sọ của chuột xâm nhập, tăng sinh,
lan rộng và tổng hợp chất nền [40]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật
và trên người cũng chứng minh khả năng dẫn xương tốt của xương bò khử
protein [41],[42].
1.4.3. Sự tạo xương
Tạo xương là quá trình hình thành và phát triển của mô xương, quá
trình này xảy ra thường xuyên, liên tục trong đời sống cá thể. Trong ghép
xương, sự tạo xương phụ thuộc vào quá trình cảm ứng tạo xương trước đó và
khả năng dẫn xương của mô ghép [35]. Mô ghép được xem là có khả năng tạo
xương khi nó cung cấp cho tổn thương nguồn nguyên liệu tại chỗ cho quá
trình hàn gắn tổn thương, trong đó có các tế bào cần thiết cho quá trình tạo
xương [2]. Do đó, chỉ có mô xương tự thân có khả năng này.


20
1.5.

Đáp ứng miễn dịch trong ghép xương dị loài
Cơ thể bình thường khi nhận ghép đều có đáp ứng miễn dịch chống lại

mô ghép. Việc mô ghép sống hay bị thải bỏ được quyết định bởi các protein
do các gen nằm trong phức hợp gen phù hợp mô chủ yếu (MHC – Major
Histocompatibility Complex) mã hóa – gọi là kháng nguyên ghép hoặc kháng
nguyên phù hợp mô. Ở người, kháng nguyên phù hợp mô chủ yếu được gọi là

hệ thống HLA (Human Leucocyte Antigen). Phản ứng thải bỏ mô ghép gây ra
bởi hệ miễn dịch của người nhận và xảy ra khi có sự không phù hợp kháng
nguyên MHC giữa cơ thể cho và cơ thể nhận [43].
Các kháng nguyên trong hệ thống MHC được chia làm 2 lớp: lớp I và
lớp II. Các kháng nguyên lớp I có ở hầu hết các tế bào có nhân, hoạt động
những đơn vị nhận dạng, quyết định tính đặc hiệu trong việc tấn công bởi tế
bào lympho gây độc tế bào (Tc) chống các tế bào nhiễm virus, ung thư, các tế
bào khác alen. Trong khi đó, các kháng nguyên lớp II chỉ có mặt ở các tế bào
miễn dịch. Có nhiều bằng chứng cho thấy yếu tố hoạt hóa các đáp ứng của vật
chủ thải bỏ mô ghép chính là các kháng nguyên lớp II có trong bản thân mô
ghép hoặc trên bạch cầu lẫn trong mô ghép [43].
Việc loại bỏ các kháng nguyên có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch
là rất quan trọng trong ghép xương dị loài. Trong mô xương, các kháng
nguyên MHC biểu hiện trên các tế bào xương, tạo cốt bào, hủy cốt bào và các
tế bào của tủy xương [6]. Xương bò khử protein được chứng minh là có khả
năng dụng nạp tốt trên cơ thể vật chủ [44] và cho đến nay, chưa có trường hợp
dị ứng hay thải ghép nào liên quan đến vật liệu này được báo cáo [6].
1.6.

Nguy cơ truyền bệnh cho người nhận ghép

Ghép các mô có nguồn gốc từ bò, về lý thuyết có nguy cơ lây truyền bệnh
xốp não bò (bovine spongiform encephalopathy – BSE), thường được gọi là
bệnh bò điên, cho người nhận. BSE gây ra bởi prion – tác nhân gây bệnh đơn


21
giản hơn cả virus, có bản chất là protein và có thể truyền cho con người thông
qua tiêu thụ sản phẩm bị nhiễm bệnh [5].
Đáng tiếc là hiện nay chưa có xét nghiệm nào có khả năng chẩn đoán bệnh

xốp não ở động vật còn sống. Phương pháp duy nhất để chẩn đoán xác định
BSE là sinh thiết não bò sau chết và xét nghiệm xác định sự hiện diện của yếu
tố gây bệnh bằng cách tiêm mô hiến vào động vật [5].
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng xương bò khử protein
không gây nguy cơ truyền BSE cho người nhận [45]. Năm 1999, Sogal và
Tofe đã tiến hành một cuộc khảo sát đánh giá nguy cơ lây truyền BSE từ vật
liệu ghép có nguồn gốc từ xương bò dựa trên tiêu chuẩn đánh giá của bộ y tế
Liên bang Đức và tiêu chuẩn của Hiệp hội nghiên cứu và sản xuất dược phẩm
Mỹ. Kết quả từ những phân tích sử dụng cả hai tiêu chuẩn cho thấy nguy cơ
mắc BSE truyền từ vật liệu ghép có nguồn gốc từ xương bò là không đáng kể,
có thể là do sự nhiêm ngặt trong việc việc lựa chọn nguồn nguyên liệu và quá
trình xử lý các sản phẩm thương mại [46]. Do đó, để có thể ứng dụng các sản
phẩm xương bò khử protein trên lâm sàng, cần xây dựng các quy định chặt
chẽ trong việc lựa chọn nguồn nguyên liệu cũng như quy trình sản xuất.
1.7.

Một số nghiên cứu trên thế giới

1.7.1. Nghiên cứu thực nghiệm trên động vật
Năm 2015, Penfei và cộng sự tiến hành so sánh hai phương pháp khử
protein trong xương bò: sử dụng H2O2 và pepsin. Kết quả cho thấy sau cùng
một khoảng thời gian, lượng protein còn lại trong mẫu khử bằng H2O2 cao hơn
so với mẫu khử bằng pepsin, tuy nhiên lượng collagen typ I trong mẫu khử
bằng pepsin lại cao hơn so với mẫu khử bằng H 2O2. Đồng thời, để đánh giá
khả năng tạo xương, tác giả sử dụng hai loại vật liệu trên để ghép vào tổn
thương xương quay của thỏ. Sau 12 tuần, vị trí tổn thương được kiểm tra bằng
phim chụp X- quang, trong khi nhóm sử dụng phương pháp khử protein bằng


22

pepsin cho thấy sự liền xương gần như hoàn toàn và đường gãy xương đã biến
mất thì ở nhóm sử dụng phương pháp khử protein bằng H 2O2 sự liền xương
chưa hoàn toàn, và các đương gẫy vẫn có thể quan sát được trên phim chụp
X- quang. Dựa trên kết quả đạt được, tác giả cho rằng việc bảo tồn các phân
tử collagen typ I là rất quan trọng trong quá trình khử protein của vật liệu [6].
Moigan và cộng sự (2015) đánh giá sự hình thành xương mới khi ghép
xương bò khử protein vào tổn thương thực nghiệm trên xương sọ thỏ. Sau 30
ngày, cả mẫu ghép và mẫu chứng (không ghép vật liệu) đều thấy có phản ứng
viêm nhẹ trên tiêu bản mô học và lượng xương mới được tạo thành ở nhóm
ghép xương bò cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [47].
Ghiacci (2016) đề xuất phương pháp đánh giá quá trình hàn gắn tổn
thương, đặc biệt là các biến đổi sinh học xảy ra tại bề mặt tiếp xúc giữa mảnh
ghép và vật chủ. Nghiên cứu tiến hành ghép các khối xương bò khử protein
vào tổn thương của xương đỉnh của thỏ, trong đó, khối xương bò có chiều cao
lớn hơn chều dày của xương sọ chuột, vì vậy, một phần khối xương bò nằm
trong bề dày của mảnh xương sọ của thỏ, một phần khối xương lồi ra ngoài và
được che phủ bởi màng xương sọ của thỏ được giữ lại trong quá trình làm
phẫu thuật. Sau 1 hoặc 3 tháng, các khối xương được thu thập để đánh giá
hình thái và hóa mô miễn dịch tại 3 vùng: vùng tiếp xúc với xương thỏ, vùng
không tiếp xúc với xương thỏ và được che phủ bởi màng xương và vùng trung
tâm (xa vị trí tiếp xúc). Không trường hợp thải ghép hay dị ứng nào được ghi
nhận. Vùng tiếp xúc với xương thỏ cho lượng xương mới được tạo thành lớn
nhất và tăng theo thời gian. Vùng tiếp xúc với màng xương có chủ yếu là mô
xơ trong khi vùng trung tâm có một tỷ lệ lớn vật liệu ghép. Các mạch máu có
xu hướng phát triển từ ranh giới với xương thỏ vào trung tâm mảnh ghép. Các
tế bào tạo xương được tìm thấy ở vùng tiếp xúc với màng xương ở mẫu sau
ghép 1 tháng cho thấy màng xương là nơi chứa các yếu tố tạo xương [48].