Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

an
d

Ph
a

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

rm
ac

y,

VN

KHOA Y DƯỢC

U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ol

of

Me

dic

ine

TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN
NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI
MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

HÀ NỘI - 2018


U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

an
d

Ph
a

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

rm
ac

y,

VN

KHOA Y DƯỢC

ol

of

Me

dic

ine

TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN
NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI
MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

Sc

ho

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

Khóa: QH 2012.Y

2. ThS. BS. Vũ Vân Nga

Co

py

rig

ht

@

Người hướng dẫn: 1. ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

HÀ NỘI - 2018


U

LỜI CẢM ƠN

rm
ac

y,

VN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Phạm
Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội,
ThS. Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội,
những người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến
nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc
nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này.

an
d

Ph
a

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y
Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng
giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.

Me

dic

ine

Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của
Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23. Trong quá trình học

tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy
cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y
dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân
thành cảm ơn.

ol

of

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy
cô giáo trong Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến
thức quý báu trong quá trình học tập tại trường.

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn

bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình
thực hiện khóa luận này.

Nguyễn Thị Thùy Linh


U

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Base pair (Cặp bazơ nitơ)

ADN

Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic)

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí

y,

rm
ac

lỏng cao áp biến tính)

Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine
tetraacetic)

Ph
a

EDTA

VN

bp

Hội chứng thận hư

HCTHTP

Hội chứng thận hư tiên phát

Kb

kilobase (= 1000 bp)

NCBI

National Center for Biotechnology Information (Trung tâm

ine

an
d

HCTH

dic

Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ)
Gen mã hóa cho protein podocin

NHLBI

National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi và

Me

NPHS2

máu quốc gia)

Optical density (Mật độ quang học)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài

ho

ol

of

OD

SNP

@

SSCP

Sc

đoạn cắt giới hạn)
Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình
cấu hình sợi đơn)
Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn)

TAE

Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA

UTR

Untranslated region (Vùng không dịch mã)

rig

ht

STR

py
Co

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit)


VN

U

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 .............................................. 20

Bảng 2

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2.............. 30

Bảng 3

Tổng hợp các SNP thuộc gen NPHS2 của 149 bệnh nhân ............. 32

Bảng 4

Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu .......... 33

Bảng 5

Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu ........... 33

Bảng 6

Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến ...34

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

Bảng 1


U

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

VN

Trang

Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước ................................ 4

Hình 1.2

Cơ chế bệnh học HCTH ............................................................... 5

Hình 1.3

Gen NPHS2 và protein podocin ................................................... 8

Hình 1.4

Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa
các protein cấu tạo nên tế bào ....................................................... 9

Hình 1.5

Các đột biến trên protein podocin được mã hóa bởi gen NPHS2.... 10

Hình 2.1

Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ....................................................... 23

Hình 3.1

Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,7% ................... 25

Hình 3.2

Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon
gen NPHS2 .......................................................................................... 27

Hình 3.3

Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi trên 6 exon

gen NPHS2 .................................................................................... 28

Hình 3.4

Kết quả điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác nhau trên
6 exon gen NPHS2 ........................................................................ 29

Hình 3.5

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 exon gen NPHS2 sau khi tối
ưu .................................................................................................. 29

Hình 3.6

Một số kết quả giải trình tự gen NPHS2 ...................................... 31

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

Hình 1.1

Co

py

rig

ht

@

Sc

Hình 3.7 Số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 ............... 31


VN

U

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

y,

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

rm
ac

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

Ph
a

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT ........ 3

an
d

1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học ..................................................... 3
1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học .......................................................................... 4
1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP ...... 5

ine

1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát ............ 6

dic

1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 ............................................... 8
1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2............................................... 8

Me

1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2 ............................................................. 9

of

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2
Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP ................................................... 11

ol

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN
ĐƠN NUCLEOTIT ....................................................................... 13

ho

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18

Sc

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................... 18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................ 18

@

2.1.2. Hóa chất............................................................................................. 18
2.1.3. Thiết bị .............................................................................................. 19

ht

2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................... 19

Co

py

rig

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 19
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm............................................... 20
2.2.2. Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số .............................. 20


U

2.2.3. Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR ................................. 21

VN

2.2.4. Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự .......... 23
2.2.5. Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2............................... 23

y,

2.3. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU .................................................... 24

rm
ac

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................... 26
3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ............................................. 26
3.2. NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR ........ 26

Ph
a

3.3. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG
GIẢI TRÌNH TỰ .......................................................................... 30

an
d

3.4. TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG
NGHIÊN CỨU .............................................................................. 33
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 34

ine

4.1. VỀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦU
CỦA GEN NPHS2 ........................................................................ 34

dic

4.2. VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN 6
EXON ...................................................................................... …36

Me

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
4.1. KẾT LUẬN............................................................................ 40

of

4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................... 40

ol

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

PHỤ LỤC ...........................................................................................................


U
VN

ĐẶT VẤN ĐỀ

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là bệnh cầu thận mạn tính
thường gặp nhất ở trẻ em và là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy giảm chức
năng thận [14, 65]. Cho đến nay, các phương pháp điều trị bệnh chủ yếu là
liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch và ghép thận. Theo tiêu
chuẩn lâm sàng, HCTH được phân loại dựa vào đáp ứng của bệnh nhân với
liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm và kháng corticosteroid [14,
38]. Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường rất cảm thụ với liệu pháp này,
tuy nhiên việc điều trị kéo dài bằng corticosteroid gây ra nhiều tác dụng phụ
như hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng
xương, chậm phát triển thể chất [12]. Bên cạnh đó, một tỉ lệ không nhỏ (10 –
20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cơ
cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58]. Nhiều trường hợp kháng
corticosetorid được chứng minh là do đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức
năng và sự biệt hóa của tế bào podocyte (tế bào biểu mô có chân trên màng
đáy cầu thận). Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo ra sự lo
lắng, chán nản và tiêu tốn nhiều tiền của cho bệnh nhân và gia đình người
bệnh [6].

Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu về HCTHTP đã được thực
hiện để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền
của bệnh. Những nghiên cứu áp dụng tiến bộ của di truyền học phân tử trong
vài năm qua đã chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng
corticosteroid, trong đó các đột biến của gen NPHS2 mã hóa cho protein
podocin đóng vai trò quan trọng [49, 60].
Các nhà khoa học đã xác định được tổng cộng 89 đột biến điểm trên 8
exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6
được chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41]. Vì vậy, việc xác
định các đột biến của gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa di truyền
với đáp ứng thuốc có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng quyết định phác đồ điều
trị thích hợp cho từng bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng do thuốc và giảm

1


rm
ac

y,

VN

U

chi phí điều trị [43]. Đây chính là xu hướng tối ưu hóa điều trị theo từng cá
thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học trong phác đồ điều trị bệnh nhân.
Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về các đa hình thái của gen
NPHS2 cũng như quy trình phân tích gen này. Từ nhu cầu lâm sàng và tính
cấp thiết của nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới trong chẩn đoán,

điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích gen
NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát”.

Ph
a

1. Mục tiêu nghiên cứu:

an
d

- Xây dựng quy trình phân tích các đa hình di truyền nằm trong exon 1
đến exon 6 thuộc gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam.
- Xác định tần số các đa hình gen NPHS2 trên 149
bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam.

ine

2. Nội dung nghiên cứu:

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon 1 đến exon 6 thuộc gen
NPHS2.
- Giải trình tự và xác định các đa hình gen NPHS2.
- Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số
alen trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam.

2


VN

U

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT

1.1.

y,

1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

Hội chứng thận hư là biểu hiện thường gặp của bệnh cầu thận nguyên
phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát, xen lẫn những thời kỳ
thuyên giảm. Đây là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện ở nhiều
bệnh do tổn thương ở cầu thận đặc trưng bởi phù, protein niệu cao, protein
máu giảm, rối loạn lipid máu và có thể đái ra mỡ [6].
Hội chứng thận hư tiên phát là HCTH không có nguyên nhân rõ ràng,
khởi phát sớm nhất trên 3 tháng tuổi, với 3 hình thái bệnh lí tổn thương cầu
thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ hoặc một phần và
tăng sinh gian mạch lan toả. Bệnh hay gặp ở tuổi tiền học đường hoặc học
đường (5 – 10 tuổi) [8].
Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome
- SRNS) được định nghĩa là một tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư
không đạt được sự thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp
corticosteroid tiêu chuẩn. Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm
khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư ở trẻ em và có xu hướng tiến triển đến
giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm [44]. Khi đó bệnh nhân cần
được điều trị bằng lọc máu và ghép thận với chi phí cao.
Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư và cơ
địa. Tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em Việt Nam là 8,7 ± 3,5 (tuổi đi học)
trong khi đó một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp hơn
thường gặp ở trẻ em trước tuổi đi học. Trẻ nam gặp nhiều hơn trẻ nữ (tỷ lệ
2:1). Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều hơn Châu Âu (với tỷ lệ 6:1);
trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng nếu trẻ em da đen mắc HCTHTP thì

thường bị kháng corticosteroid [52].
Ở Mỹ, tỉ lệ mắc mới hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ hiện
mắc là 16/100.000 người. Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mới mắc của trẻ em gốc Á
(Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp 6 lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể hiện
tỉ lệ mắc HCTH ở một số nước trên thế giới). Ở nước ta, tại các khoa Nhi

3


dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm
khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú và chiếm 10 – 30% tổng số

bệnh nhi bị các bệnh thận. Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị
thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân và chiếm 40% tổng số bệnh nhân
của khoa thận [1, 10].

Me

Hình 1.1. Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước trên thế giới [27]

of

1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

Cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP đến nay vẫn chưa được biết đầy
đủ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự rối loạn chức năng của tế bào

lympho T dẫn đến sự rối loạn đáp ứng miễn dịch. Các protein đặc biệt là các
Albumin xuất hiện trong nước tiểu là do biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng
lỗ lọc và mất điện tích âm màng đáy. Một số bệnh nhân mang điện tích dương
trong huyết tương và các phân tử protein này có thể trung hòa điện tích âm
trên thành mao mạch cầu thận. Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy có
vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTHTP. Gần đây
người ta thấy rằng sự thay đổi của các phân tử creatin bộc lộ trên chân lồi của
các tế bào biểu mô có chân, đặc biệt là nephrin, podocin và α-actin cũng có
vai trò gây xuất hiện protein niệu [4]. Hình 1.2 mô tả cơ chế gây mất albumin
từ máu ra nước tiểu trong HCTH.

4


U
VN
y,
rm
ac
Ph
a

an
d

Hình 1.2. Cơ chế bệnh học HCTH [53]
Hầu hết các bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên
nhân. Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em
hoặc HCTH bẩm sinh được chứng minh trong các nghiên cứu có nguyên nhân
do gen làm ảnh hưởng tới sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte [33].

ine

1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP

Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm.
Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù.
Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy.
Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em.
Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali.

Co

py

rig

ht

-

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng
corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP.
Khi chưa có corticosteroid, một tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết hoặc tiến
triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng. Từ năm 1950, corticosteroid
đã được sử dụng trong điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH
xuống còn khoảng 3%. Corticosteroid có tác dụng giảm viêm ở cầu thận trong
điều trị HCTHTP, từ đó các triệu chứng bệnh sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn.
Với những trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp
corticosteroid [45]. Tuy nhiên, bệnh có khả năng tái phát cao, vì vậy cần theo
dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ một cách chính xác. Mặt khác, điều trị bằng
corticosteroid trong thời gian dài cũng gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng
như [12, 45]:

5


rm
ac

y,

VN

U

- Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu
cơ, nhược cơ.
- Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao.
- Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo.
- Nhiễm khuẩn.
- Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp.

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiên cho
thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc là 10 – 20% và có xu hướng ngày
càng tăng [11, 31]. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và cộng sự trên
42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid được điều trị bằng methylprenisolon
liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm

một phần là 30,9% và không đáp ứng là 35,7% [8]. Những nghiên cứu mới về
phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp các protein tham gia cấu trúc màng
lọc cầu thận đã phần nào chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc
do gen. Bằng chứng là sự di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với
corticosteroid ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư đang ngày càng được
công nhận [30]. Vấn đề cơ chế nào dẫn đến việc những bệnh nhân này ban
đầu đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó lại kháng với corticosteroid (hiện
tượng kháng corticosteroid muộn) cũng được đặt ra. Vì vậy, xét nghiệm gen
di truyền đang ngày càng trở thành một công cụ có giá trị trong việc xác định
các đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư và sự di truyền tính
kháng steroid, từ đó có được hướng điều trị hiệu quả và trong tương lai có thể
tránh những trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13].

Co

py

rig

ht

@

Sc

1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát
Hơn hai thập kỉ qua, cơ sở phân tử của HCTH kháng corticosteroid đã
được nghiên cứu trên cả trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính
chất gia đình và những trường hợp ngẫu nhiên. Các đột biến trên gen mã hóa
cho các protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) được mô tả như là

nguyên nhân của HCTH kháng corticosteroid di truyền. Đến nay, các đột biến
ở 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E,
PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng
corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên
6


Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1,
SMARCA, MYH9 và NXF5) [23]. Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện
trên thế giới chỉ ra các gen sau đây là nguyên nhân phổ biến nhất trong HCTH
kháng corticosteroid:
- Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp
ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36].
- Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin của tế bào podocyte,
thường gặp ở lứa tuổi lớn và HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình. Đột
biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc ở Châu
Âu và Trung Đông, ngược lại tỉ lệ này lại ít ở trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69].
- WT1 mã hóa cho sự di truyền ức chế protein của khối u liên quan đến
phát triển thận và hệ sinh dục. Đột biến gen WT1-Wilm’tumor có thể gặp ở
tất cả các trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59].
- Gen ít gặp hơn là LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa
phospholipase C epsilon và TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên
màng lipid tạo thành một phức hệ với podocin quy định cơ chế cảm nhận của
màng lọc cầu thận [36].
- Đột biến gen NPHS3 và đột biến ở gen epsilon phospholipase C
(PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh và xơ hóa gian
mạch lan tỏa [35].
- Các gen khác gồm ACTN4 mã hóa alpha-actinine 4, TRPC6 mã hóa cho
kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid và INF2 mã hóa protein điều hòa
actin, các gen này gây HCTH di truyền trội với xơ hóa cầu thận cục bộ
thường xuất hiện ở trẻ vị thành niên và người trẻ tuổi [68].

Co

py

rig

ht

@

Trên cơ sở các nghiên cứu này, các đột biến của gen NPHS2 được mô
tả là một trong các nguyên nhân quan trọng trong cơ chế kháng thuốc ở bệnh
nhân mắc HCTHTP và được tìm thấy ở các quần thể khác nhau với tần số và
mức độ biểu hiện khác nhau [20, 25]. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi lựa
chọn phân tích gen NPHS2 là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về
mối liên quan giữa các đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm
sàng, đáp ứng điều trị và tiên lượng ở bệnh nhân người Việt Nam mắc
HCTHTP.

7


VN

U

1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2
1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài
khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon
[21] (Hình 1.3).

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

Hình 1.3. Gen NPHS2 và protein podocin. A. Vị trí của gen NPHS2 trên
nhiễm sắc thể số 1. B. Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2 mã
hóa protein Podocin. Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các
intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon. UTR là vùng không
dịch mã. C. Cấu trúc protein podocin. (Nguồn: Genetics in Medicine)
NPHS2 mã hóa cho protein podocin, hầu như chỉ biểu hiện ở tế bào
podocyte trên cầu thận. Podocyte là tế bào biểu mô biệt hóa bao quanh mặt
ngoài của màng lọc cầu thận (Hình 1.4). Những tế bào này phân ngón thành
những chân bám vào mặt ngoài màng đáy, khe giữa các chân giả tạo ra những
lỗ lọc đường kính khoảng n Å cho dịch lọc đi qua. Podocin là một protein
màng, cấu tạo từ 383 axit amin và trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin có
cấu trúc giống như kẹp tóc, cả hai đầu của phân tử protein podocin đều nằm
trong tế bào chất. Podocin tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập
trung nhiều ở các khe của màng lọc cầu thận, nơi nó tương tác với các protein
khác như CD2AP hay nephrin [20].

8


U
VN

y,
rm
ac
Ph
a
an
d
ine
dic

of

Me

Hình 1.4. Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác
giữa các protein cấu tạo nên tế bào (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney
diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang)

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2
Kruglyak và Nickerson (2001) ước tính rằng hai hệ gen người bình
thường trung bình giống nhau về trình tự các nucleotit tới 99,9%. Trong phần
khác biệt di truyền còn lại thì đến 90% là các đa hình đơn nucleotit (single
nucleotit polymorphism, viết tắt là SNP) [46]. SNP là đột biến thay thế một
nucleotit trong trình tự ADN với tần số lớn hơn 1% trong quần thể. Nhiều
nghiên cứu đến nay cho thấy hầu hết các SNP phổ biến chỉ có hai alen và
khoảng 2/3 các SNP trong hệ gen người có nguồn gốc là các đột biến đồng
hoán. SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền phổ biến và
ổn định, hơn 99,9% trình tự hệ gen là giống nhau và sự biến đổi của phần còn
lại được coi là có ảnh hưởng rất lớn đến việc bằng cách nào đó mà con người
có sự phản ứng khác nhau với bệnh tật, với các nhân tố môi trường như vi
khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất, các thuốc và các liệu pháp điều trị khác
9


Me

dic

ine

an
d

Ph

a

rm
ac

y,

VN

U

nhau. Các SNP nằm trong vùng mã hóa của gen làm thay đổi cấu trúc và chức
năng của protein được dịch mã là một trong những mục tiêu thường được
phân tích nhằm chẩn đoán bệnh và lý giải cho việc tại sao mỗi người lại đáp
ứng khác nhau với một loại thuốc trong cùng một điều kiện môi trường. Các
điểm đa hình nucleotit này cho thấy tiềm năng không giới hạn trong việc
nghiên cứu tác động của chúng đến con đường sinh bệnh học [61, 64]. Mặc
dù tác động của từng SNP riêng rẽ đến sự hình thành bệnh là tương đối yếu
nhưng sự tổ hợp của chúng có thể làm tăng đáng kể nguy cơ gây bệnh. Cùng
với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng thuốc, khả năng hấp thụ, chuyển
hóa thuốc cũng như các phân tử khác [66]. Vì vậy, việc nghiên cứu mối liên
hệ giữa các SNP này với sự hình thành bệnh là rất cần thiết nhằm tìm ra các
chỉ thị di truyền đặc trưng cho từng quần thể.
Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên các kĩ thuật
sinh học phân tử có thể phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen của hàng
trăm hay hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hay hàng ngàn SNP [47]. Các nhà
di truyền học hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP
có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở
mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích
hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 đã được xác định, trong đó chủ yếu là
các SNP (Hình 1.5).

Hình 1.5. Các đột biến trên podocin
(Nguồn: Weber et al: Podocin gene mutation screening)
10


ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

Các nhà khoa học đã xác định được 89 đột biến điểm trên 8 exon của
gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng
minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP; còn 33 đột biến tập trung ở exon 7
và 8 chưa tìm được mối liên quan chặt chẽ nào với HCTHTP [41, 42]. Bên
cạnh các nghiên cứu trên các exon, cũng có một số ít nghiên cứu về các đột
biến trên intron của NPHS2, tuy nhiên chưa có mối liên hệ rõ ràng nào giữa

các đột biến trên intron của gen này với HCTHTP kháng thuốc [34, 41].
Sáu mươi bảy biến thể đa hình của NPHS2 đã được công bố gồm 22
SNP thuộc vùng mã hóa, trong đó có 8 SNP làm thay đổi axit amin và 14
SNP không làm thay đổi axit amin. 45 đột biến còn lại nằm ở vùng không mã
hóa gồm 13 thay đổi ở intron, 26 thay đổi ở vùng promoter và 6 thay đổi ở
vùng 3 UTR. Đột biến p.R229Q (c.686G>A) thay thế nucleotit G thành A ở
vị trí 686 trong exon 5 dẫn đến sự thay đổi axit amin arginine thành glutamine
[21]. Vì vậy, các đặc điểm sinh học của chuỗi peptit được mã hóa đã thay đổi.
Nghiên cứu invitro cho thấy podocin đã giảm đáng kể liên kết với nephrin
[63]. Tỷ lệ xuất hiện alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,030,13 ở châu Âu [25, 42, 63], và 0,005-0,025 ở các cá nhân từ gốc Phi Châu
[29, 55, 63]. Các biến thể p.A61V (c.182C> T) và p.A242V (c.725C> T) là
những SNP làm thay đổi protein mã hóa chủ yếu ở các cá nhân người Mỹ gốc
Phi, với tần suất tương đối lần lượt là 0,015 và 0,076 (NHLBI Exome
Sequencing Project). Năm 2011, Ren Q và Yu Sy trong nghiên cứu ở 35 bệnh
nhân nhi và 30 người đối chứng khỏe mạnh đã phát hiện 3 SNP: 288C>T thể
dị hợp ở exon 2, 945T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 [56].

Sc

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở
BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP

Co

py

rig

ht

@

Trên thế giới, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân tích đa hình di
truyền gen NPHS2 trên những nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác
nhau. Năm 2000, Boute và cộng sự lần đầu phân tích đột biến gen NPHS2 đã
phát hiện ra đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường ở các bệnh nhân người
Mỹ với HCTH kháng thuốc [21]. Các nghiên cứu trước đây về tần số đột biến
gen NPHS2 trong các quần thể khác nhau cho thấy chủng tộc đóng một vai trò
quan trọng. Các đa hình di truyền gen NPHS2 đã được công bố có ảnh hưởng
11


Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

khác nhau đến các đặc điểm lâm sàng như protein niệu xuất hiện sớm, tiến
triển nhanh đến bệnh thận giai đoạn cuối và sự khác biệt về thể mô bệnh học
[19, 44, 65]. Tuy nhiên, không có sự đồng thuận về exon nào ảnh hưởng đến
HCTH hơn hay đột biến trên exon nào có hại nhất [32]. Năm 2007, Berdeli
nghiên cứu đột biến gen NPHS2 trên 295 trẻ em ở Thổ Nhĩ Kì mắc HCTHTP
kháng thuốc thấy: 41 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 13,8%) có tiền sử gia đình và 254
bệnh nhân (chiếm 86,2%) là trường hợp ngẫu nhiên. Phân tích trên 8 exon của
gen NPHS2 bằng phương pháp giải trình tự thấy có 53 đột biến, trong đó 37
đột biến mới. Tỷ lệ phát hiện đột biến là 24,7% trên tất cả các bệnh nhân,
29,2% ở nhóm có tiền sử gia đình và 24% ở nhóm ngẫu nhiên [18]. Trong
nghiên cứu của Basiratnia và cộng sự năm 2013 trên 99 trẻ em mắc hội chứng
thận hư ở Tây Nam Iran, sau khi phân tích kết quả trên hai nhóm là nhóm
kháng corticosteroid (49 bệnh nhân) và nhóm nhạy cảm với corticosteroid (50
bệnh nhân), đã đề xuất phác đồ điều trị mới cho nhóm trẻ em mắc HCTH
kháng thuốc dựa trên xác định các đột biến gen NPHS2 [51]. Joshi và cộng sự
năm 2013 đã chỉ ra trong nghiên cứu của mình sự biểu hiện đa dạng về đột
biến gen NPHS2 ở các chủng người và các quốc gia khác nhau. Từ đó đề xuất
sự tiếp cận có hệ thống để kiểm tra di truyền cho từng bệnh nhân mắc HCTH
kháng thuốc nhằm hỗ trợ các bác sĩ trong việc lựa chọn điều trị thích hợp [40].

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Mặc dù vậy, cũng có một số nghiên cứu phân tích các exon khác nhau
của gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTH lại không tìm thấy đột
biến gen nào. Nghiên cứu của Dedi Rachmadi và cộng sự năm 2015 trên đối
tượng bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng steroid ở Indonesia đã
phân tích các đa hình di truyền trên các exon 1, 2 và 8 bằng phương pháp giải
trình tự gen và mối liên quan với các biểu hiện lâm sàng. Kết quả cho thấy
không có mối tương quan giữa 6 đa hình di truyền gen NPHS2 đã xác định
được với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (p>0,05) và không tìm thấy
đột biến mới. Tuy nhiên, tác giả cũng đưa ra kết luận trong nghiên cứu này
chỉ có 28 trên 59 mẫu giải trình tự thành công do hạn chế về thời gian và tài
chính [28]. Vì vậy có thể các exon khác của gen mã hóa cho protein podocin
đóng vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư kháng

12


Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

corticosteroid chưa được chứng minh trong nghiên cứu này và cần thực hiện
các nghiên cứu tiếp theo.
Tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân mắc
HCTHTP được tiến hành trước đây tập trung chủ yếu về đặc điểm lâm sàng,
cận lâm sàng và đánh giá đáp ứng điều trị. Đến nay chưa có nghiên cứu nào
về đa hình di truyền gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân này được công bố.
Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành với mục đích tìm ra phương
pháp phân tích gen NPHS2, phục vụ cho chẩn đoán và điều trị HCTH cho
từng cá thể. Đây là xu hướng điều trị hứa hẹn mang lại kết quả tối ưu hơn
trong tương lai.

an
d

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN
NUCLEOTIT

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

Gần 300 gen đã được phân tích chi tiết về SNP theo các phương pháp
và trên nhiều nhóm người khác nhau. Năm 1980, SNP được phát hiện do sử
dụng enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của vị trí cắt và số điểm cắt bằng
cách quan sát sự thay đổi độ dài của các đoạn cắt trên ADN. Đến năm 1990,
SNPs đã phần lớn thay thế STR (short tandem repeat) trong việc sử dụng như
một dấu chuẩn lựa chọn cho các nghiên cứu liên kết. STR là các đoạn ADN
có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6 bp, có tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế
hệ và mang tính đặc trưng cá thể [24]. Phân tích STR lý tưởng với các nghiên
cứu liên kết mà quá trình phân tích phả hệ được sử dụng để xác định một gen
chịu trách nhiệm cho một rối loạn đơn gen [2]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về

sau đã có sự chuyển đổi từ các rối loạn đơn gen sang phân tích các bệnh đa
yếu tố như loãng xương, tiểu đường, tim mạch, rối loạn tâm thần và phần lớn
ung thư, là các bệnh xảy ra với tần số cao hơn các bệnh đơn gen. Bên cạnh đó,
quan điểm điều trị mới quan tâm nhiều hơn ảnh hưởng của di truyền trong đáp
ứng thuốc. Các bệnh đa yếu tố di truyền này bao gồm nhiều biến đổi ở gen mà
mỗi biến đổi đóng góp một phần tác động nhỏ. Các nghiên cứu với kích thước
mẫu lớn so sánh được các trường hợp bệnh với các đối chứng tương ứng từ
cùng một quần thể và khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trong gen cao hơn.
SNP được lựa chọn như dấu chuẩn do nó phong phú hơn và được cho là ổn
định hơn STR. Nhiều SNP là các trình tự chức năng nếu chúng xảy ra trong
13


VN

U

vùng mang trình tự mã hóa hoặc trình tự quy định trong gen, do đó có thể
kiểm tra trực tiếp sự liên kết giữa kiểu hình và sự thay đổi chức năng gen [2, 24].

Me

dic

ine

an
d

Ph

a

rm
ac

y,

Nghiên cứu về mối liên quan giữa SNP với bệnh lý có thể thực hiện
bằng 2 cách: trực tiếp phân tích một SNP trong một trình tự mang chức năng
kết hợp với một đặc trưng của bệnh hoặc sử dụng một SNP như một dấu
chuẩn cho mất cân bằng liên kết (linkage disequilibrium -LD). Dựa trên cơ sở
lý thuyết, phương pháp sử dụng máy tính để mô phỏng đã dự đoán rằng LD
không có khả năng mở rộng ra hơn 3 kb trong quần thể người, tức là chỉ
khoảng 500000 SNP được sử dụng cho một lần phân tích. Tuy nhiên, những
hiểu biết về mức độ và mô hình biến động của tần số tái tổ hợp của genome
đã được công nhận cho phép chúng ta phân loại dấu chuẩn cho một lần phân
tích genome, rút ngắn hơn thời gian và kích thước mẫu cần thiết. Một hệ quả
của việc sử dụng quá nhiều dấu chuẩn đồng thời (nhiều cuộc kiểm tra độc lập)
là lượng mẫu yêu cầu để phát hiện các ảnh hưởng di truyền nhỏ có ý nghĩa
thống kê là khá lớn. Do đó, nghiên cứu yêu cầu lượng lớn các bệnh nhân và
các nhóm đối chứng. Hiện nay, quy mô thí nghiệm lớn như vậy là không khả
thi về mặt kinh tế, vì vậy cách tiếp cận phân tích gen ứng cử viên – gen được
lựa chọn trên cơ sở chức năng sinh học và nghiên cứu, kết hợp với các kiểu
hình của bệnh đang được áp dụng phổ biến [2].

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Việc xác định và mô tả lượng lớn SNP rất cần thiết trước khi chúng ta
có thể sử dụng chúng rộng rãi như một công cụ di truyền. Khoảng vài trăm
ngàn SNP sẽ được yêu cầu như một nguồn tài nguyên để xây dựng các bộ dấu
chuẩn tối ưu cho các nghiên cứu. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp xác
định các đa hình di truyền trên ADN như kĩ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới
hạn (Restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), kĩ thuật sử
dụng đầu dò ADN (ADN- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (single
strand conformational polymorphism, viết tắt là SSCP), giải trình tự, sắc kí
lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography,
viết tắt là DHPLC), chip ADN (SNP microarray) [64].

14


VN

U

Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism, viết tắt là RFLP)

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, biểu
hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt ADN bằng
ezyme cắt giới hạn. Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính
chất của enzym giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt
đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn
này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện

di trên gel agarose/polyacrylamide và được chuyển qua màng bằng phương
pháp lai Southern blot. Trên màng có những đầu dò ADN để xác định những
đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với. Đầu dò RFLP xảy ra khi chiều
dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác nhau. Mỗi đoạn giới
hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di truyền [22]. Phân
tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần
phân tích, bỏ qua bước lai với mẫu dò ADN đánh dấu phóng xạ như trong
phương pháp RFLP thông thường nên giá thành rẻ hơn và ít ảnh hưởng đến
sức khỏe hơn cho người nghiên cứu. Chính vì thế, kĩ thuật này thường được
gọi là PCR-RFLP. Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần
nghiên cứu, người ta có thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách
khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp
khác.

Sc

ho

Phương pháp phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand
conformation polymorphism, viết tắt là SSCP)

Co

py

rig

ht

@

Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột
biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN.
Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi
trình tự và môi trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi
trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit
và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện
di trên gel polyacrylamide không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau và phân tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng
đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng
15


VN

U

khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và
dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau.

y,

Phương pháp phân tích ADN dị sợi kép (Denaturing high
performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC)

an
d

Ph
a

rm
ac

Đây là phương pháp thay vì sử dụng gel và phân tách ADN bằng điện
di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN được phân tách
ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình
thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị
sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường.
DHPLC là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với
những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong
biến tính, phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.

dic

ine

Công nghệ VDA cũng có nhiều ưu điểm và tỷ lệ phát hiện cao, cho
phép phát hiện các SNP bằng quá trình lai sản phẩm PCR với mảng array sử
dụng đầu dò oligonucleotit trên một chip thuỷ tinh và đo sự khác biệt trong
liên kết lai giữa oligonucleotit phù hợp và không phù hợp.

Me

Phương pháp giải trình tự

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu
đột biến điểm/SNP. Để khẳng định chính xác đột biến hay biến đổi người ta
phải giải trình tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình
tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm
1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp
dideoxy) [3]. Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt
đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotit
ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi
oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase.
Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotit A, T, G, C trong đó
có một loại là di-deoxynucleotit để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn
ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide,
hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [5].

16

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

y,

VN

U

Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở
các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như
trên. Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa
học, phương pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh
với các kỹ thuật đã miêu tả trên. Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải
trình tự tự động và sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác
các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao [7]. Ưu điểm của
giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến,
vị trí, hậu quả. Phương pháp này có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại
ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên,
giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả
các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa

xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm. Bên cạnh đó, giải trình
tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ
của đối tượng tham gia nghiên cứu.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

Ngoài việc chọn lựa phương pháp cho phát hiện SNP, quần thể sử dụng
để phát hiện SNP cũng cần được chọn lựa. Tần số alen SNP khác nhau đáng
kể giữa các dân tộc và các quần thể khác nhau. Các công ty phân tích SNP đã
lựa chọn sử dụng các nhóm người đa sắc tộc để tối đa hóa cơ hội phát hiện

SNP. Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các nhóm người mang bệnh để tìm
ra các SNP, theo logic là các biến thể góp phần vào giai đoạn bệnh sẽ xuất
hiện ở tần số cao ở nhóm người này.

17