Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

dP
ha
rm

ac
y,

KHOA Y DƯỢC

ed
ici
ne

an

ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ

M

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT

(Eclipta alba)

Sc

ho

ol

of

TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI

Co

py

rig

ht

@

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019


VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac

y,

KHOA Y DƯỢC

dP
ha
rm

Người thực hiện: ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ

ed
ici
ne

an

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI

M

(Eclipta alba)

: QH.2014.Y

Sc

Khóa

ho

ol

of

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

2. PGS.TS. Dương Thị Ly Hương

Co

py

rig

ht

@

Người hướng dẫn: 1. Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh

Hà Nội – 2019


VN
U

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y

ac
y,

Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa
Thực vật 2 – Viện Dược liệu.
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bài luận văn này, em đã nhận được

dP
ha
rm

rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học của Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Dược Liệu cùng gia đình và bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho em được
làm khóa luận tốt nghiệp.

ed
ici
ne

an

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Dương Thị Ly Hương,
PGS.TS. Đỗ Thị Hà, Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh, TS. Trần Thanh Hà cùng các
cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong
quá trình thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày 23 tháng 3 năm 2019
Sinh viên

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

Em xin chân thành cảm ơn!

Đinh Thị Nguyệt Ánh


13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

C-NMR

VN
U

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

H-NMR

ac
y,

(Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM

Dicloromethan

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DM

Dung môi

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DL/DM

Tỉ lệ dược liệu/dung môi

ESI-MS

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

ed
ici
ne

an

dP
ha
rm

CC

(Electronspray Ionization Mass Spectrum)
Etylacetat

HMBC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

of

M

EtOAc

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

ol

HSQC

@

MS

Sc

MeOH

ho

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

ht

SKĐ

rig

TLC

Co

py

UV-Vis

Methanol
Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)
Sắc ký đồ
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
Phổ tử ngoại (Ultra violet- Visible)


VN
U

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton.......................... 19
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin ............................... 20

ac
y,

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat ......................... 22

dP
ha
rm

Hình 1.1. Cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) ....................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid ............................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan ........................................... 5
Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid ............................................. 6

an

Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol.................................................... 6

ed
ici
ne

Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1 ............................... 7
Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 ............................... 8
Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen ...................... 8
Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi .................. 15

M

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của Cỏ nhọ

of

nồi .............................................................................................................. 16

ol

Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc ............................................... 17

ho

Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc ............................................... 17

Sc

Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc ............................................... 17
Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton)........................................ 18

@

Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) .............................................. 21

Co

py

rig

ht

Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất N03 (Methyl gallat) ........................................ 23


VN
U

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ac
y,

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

dP
ha
rm

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2
1.1. Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)......................................................................... 2
1.2. Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) ..................................................... 2
1.2.1. Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) ......................................... 2

an

1.2.2. Đặc điểm thực vật Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)........................................... 3

ed
ici
ne

1.2.3. Thành phần hóa học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) ....................................... 4
1.2.4. Tác dụng sinh học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) .......................................... 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Đối tượng ....................................................................................................... 12

M

2.2. Hoá chất, thiết bị............................................................................................. 12
2.2.1. Hoá chất ................................................................................................ 12

of

2.2.2. Thiết bị.................................................................................................. 12
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết ...... 13

ol

2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập ...................................................... 13

ho

2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ........................................ 14

Sc

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................................... 15

@

3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl
acetat ..................................................................................................................... 15
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi ...................................................... 15

ht

3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi.................................... 16

rig

3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi ......................... 18

Co

py

3.2.1. Biện luận cấu trúc N01 .......................................................................... 18
3.2.2. Biện luận cấu trúc N02 .......................................................................... 20
3.2.3. Biện luận cấu trúc N03 .......................................................................... 21


3.3. Bàn luận ......................................................................................................... 23

VN
U

3.3.1. Về chiết xuất ......................................................................................... 23
3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất ................................ 23
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 26

ac
y,

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

ed

ici
ne

an

dP
ha
rm

PHỤ LỤC


VN
U

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới rất thuận lợi cho sự phát triển của

ac
y,

nhiều loại cây thuốc. Với sự đa dạng, phong phú về cây thuốc đã tạo ra nguồn tài
nguyên dược liệu vô cùng quý báu cho nước ta. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng
những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp như:
cảm, sốt, chảy máu, đau bụng,… Đó là những bài thuốc được sử dụng rất phổ biến

dP
ha
rm

và được truyền lại từ đời này sang đời khác. Tuy nhiên những bài thuốc này mới chỉ
dựa trên kinh nghiệm của cha ông ta mà chưa có cơ sở về khoa học.
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã đi sâu vào nghiên
cứu làm sáng tỏ các thành phần, cấu trúc, tác dụng,… của các loài cây thường được

ed
ici
ne

an

sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Trong các nghiên cứu y dược hiện đại, các hợp
chất hữu cơ từ các cây thuốc như flavonoid, saponin, alkaloid, coumarin,…. là những
nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng để thử hoạt tính sinh học, phục vụ cho
nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là y học.

of

M

Một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền
là cây cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cây cỏ mực. Cỏ nhọ nồi là dược liệu được nghiên
cứu rất nhiều cả trong nước và quốc tế như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Thái
Lan,…với nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng nấm, cầm máu, chống ung thư…
và sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như: nôn, chảy máu
cam, rụng tóc, suy nhược thần kinh, nấm, viêm loét, lở ngứa, ban chẩn,…[2]

Sc

ho

ol

Trước sự đa dạng về cấu trúc lý hóa, hoạt tính sinh học cũng như mối tương
quan giữa cấu trúc và tác dụng, để hiểu được rõ hơn về vai trò của từng hợp chất có
trong cỏ nhọ nồi và đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc, ta cần tiếp tục
tiến hành tách chiết và xác định cấu trúc của các thành phần hóa học đặc biệt và các
thành phần chưa được phân lập trong cây, từ đó đặt tiền đề để nghiên cứu thêm về tác
dụng, hoạt tính sinh học của các hợp chất này.

ht

@

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ nhọ nồi, chúng tôi
thực hiện đề tài: “Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong
cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)” với 2 mục tiêu:

Co

py

rig

1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Ethyl acetat.
2. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn Ethyl acetat.

1

CHƯƠNG 1:

VN
U

TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)

ac
y,

Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là họ
lớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23.000 loài. Chúng thường tập trung chủ

dP
ha
rm

yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệt đới ẩm
với độ cao thấp. Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực vật được sử dụng
bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trên thế giới, đặc biệt
là cho các mục đích y học [8].
Các loài thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính,

ed
ici
ne

an

chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi
chín [1].
Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú và đa dạng, sự phát triển

M

của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ. Nguồn thông tin về các
hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt của các
hợp chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ phân loại
ở phân họ và cấp thấp hơn [8].

ol

of

1.2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

ho

Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta
alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1], [2].

Sc

Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có
vị trí phân loại như sau:

@

Giới Thực vật: Plantae

Co

py

rig

ht

Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida
Phân lớp Cúc: Asteridae
Bộ Cúc: Asterales
Họ Cúc: Asteraceae
Loài: Eclipta alba

2


1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [2]

VN
U

Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục,
đôi khi hơi đỏ tía, phủ lông cứng. Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục –
thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở cả

hai mặt. Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ở nách

ac
y,

lá hoặc ở ngọn cành. Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lông tơ ở mặt
lưng. Đế hoa lồi, rộng 1 cm. Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡi nhỏ, màu

Hình 1.1. Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [12]

@

Sc

ho

ol

of

M

ed
ici
ne

an

dP
ha

rm

trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5 thùy. Quả
bế dẹt, có 3 cạnh màu đen.

Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất. Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi

ht

hay phơi khô.

py

rig

Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11. Mọc hoang ở chỗ ẩm
mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m. Phân bố phổ biến khắp
nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á, châu

Co

Phi.

3


Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn. Quy kinh vào can và thận.

VN
U

Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc.
Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêm
gan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược
thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da. Còn dùng làm thuốc trong viêm

dP
ha
rm

1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

ac
y,

họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng
tóc.

Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có
chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids,
triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol,….Trong

ed
ici
ne

an

lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol. Rễ chứa hentriacontanol và
heptacosanol [15]. Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất nhexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit

triterpenic và wedelolactone [23].
a. Alkaloid

M

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất hiện

ol

of

của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính sinh
học verazine, dehydroverazine ecliptalbine. Năm 1998, M. S. Kader và cộng sự (Đại
học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của Eclipta

ho

alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid. Alkaloid chính được xác định là

Co

py

rig

ht

@

Sc

(20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)-verazine
(2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5
dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (4),
(20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25β-hydroxyverazine
(7) và 25β-hydroxyverazine (8) [4].

4


VN
U
ac
y,

2 R1=R2=H

dP
ha
rm

1 R1=R2=H
6 R1=OH, R2=H

5 R1=OH, R2=H
7 R1=H, R2=OH

ed
ici
ne

an

8 R1=H, R2=OH

3

4

b. Coumestan

of

M

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid

ho

ol

Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực
vật. Wedelolactone (9), demethylwedelolactone (10), demethyl-wedelolactone-7-

Co

py

rig

ht

@

Sc

glucosid (11) là các coumestan chính phân lập được từ cỏ nhọ nồi [33].

9 R=CH3
10 R=H
11 R=Glc
Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan
5


c. Flavonoid và Sterol

VN
U

Các flavonoid được tìm thấy trong cỏ nhỏ nồi là apigenin (12), luteolin (13),
luteolin-7-glucoside (14) và quercetin (15). Các sterol hiện diện trong cỏ nhọ nồi là

an

dP
ha
rm

ac

y,

phytosterol, glucoside của phytosterol, daucosterol (16), β-sitosterol (17),
stigmasterol (18) và stigmasterol-3-O-glycoside (19) [56].

ed
ici
ne

12

13 R1=H, R2=H
14 R1=Glc, R2=H
15 R1=H, R2=OH

16 R=Glc

18 R=H

17 R=H

19 R=Glc
Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid

6


d. Saponin triterpen

VN
U

Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit
oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53]. Năm 1997, S. Yahara và cộng
sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (2124) [55]. Năm 2008, M. K. Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã

ed
ici

ne

an

dP
ha
rm

ac
y,

phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III
(26-28) và eclalbasaponin V (29) [40].

Sc

ho

ol

of

M

25

28 R1=Glc, R2=Glc

26 R1=Glc, R2=OH, R3=Glc

29 R1=SO3H, R2=H

ht

@

20 R1=Glc, R2=H, R3=Ara

Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1

Co

py

rig

27 R1=Glc, R2=OH, R3=H

7


VN
U
ac
y,
dP
ha
rm

21 R=H

22 R=H

23 R=SO3H

24 R=SO3

Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2

an

e. Dẫn xuất thiophen và polyacetylen

ed
ici
ne

Năm 1966, F. Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin
Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ
nhọ nồi. Cùng năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ
đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba. Năm 1985,
P. Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và

ho

ol

of

M

phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34).

31

@

Sc

30

33

Co

py

rig

ht

32

34
Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen

8


f. Tinh dầu

VN
U

Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene, phytol,
octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid, (Z) -7,11dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9-tetramethyl-1,4,7-

dP
ha
rm

1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

ac
y,

cycloundecatriene. D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc α-terthienyl aldehyd, αterthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31].

a. Tác dụng giảm đau, chống viêm

Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid toàn
phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều 150mg/kg,

an

250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống. Tác dụng giảm đau này có hiệu quả như
nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47].

ed
ici

ne

Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã được

M

nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng.
Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường uống
cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằng
carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin (10mg/kg) và

of

cyproheptadine (8 mg/kg) [9].

b. Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm

ho

ol

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta alba
và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn. Các nghiên cứu cho thấy rằng

Sc

các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại Staphylococcus
aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18].

@

Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Hoạt tính kháng nấm

Co

py

rig

ht

in vitro của dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida
tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29].

9


c. Tác dụng bảo vệ gan

VN
U

Dịch chiết ethanol/nước (1:1) của Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl4 và
điều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan (amidopyrine-N-

ac
y,

demethylase và glucose-6-phosphatase liên kết màng). Nghiên cứu cho thấy rằng hoạt

động bảo vệ gan của Eclipta alba là sự điều chỉnh mức độ của các enzyme chuyển
hóa thuốc của microsome gan. Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết
chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8% và

dP
ha
rm

47,96% enzyme lysosomal. Từ dịch chiết methanol của lá, triterpenoid eclabasaponin
làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60,65% lượng CCl4 làm tăng enzyme
lysosomal trong máu. Coumestan và saponin triterpenoid từ dịch chiết chloroform
của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41% nồng độ CCl4. Eclipta alba được báo

an

cáo là có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan cấp tính do CCl4, bằng cách làm
giảm hoại tử, thoái hóa của các tế bào nhu mô gan [48], [50].

ed
ici
ne

d. Tác dụng lên thần kinh và chống độc

Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng dịch chiết Eclipta alba với liều 300
mg/kg cho thấy hoạt động của các chất cải thiện khả năng hoạt động của hệ thần kinh
ở chuột [51].

M

Chiết xuất ethyl acetate của Eclipta alba và wedelolactone đã chứng minh hoạt
tính chống tăng huyết áp và chống lại nọc độc rắn Malaya Pit Viper [44].

ol

of

Hoạt tính chống sốt rét của dịch chiết từ lá Eclipta alba đã được đánh giá là
chống lại chủng Plasmodium berghei ANKA ở chuột [10].

ho

e. Hoạt động diều hòa miễn dịch

@

Sc

Các nghiên cứu sơ bộ đã cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch của dịch chiết
methanol của Eclipta alba. Wedelolactone và demethylwedelolactone, được phân lập
từ Eclipta alba đã chứng minh tác dụng ức chế trypsin. Cả hai hợp chất cho thấy hoạt
động mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,9 và 3,0 μg/ml, tương ứng. Eclipta alba có tác

py

rig

ht

dụng bảo vệ các mô thần kinh có thể là do hoạt động điều hòa miễn dịch của Eclipta

alba. Do đó, Eclipta alba có thể phục vụ như một bộ điều biến bộ nhớ tiềm năng.
Thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính điều hòa miễn dịch của dịch chiết
metanol của toàn bộ cây Eclipta alba ở năm mức liều từ 100 đến 500 mg/kg làm tăng

Co

đáng kể chỉ số thực bào và hiệu giá kháng thể và tỷ lệ F của chỉ số thực bào và số
lượng bạch cầu cũng tăng [32].

10


f. Hoạt động chống ung thư

VN
U

Dịch chiết methanol của Eclipta alba được đánh giá là hoạt động chống ung
thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng. Hoạt động
chống ung thư được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số lượng tế bào
khối u, số lượng tế bào khối u còn sống, số lượng tế bào khối u không thể sống, thời

học so với chuột mang EAC [25].

dP
ha
rm

ac
y,

gian sống trung bình và tăng tuổi thọ trong các mô hình động vật thí nghiệm. Dịch
chiết làm tăng tuổi thọ của chuột được điều trị EAC và khôi phục các thông số huyết
Coumestans cũng được biết là hoạt động như phytoestrogen. Ở nhiều nước, nó
được sử dụng như chế độ ăn uống đóng vai trò là tác nhân phòng ngừa hóa học trong
ung thư vú và tuyến tiền liệt. Dasyscyphin-C (saponin) một hợp chất phân lập mới từ
Eclipta alba được báo cáo với hoạt tính chống ung thư - gây độc tế bào [40].

an

g. Ngăn rụng tóc, kích thích mọc tóc

ed
ici
ne

Eclipta alba được sử dụng trong các chế phẩm dưỡng tóc vì nó thúc đẩy mọc
tóc và duy trì độ đen của tóc. 10% w/v của Eclipta alba là thành phần chính trong
việc điều chế công thức thảo dược hỗ trợ cho sự phát triển của tóc.

M

Eclipta Alba là một loại thảo dược phổ biến để kích thích sự phát triển của tóc.
Dịch chiết ether và dịch chiết ethanol đã được phối hợp vào dạng kem (nước trong

ol

of

dầu) và bôi tại chỗ trên da bị bong tróc của chuột bạch tạng trong một thử nghiệm.

Thời gian cần thiết để bắt đầu phát triển tóc cũng như hoàn thành chu kỳ tăng trưởng
tóc được ghi lại. Dung dịch Minoxidil 2% được áp dụng tại chỗ và đóng vai trò chứng
dương để so sánh. Kết quả điều trị với dịch chiết ether 2% và 5% tốt hơn so với

ho

minoxidi 2% (chứng dương) [46].

Sc

h. Tác dụng hạ đường huyết

@

Về tác dụng hạ đường huyết, sử dụng Eclipta alba qua đường uống trong 2
tháng đã được chứng minh là làm giảm glucose máu, glycosylated hemoglobin

Co

py

rig

ht

HbA1c, giảm hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase,
và tăng hoạt động của hexokinase gan. Eclipta alba đã được chứng minh có hoạt động
trị tiểu đường và lợi tiểu bằng cách tác động lên tuyến tụy nhờ phục hồi và tái tạo
hoạt động tế bào β của tụy [8].

11


CHƯƠNG 2:

2.1

VN
U

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng

ac
y,

Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba được thu hái từ tỉnh Thanh
Hóa, trong tháng 06/2018. Dược liệu thu về được sấy khô ở nhiệt độ 50-600C đạt độ

dP
ha
rm

ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer để nơi khô ráo,
tránh ẩm.
2.2

Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất

an

- Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan,
ethyl acetat, dicloromethan, aceton.

ed
ici
ne

- Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng để phát hiện viết
chất trên bản mỏng.

- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và
bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).

M

- Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck).

of

- Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%.

ol

2.2.2 Thiết bị

ho

- Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi).

Sc

- Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml.
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.

@

- Máy siêu âm Power sonic 405.

ht

- Bếp điện, bếp cách thủy Memmert.

rig

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array.

Co

py

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo
hàm ẩm.
- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.

12

- Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dung

2.3

VN
U

tích 250ml, 500ml, 1000ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh, ống đong, ống nghiệm
các kích thước,…
Phương pháp nghiên cứu

ac
y,

2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập

- Cỏ nhọ nổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol, sau
đó lọc loại bã dược liệu và gộp dịch chiết. Tiếp theo cất thu hồi dung môi dưới áp

dP
ha
rm

suất giảm thu được cao đặc toàn phần.

- Cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với
dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat thu được các phân đoạn tương
ứng.

ed
ici
ne

an

- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica
gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong
dung môi. Tiến hành quá trình sắc ký cột:
+ Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau,
chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải.

M

+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Nhồi
một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc có mỏ,

ol

of

thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí. Đưa từ từ hỗn hợp chất nhồi
cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí. Sau đó, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua
cột đến khi cột ổn định.

ho

+ Nạp mẫu: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi

Sc

dung môi đến khi được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều trên
mặt cột. Sau đó, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột.

@

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải.

py

rig

ht

- Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành trên bản mỏng
tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn
tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
trong ethanol.

Co

- Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau. Kiểm tra độ sạch của các
chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp.

13


2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc

VN

U

Cấu trúc các hợp chất được xác định thông qua sự kết hợp của các phương
pháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý (điểm nóng chảy). Các phương pháp phổ

ac
y,

được dùng phổ biến trong xác định cấu trúc là phổ khối lượng (Mass spectrometry MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance - NMR).
- Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ
phân tử. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ

dP
ha
rm

ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ
tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng
các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa
biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có
thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3].

ed
ici
ne

an

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I)
lẻ (1H, 13C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp

M

xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân
bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức
xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng
(cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường).
Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái

of

cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân
tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó.

ho

ol

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ
khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các phổ

Sc

một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt
nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3].

@

Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân
lập từ cỏ nhọ nồi là:

ht

- Điểm nóng chảy.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC.

Co

py

rig

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS).

14


CHƯƠNG 3:

VN
U

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn

ac
y,

etyl acetat
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi

dP
ha
rm

Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 700C,
mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8. Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suất
giảm thu được cao tổng NTP (288,3 g).

an

Phân tán 280g NTP vào 2l nước sau đó lắc phân đoạn với hệ dung môi có độ
phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, 3 lần với mỗi dung môi. Gộp dịch chiết và cô
dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan (NH:

ed
ici
ne

20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g) được biểu
diễn như Hình 3.1.
Bột Cỏ nhọ nồi

M

(2kg)

Cao tổng (NTP)

(288,3g)

Sc

ho

ol

of

1. Chiết với MeOH, 700C, 3 lần
2. Lọc lấy dịch
3. Cô quay

Co

py

rig

ht

@

1. Phân tán cao trong nước
2. Lắc phân đoạn lần lượt với
n-hexan (x3), EtOAc (x3)

Cao n-hexan (NH)

Cao EtOAc (NE)

(20,6g)

(60,9g)

Cao nước (NW)
(197,3g)

Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi

15


3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi

VN
U

Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ
dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thu được 7
phân đoạn ký hiệu là: NE1-7.

ac
y,

Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH
(10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4. Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được tiến
hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu được

an

NE (60g)

dP
ha
rm

hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg). Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiến hành tiến
hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu
được hợp chất N03 (48 mg).

NE1

ed
ici
ne

CC: pha thường
DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1,
10/1, 8/1, 5/1)

…

M

NE4 (5,3g)

…

NE7

ho

ol

of

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH (10/1)

NE4.2 (1,1g)

ht

@

Sc

NE4.1 (1,9g)

Co

py

rig

N01
(426mg
)

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH
(8/1)

NE4.3

NE4.4

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH
(8/1)

N03
(48mg)
N02
(112mg)

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi

16


VN
U
N01

UV 366nm

NE

TT H2SO4 10%/Ethanol

dP
ha
rm

UV 254nm

ac
y,

NE

N01

NE

N01

DM: DCM/MeOH: 8/1

N02

NE

M

N02

ed
ici
ne

an

Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc

UV 254nm

NE

UV 366nm

N02

NE

TT H 2SO4 10%/Ethanol

of

DM: DCM/MeOH: 8/1

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc

N03

N03

NE

UV 254nm

NE

UV 366nm

N03

TT H 2SO4 10%/Ethanol

DM: DCM/MeOH: 8/1
Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc

17

NE


3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi

VN
U

3.2.1. Biện luận cấu trúc N01
Hợp chất N01: chất bột màu trắng.

ac
y,

ESI-MS: m/z 314 [M+]: C16H10O7. Phổ 13C-NMR, phổ 1H-NMR và DEPT
(Bảng 3.1). Các số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử
của hợp chất wedelolacton (Hình 3.3).

dP
ha
rm

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton của nhóm methoxy ở δH 3,88 (3H, s, H-15).
Hai tín hiệu proton ở vị trí para của vòng thơm ở δH 7,35 (1H, s, H-13), 7,16 (1H, s,
H-10); Hai tín hiệu ở δH 6,44 (1H, d, J=2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8)
là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta.
Phổ

13

C-NMR của N01 có 16 tín hiệu carbon, trong đó: tín hiệu cacbon

ed
ici
ne

an

cacbonyl của vòng lacton ở δC 164,0; 4 tín hiệu ở δC 99,5; 94,5; 99,6 và 106,0 là tín
hiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=), 10 tín hiệu ở 103,3; 161,4, 98,4, 156,3, 164,4,
157,0, 151,2, 146,7, 115,7 là tín hiệu của 10 carbon bậc 4 kề nối đôi. Tín hiệu ở 56,3
là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene. Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3
này tương tác với C7 (δ = 164,4).

M

Tương tác H→C được quan sát thấy trên phổ HMBC cho vị trí chính xác của
các proton và carbon trong phân tử của N01 (Bảng 3.1). Từ đây, dựa vào các kết quả

ho

ol

of

phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công
bố [42] cấu trúc của chất N01 được xác định là 5,11,12-Trihydroxy-7methoxycoumestan (Wedelolactone).

Co

py

rig

ht

@

Sc

H3CO

8

7

8a

O

O
2
3

6
5

OH

4a

13

OH

12

14

4
11

O
9

10

OH

1,8,9 - Trihydroxy-3-methoxycoumestan

Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton)

18