Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây ba kích tại quảng nam đà nẵng bằng chỉ thị phân tử RAPD

a

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI
QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018


b

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI
QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018

i

LỜI CAM ĐOAN
Đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây Ba kích tại Quảng NamĐà Nẵng bằng chỉ thị phân tử” là do nhóm chúng tôi thực hiện. Mọi số liệu, hình
ảnh, kết quả là hoàn toàn lấy từ các thí nghiệm sau khi thực hiện. Các tài liệu có
trong bài được tìm trong các sách, bài báo, tạp chí… trong nước và thế giới đáng
tin cậy và chính xác.
Tác giả

Lê Hoàng Khẩn


ii

LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Sinh học-Môi trường,
Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng đã tận tình giúp đỡ chúng em trong
suốt 4 năm học qua.
Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Minh Lý
và Th.S Vũ Đức Hoàng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này.
Cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Hội động vật FrankFurt đã hỗ trợ một
phần kinh phí để em thực hiện đề tài và tập thể lớp Công Nghệ Sinh học khoá
2014-2018 đã luôn bên cạnh quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. I
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... II
MỤC LỤC ........................................................................................................... III
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. V
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ............................................................... VII
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH ............................................................... 3
1.1.1. Phân loại khoa học .......................................................................... 3
1.1.2. Giá trị dược liệu .............................................................................. 3
1.1.3. Phân bố............................................................................................ 4
1.1.4. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây
Ba kích trong và ngoài nước ................................................................................. 4
1.2. CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN ............................................................. 6
1.2.1. Chỉ thị RAPD .................................................................................. 6
1.2.2. Kỹ thuật RAPD-SCAR ................................................................... 8
1.2.3. Kỹ thuật ISSR ................................................................................. 9
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 11
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .............................................. 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 11
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 12


iv
2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thái ..................................................... 12
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA ......................................................... 13
2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................. 14

2.2.4. Phương pháp phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD ................. 15
2.2.5. Phân tích sản phẩm phản ứng PCR-RAPD..................................... 15
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 17
3.1. ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI ............................................................................. 17
3.2. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ ................................................................... 19
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PCRRAPD .................................................................................................................. 20
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CÁC MẪU BA
KÍCH ................................................................................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 29


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µg

microgram

µL

microliter

AFLP

amplified fragment length polymorphism

AP-PCR

arbitrary primed polymerase chain reaction

bp

base pair

CAPS

cleaved amplified polymorphics sequences

cs

cộng sự

CTAB

cetyltrimethyl-ammonium bromide

DAF

DNA amplification fingerprinting

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleoside triphophate

EDTA

ethylene diamine tetraacetic acid

ISSR

inter-simple sequence repeats

Kb

kilobase

mg

milligram

mL

millilite

mM

millimol

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

polymerase chain reaction

RAPD

randomly amplified polymorphic DNA


vi
SRAP

sequence related amplified polymorphism

SSR

simple sequence repeats

PIC

Polymorphic Information Content

TAE

Tris-Acetic acid-EDTA


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục các bảng:
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu mẫu............................................................... 12

Bảng 2.2. Thành phần đệm chiết qua các lần cải tiến ......................................... 13
Bảng 2.3. Danh mục mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong nghiên cứu ......... 15
Bảng 3.1. Nồng độ dung dịch dna tổng số tách chiết từ các mẫu nghiên cứu
............................................................................................................................. 20
Bảng 3.2. Tổng hợp số loại phân đoạn, băng DNA được nhân bản và số phân
đoạn, băng DNA đa hình ..................................................................................... 22
Bảng 3.3. sản phẩm đa hình RAPD của mồi OPF-11 nhận được sau khi chạy PCR
với DNA tổng số của các mẫu ba kích................................................................ 24
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng di truyền (Nei) giữa các mẫu ba kích .............. 25
Danh mục các hình:
Hình 2.1. Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR. ...................................................... 14
Hình 3.1. Kết quả đánh giá hình thái giữa các mẫu: lá non có màu tím sẫm (I); lá
non có màu xanh (II); lá có hình dạng hơi tròn (III) và lá già có nhiều lông ở mặt
dưới (IV).............................................................................................................. 18
Hình 3.2. Hình thái các loại kiểu hình của cây ba kích sử dụng trong nghiên cứu:
lá non có màu tím sẫm (I); lá non có màu xanh (II); lá có hình dạng hơi tròn (III)
và lá già có nhiều lông ở mặt dưới (IV). ............................................................. 18
Hình 3.3. DNA tổng số tách chiết từ 11 mẫu ba kích. Đường chạy ký hiệu M là
DNA ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 11 là dna tổng số của
mẫu từ bk1 đến bk11. .......................................................................................... 19


viii
Hình 3.4. Sản phẩm rapd sử dụng mồi OPF-11. Đường chạy ký hiệu M là dna
ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 11 là sản phẩm PCR của mẫu
từ BK1 ĐẾN BK11 ............................................................................................. 23
Hình 3.5. Sản phẩm RAPD sử dụng mồi OPB-04. Đường chạy ký hiệu M là DNA
ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 8 là sản phẩm PCR của mẫu
từ BK1 đến BK8 .................................................................................................. 23
Hình 3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phần mềm

NTSYSPC 2.0 với hệ số là NEI72, phương pháp Clustering SAHN. ................ 26


1

MỞ ĐẦU
Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) thuộc họ cà phê (Rubiaseae) là loại
thảo dược quý. Ba kích thường mọc trong tự nhiên, mọc dại ở những vùng đồi,
núi đồi trung du miền núi phía bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc
Giang, Hà Giang, Quảng Nam....
Củ của cây Ba kích được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác
dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo
dai và khử phong thấp [22]. Dịch chiết từ củ Ba kích có tác dụng giảm huyết áp,
tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não giúp ăn và ngủ ngon [21]. Ở Việt
Nam, nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và cs. (2012) khi thử nghiệm trên chuột, đã
chứng minh dịch chiết của rễ cây Ba kích có ảnh hưởng đến tính sinh dục đực
[12].
Thực trạng hiện này cho thấy nhu cầu sử dụng rễ Ba kích ngày càng tăng
dẫn đến hiện tượng khai thác quá mức làm cho số lượng cây trong tự nhiên giảm
nhanh. Chính vì vậy Ba kích rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng trong tự nhiên
và đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ [1].
Ở Việt Nam, tỉnh Quảng Nam đã từng xảy ra tình trạng khai thác cạn kiệt
nên tỉnh đã bắt đầu đưa loại cây này vào sản xuất từ năm 2006, nhưng nguồn
giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ họ hàng
các giống giữa các vùng.
Mỗi vùng đều có những điều kiện sinh thái nhất định ảnh hưởng đến quá
trình sống cũng như bảo tồn nguồn gen của chúng, qua quá trình chọn lọc tự nhiên
có những giống mang được các đặc tính di truyền quý của địa phương, có những
giống lại không đáp ứng được điều đó. Ban đầu huyện Tây Giang (Quảng Nam)
là nơi phát hiện và trồng cây Ba kích, sau đó nhân rộng và được trồng ở nhiều khu

vực khác: Trà My, Nam Giang, Phước Sơn, … Từ giống Ba kích dại ban đầu, nay
nhân rộng và được trồng tại các địa điểm khác nhau tại tỉnh Quảng Nam, Đà Nẵng.


2
Mặt khác, giống Ba kích cũng đang nhập từ các tỉnh phía Bắc vào, đồng thời việc
trồng cây Ba kích từ nuôi cây mô cũng đã và đang thực hiện tại Phước Sơn (Quảng
Nam). Điều đó dẫn đến nguồn gen cây Ba kích tại Quảng Nam khá phức tạp và
không đồng nhất, nguồn giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác
định được quan hệ họ hàng các giống giữa các vùng.
Ngoài những giống được người dân nhân giống từ tự nhiên bằng phương
pháp giâm hom, còn có các giống được nhập từ các địa phương khác. Vấn đề này
rất khó kiểm soát, gây ảnh hưởng đến sự đồng nhất về chất lượng các sản phẩm
từ cây Ba kích ở địa phương. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Ba
kích có ý nghĩa trong việc bảo tồn tính đa dạng sinh học và sử dụng có hiệu quả
các nguồn gen quý đó phục vụ cho công tác chọn tạo giống tại địa phương.
Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị DNA ngày càng được sử dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng
cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn và
chọn giống [11]. So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa
sinh), thì chỉ thị DNA mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực hiện trong điều kiện
phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và hiện tượng
tương tác gen, có thể xác định được các biến dị DNA trong các giai đoạn sinh
trưởng, phát triển và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật.
Tại khu vực miền Trung – Tây nguyên cho đến nay cũng chưa có nghiên
cứu về việc xác định tính đa dạng di tuyền của cây Ba kích bằng chỉ thị phân tử.
Gần đây, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, như: RAPD, AFLP,
RFLP, SSR, SNP... cho phép đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần
thể và các xuất xứ sinh vật một cách nhanh chóng [4].
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa

dạng di truyền của cây Ba kích tại Quảng Nam-Đà Nẵng bằng chỉ thị phân
tử RAPD”,


3

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH

1.1.1. Phân loại khoa học
Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis How., thuộc họ Cà phê Rubiaceae, tại Việt Nam Ba kích còn có nhiều tên gọi: Dây ruột gà, Ba kích thiên,
Liên châu Ba kích, Chẩu phòng xì (Mông), Sáy cáy (Thái), Thau tày cáy (Tày),
Chồi hoàng kim (Mường), Chày kiàng đòi (Dao).
Ba kích là cây lâu năm, dạng thân leo cuốn vào giá đỡ. Rễ có thịt dày, hình
trụ tròn, cong queo, thắt thành từng đoạn như ruột gà, được chế biến sử dụng làm
thuốc. Thân hình trụ tròn, phân nhánh nhiều. Cành non có lông thô màu nâu khi
già nhẵn không lông. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, có cuống. Lá kim
nhỏ hợp thành ống màu xám nâu. Phiến lá hình elip thuôn dài, lá non màu tím có
lông, lá già màu xanh không lông. Cụm hoa ở nách lá hay đầu cành. Hoa nhỏ màu
trắng ngà. Quả khi còn non màu xanh, khi chín màu hồng
1.1.2. Giá trị dược liệu
Theo y học hiện đại Ba kích có tác dụng: Tăng cường sức đề kháng của cơ
thể đối với các yếu tố độc hại, chống viêm, điều hoà hoạt động nội tiết. Đối với
nam giới có hoạt động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tang khả năng giao
hợp. Đối với người già hoặc những bệnh nhân đau mỏi khớp, Ba kích có tác dụng
giảm đau rõ rệt sau khi sử dụng Ba kích dài ngày. Rễ Ba kích chiết xuất bằng rượu
có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng
cường não [5].

Theo y học cổ truyền, cây Ba kích có tác dụng bổ thận tráng dương, mạng
gân cốt, khử phong thấp. Từ xa xưa nhân dân ta đã biết sử dung rễ Ba kích trong
nhiều bài thuốc dân gian để chữa bệnh, Ba kích là vị thuốc bổ trí não và tinh khí,
dùng trong các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ kinh nguyệt
không đều, phong thấp, huyết áp cao [2].


4
1.1.3. Phân bố
Cây Ba kích mọc hoang ở hầu hết các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam
như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang,
Thái Nguyên, Bắc Cạn, Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ, Lai Châu, Sơn La, Hoà Bình,
Ninh Bình, Thanh Hoá và Nghệ An. Ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Ấn Độ, Lào
và Triều Tiên. Cây thích ứng rộng với điều kiện sinh thái. Cây ưa sáng ở giai đoạn
trưởng thành, tuy nhiên cây dưới 2 năm tuổi có khả năng chịu bóng. Cây tồn tại
và phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 22,5-23,1°C, chịu được nhiệt độ tối thấp
tuyệt đối -2,8°C và tối cao tuyệt đối 41,4°C. Độ ẩm không khí trung bình từ 8289%. Lượng mưa bình quân năm từ 1420,7 - 2574,5 mm. Ba kích ưa đất feralit
đỏ vàng và đất feralit giàu mùn trên núi, đất thịt ẩm mát. Cây sinh trưởng sau 5
đến 7 năm mới thu dược liệu, năng suất bình quân 8-12 kg củ tươi/gốc, càng để
lâu năm sản lượng càng cao chất lượng dược liệu càng tốt [13].
1.1.4. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây
Ba kích trong và ngoài nước
a. Các nghiên cứu ngoài nước
Ba kích là loài phân bố hẹp trên thế giới nên có ít công trình nghiên cứu về
loài cây này, chỉ có một số công trình nghiên cứu điển hình ở Australia và Trung
Quốc. Các nghiên cứu này tập trung vào các tác dụng dược lý cũng như các thành
phần hóa học của loài cây này.
Ding và cs (Trung Quốc) đã phân tích đa dạng di truyền cây Ba kích bằng
40 chỉ thị RAPD, trong đó có 14 mồi cho sản phẩm đa hình. Qua phân tích kết
quả các tác giả đưa ra kết luận có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích (Trung Quốc)

ở mức độ phân tử [16].
b. Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu của Chu Thị Thu Hà về tính đa dạng di truyền của cây Ba kích
ở tỉnh Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR năm 2015 đã chọn được 6 mồi ISSR để tiến
hành phân tích bằng phương pháp PCR-ISSR cho tỉ lệ băng đa hình là 93,2% và


5
giá trị PIC trung bình là 0,7799. Kết quả cho thấy các mẫu Ba kích được chia
thành 2 nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,32 đến
0,88 từ đó khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân tử
[5].
Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích của Võ Châu Tuấn và cs (2010).
Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng đoạn thân (khoảng 1cm) để tái sinh chồi
in vitro trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,25 mg/L Kinetin. Sau đó các
chồi này tiếp tục được nhân nhanh trong các môi trường có bổ sung các chất kích
thích sinh trưởng. Số lượng chồi đạt nhiều nhất trên môi trường MS có bổ sung
3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA là 15 chồi/ mẫu cấy. Chồi được đưa vào môi trường
tái sinh rễ tốt nhất là môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L IBA. Cây con in vitro
được đưa ra nhà lưới thu được kết quả đạt 97,9% thích nghi [11].
c. Tình trạng khai thác cây Ba kích tại Quảng Nam – Đà Nẵng
Thấy được giá trị dược học, giá trị kinh tế của cây Ba kích vô cùng to lớn,
điều đó dẫn đến việc khai thác một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát. Chính vì vậy đã làm
cho số lượng cây Ba kích ngoài tự nhiên giảm mạnh, tính đa dạng về cây Ba kích
giảm nhanh, có nguy cơ tuyệt chủng. Ba kích đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam
cần được bảo vệ [1]. Tình trạng này cũng đã và đang xảy ra tại vùng Quảng NamĐà Nẵng.
Sau tình trạng khai thác ồ ạt, tính từ sau năm 2006, tại khu vực Quảng NamĐà Nẵng đã tiến hành trồng cây Ba kích. Ban đầu, giống Ba kích được lấy từ khu
vực vùng núi xã Lăng (Tây Giang, Quảng Nam) và được trồng nhiều tại đây bằng
phương pháp dâm hom. Sau đó, Ba kích được trồng sang nhiều khu vực khác:
Nam Giang, Đông Giang, Hòa Khánh (Đà Nẵng) …. Không những thế, trong

những năm gần đây, giống Ba kích đang được nhập từ các khu vực khác hay lấy
giống từ công nghệ nuôi cây mô (Phước Hiệp, Phước Sơn, Quảng Nam). Điều đó
dẫn đến nguồn gen cây Ba kích tại Quảng Nam khá phức tạp và không đồng nhất,
nguồn giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ


6
họ hàng các giống giữa các vùng. Chất lượng giống không ổn định ảnh hưởng đến
quá trình sản xuất.
1.2.

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
Chỉ thị phân tử (Molecular marker) hay chỉ thị di truyền (Genetic marker)

là các dấu hiệu, hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể. Điểm khác
biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự
khác biệt về trình tự gene của mỗi sinh vật. Chỉ thị phân tử thường là các đoạn
DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể, và đoạn DNA này liên kết chặt với
tính trạng đang khảo sát. Liên kết chặt có nghĩa là trong quá trình sinh sản, chỉ thị
phân tử đó luôn được di truyền kèm với tính trạng đang khảo sát cho thế hệ con.
1.2.1. Chỉ thị RAPD
Kỹ thuật RAPD là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất để
nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật.
Cùng với sự phát minh ra phản ứng chuỗi mở rộng (PCR-polymerase chain
reaction) bởi Mullis năm 1983 và việc đưa vào sử dụng enzyme DNA polymerase
chịu nhiệt năm 1988, kĩ thuật in dấu DNA (fingerprinting) đã được cách mạng
hóa để tạo ra một số lượng lớn các chỉ thị trong thời gian ngắn, với DNA khuôn
mẫu ở lượng nanogram, tự động hóa trong hoạt động cho hiệu quả cao, mạnh và
những phân tích đáng tin cậy. Mặc dù có nhiều tiến bộ to lớn trong các chỉ thị

phân tử để có được các thông tin di truyền nhưng RAPD vẫn được sử dụng bởi
một số lý do. Phương pháp này có những thuận lợi đáng kể so với các phương
pháp khác bởi vì nó nhanh, yêu cầu lượng DNA ít, phù hợp khi làm việc trên
genome chưa từng biết trước, có tính kinh tế, không liên quan đến các thủ tục
phức tạp liên quan đến xác định trình tự DNA, chỉ yêu cầu một phòng thí nghiệm
đơn giản với phương tiện tối thiểu cho thực hiện PCR, và có thể phát hiện đa hình
trong bất kì loại trình tự nào [6], [14].


7
Theo nguyên tắc của kỹ thuật RAPD, hai cá thể hoàn toàn giống nhau sau
khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ở những điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng
và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay
mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA
khác nhau giữa các cá thể. RAPD là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rộng rãi
để phân tích đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các
loài với nhau [6], [14].
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một mồi duy
nhất, một đoạn oligonucleotide ngẫu nhiên được chọn để khuếch đại vùng gene
bên cạnh của hai vị trí gắn mồi có chiều ngược nhau. Thông thường, trong phân
tích RAPD, mỗi mồi là một đoạn oligonucleotide dài 10 mer với khoảng 60-70%
G+C và không tự bắt cặp với nhau, nhiệt độ bắt cặp thấp (37 - 40°C). Mồi bắt cặp
với trình tự mà giống hệt hoặc tương đồng cao trên DNA khuôn mẫu mặc dù có
một vài điểm không tương đồng, đặc biệt là ở đầu 5’. Sự đa hình được phát hiện
là do sự xuất hiện hay không xuất hiện băng và có thể do cả việc thay đổi trong
trình tự bắt cặp của mồi và cả do hiện tượng chèn đoạn/mất đoạn giữa hai vị trí
gắn mồi [6], [14].
Hầu như tất cả các marker RAPD là maker trội. Nó không có khả năng phân
biệt đoạn DNA được khuếch đại từ một locus là đồng hợp (2 bản sao) hay dị hợp
(1 bản sao). Hiếm khi có marker RAPD đồng trội nhận biết được kích thước khác

nhau của đoạn DNA khuếch đại từ cùng một locus. Sự đa hình các đoạn khuếch
đại chủ yếu là do thay thế hay mất bazơ trong vị trí gắn mồi, sự chèn làm cho các
vị trí gắn mồi quá xa để mà có thể khuếch đại thành công hay sự thêm/mất bazơ
có thể làm thay đổi kích thước của đoạn được khuếch đại. Mặc dù số lượng đoạn
khuếch đại không phụ thuộc vào kích thước genome và mức đa bội thể nhưng
phản ứng khuếch đại được xác định một phần bởi sự cạnh tranh vị trí gắn mồi
trong genome. Mồi sẽ bám tốt hơn khi mức độ tương đồng cao hơn [6], [14].
Các kỹ thuật cải tiến từ RAPD như AP-PCR, SCAR, DAF, SRAP, CAPS,
RAMPO, và RAHM có thể bù đắp được những yếu điểm của RAPD và có thể


8
tăng cường sự tiện dụng của kỹ thuật này cho các trường hợp đặc trưng. Protocol
đơn giản so với các kỹ thuật hiện có [6].
Kỹ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu di truyền và xác
định quan hệ di truyền ở các loài. RAPD đã được sử dụng để phân tích đa dạng di
truyền ở các loài ngũ cốc như ngô, lúa… ở các cây có múi như bưởi, cam, quýt,
đa dạng di truyền ở một số loại đậu, một số cây ăn quả, các loài thủy hải sản…
Valdermar P.Carvalho và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên
cứu quan hệ di truyền giữa 79 giống ngô (Zea mays L.) bản địa và 2 giống ngô lai
hiện đang được người dân Brazil canh tác. Qua 32 mồi khuếch đại được 255 băng
với 184 (72.2%) băng đa hình và qua phân tích cho thấy sự chỉ số tương đồng là
0.78-0.91 [7].
Việc sử dụng các kỹ thuật ISSR và RAPD để phát hiện đa hình DNA, nhận
dạng kiểu gene và tính đa dạng di truyền của lúa mạch (Barley cultivars) đã biết
được nguồn gốc. Theo đó, 16 giống lúa mỳ từ các nước khác nhau được xác định
mối quan hệ phát sinh loài, được phân tích bằng 353 marker PCR (125 RAPD và
228 ISSR) [13].
32 mẫu thuộc chi Citrus và 3 mẫu thuộc chi Microcitrus trong bộ sưu tập
các giống cây Citrus, Đại học California (Mỹ) đã được Federici và cs (1998) kiểm

tra bằng phân tích RAPD. Dữ liệu cho thấy C.maxima cùng nhóm với các loài C.
hongheensis và C.latipes. Thanh yên (C. medica) cùng nhóm với C.indica, chanh
cốm, chanh và các dạng gần gũi. Quýt không thực sự thuộc về nhóm trên mà là
một loài khác, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có rất nhiều mẫu đã được xác
định loài sai [9].
1.2.2. Kỹ thuật RAPD-SCAR
Kỹ thuật SCAR là một trong những kỹ thuật được cải tiến từ kỹ thuật RAPD.
Phân tích RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu di truyền học quần thể, bản
đồ gene, … và là marker hỗ trợ lựa chọn các đặc điểm tốt quan tâm. Tuy nhiên, phân
tích RAPD nhạy cảm với những điều kiện phản ứng, thỉnh thoảng dẫn đến kết quả


9
không thể lặp lại. Do đó, những amplicon RAPD được phát triển thành marker
SCAR. Đối với kỹ thuật này, marker RAPD được giải trình tự và những primer có
chiều dài lớn hơn được thiết kế để sử dụng đặc hiệu cho từng locus cụ thể. Những
mồi SCAR dài hơn (thường 18-24 nucleotide) có nhiệt độ gắn mồi cao hơn nên đặc
hiệu và có thể lặp lại. SCAR sử dụng hiệu quả cho nghiên cứu lập bản đồ gene
(SCAR đồng trội), so sánh bản đồ gene, hay nghiên cứu mối quan hệ tương đồng
giữa các loài, kiểu gene và marker hỗ trợ chọn lọc các đặc điểm tốt quan tâm [6],
[14].
Trong các chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở PCR được sử dụng rộng rãi nhất
trong các nghiên cứu đa dạng di truyền, SCAR có những ưu điểm như ít nhạy cảm
hơn đối với điều kiện của một phản ứng PCR chuẩn do kích thước primer của nó
dài hơn nhiều so với RAPD do đó tính đặc hiệu và tính lặp lại cao hơn. Hơn nữa,
SCAR không yêu cầu hóa chất đồng vị phóng xạ và chỉ phát hiện các locus đơn.
Marker SCAR đã được sử dụng để nhận dạng loài trong đa dạng loài như ở thực
vật, côn trùng, vi sinh vật và động vật [14].
1.2.3. Kỹ thuật ISSR
Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) được sử dụng lần đầu tiên vào

năm 1994, đây là kĩ thuật dựa trên PCR nhằm khuếch đại đoạn DNA nằm giữa
hai vùng vi vệ tinh lặp lại xác định có hướng ngược chiều nhau. Kỹ thuật này sử
dụng các vùng vi vệ tinh, thường có chiều dài 16-25bp, làm mồi duy nhất trong
phản ứng PCR đối với các locus khác nhau trên genome để khuếch đại các đoạn
nằm giữa các vi vệ tinh tạo ra các sản phẩm có kích thước khác nhau [2], [14].
Kỹ thuật này có sự kết hợp các ưu điểm của phân tích AFLP, vi vệ tinh và
tính phổ biến của RAPD. ISSR có độ lặp lại cao, độ tin cậy cao hơn so với RAPD
do sử dụng mồi dài (16-18 nucleotide), nhiệt độ ủ và kéo dài cao hơn (45-60ºC)
dẫn đến kết quả chính xác hơn. Khoảng 92-95% các băng xác định lặp đi lặp lại
khi khuếch đại từ mẫu DNA của cùng một giống và các lần PCR khác nhau khi
được xác định bằng điện di polyacrylamide gel. ISSR là chỉ thị trội. Tuy nhiên,


10
cũng có trường hợp sự phân ly giống như một chỉ thị đồng trội, vì vậy có thể phân
biệt giữa dạng đồng hợp tử và dị hợp tử [14], [17].


11

Phần 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu lá non sau khi cắt khỏi cây được đựng trong túi polyetylen có gấp mép
giúp dễ bảo quản, di chuyển.
Mỗi đối tượng cần lấy từ 10 mẫu lá. Khi thu mẫu cần ghi chép đầy đủ thông
tin về vị trí lấy mẫu.
Các mẫu sau khi lấy có thể bảo quản trong điều kiện thường dưới 1 ngày,
bảo quản lạnh (40C) trong thời gian dưới 2 ngày, và ở nhiệt độ -200C.
Trong mỗi địa điểm sẽ thu mẫu ở nhiều khu vực khác nhau, trong quá trình

thu mẫu sẽ tìm hiểu kỹ nguồn gốc của giống, nơi cung cấp giống, và nơi xuất
giống, qua đó mở rộng phạm vi thu mẫu, khảo sát mẫu.


12
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu mẫu
Địa điểm thu
mẫu

Nguồn gốc

Toạ độ

Ký
hiệu

Cây trồng

15.858786,107.473520

BK1

Xã Lăng, Tây
Giang, Quảng
Nam

Xã A Tiêng,
Tây Giang,
Quảng Nam

Cây dại

15.850993,107.473741 BK10

Cây dại

15.858223,107.472233

BK7

Cây trồng

15.855937,107.473884

BK6

Cây dại

15.853099,107.473231

BK4

Cây trồng

15.914817,107.493751 BK11

Vĩnh Phúc

16.058450,108.135388

BK5

Phòng CNSH khoa SinhMôi trường, ĐH Sư
phạm- ĐH Đà Nẵng

16.062573,108.158239

BK8

Quảng Ninh

16.058450,108.135388

BK2

Phú Thọ

16.058450,108.135388

BK9

Quảng Trị

16.058450,108.135388

BK3

Đà Nẵng.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Sinh học,
Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thái
Các mẫu thu được từ các địa phương được phân loại theo kiểu hình đặc trưng
và được đánh giá bằng phần mềm NTSYSpc 2.0 với hệ số là NEI72, phương pháp
clustering SAHN.


13
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA
Mẫu lá cây Ba kích được tách chiết dựa trên phương pháp CTAB (theo
Kantipudi Nirmal Babu và cs có cải tiến).
Bảng 2.2. Thành phần đệm chiết qua các lần cải tiến
Thành phần đệm chiết

Đệm rửa

Đệm chiết CTAB 3%

Tris-HCl

0.2 mol/l

1.0 mol/l

EDTA

50 nmol/l

20 mmol/l

NaCl

0.25 mol/l

1.4 mol/l

1%

0%

β-mercaptoethanol
Quy trình thực hiện:

⁃ Lấy khoảng 0,3g mẫu nghiền thành bột mịn trong ống eppendorf 1.5 ml có

bổ sung 1ml dung dịch đệm rửa (đã được làm mát ở 40C) (chứa 0.2 mol/l TrisHCl, 50 mmol/l EDTA, 0.25 mol/l NaCl, pH = 8) cùng với 10 µl βmercaptoethanol, trộn đều; giữ ở 00C trong 10 phút, ly tâm 7 000 vòng trong 10
phút; thu kết tủa.
⁃ Lặp lại bước trên.
⁃ Bổ sung 1ml CTAB (chứa 1.4 mol/l NaCl, 1mol/l Tris, 20 mmol/l EDTA,

20 g/l CTAB, pH =8; 650C), trộn đều; ủ ở nhiệt độ 650C trong 1h (cứ 15 phút lắc
1 lần); Ly tâm 7 000 vòng trong 10 phút; dịch nổi được chuyển sang một
eppendorf vô trùng khác.
⁃ Bổ sung một lượng thể tích tương đương dung dịch choloroform/isoamyl

(24:1), lắc đều; ly tâm 10 000 vòng trong 10 phút; chuyển phần dịch dịch nổi sang
một ống eppendorf vô trùng khác.
⁃ Lặp lại bước trên

⁃ Bổ sung gấp 2 lần ethanol (được làm lạnh trước), lắc đều; Giữ ở -200C trong

30 phút; ly tâm, loại bỏ dịch lỏng, thu kết tủa.
⁃ Rửa kết tủa 3 lần bằng cồn 70%; sấy khô.


14
⁃ Bổ sung 100 µl nước cất vô trùng, lắc đều; bảo quản lạnh ở -200C.

2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose
DNA tổng số thu được sau tách chiết và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng
phương pháp điện di trên gel agarose và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn UV ECX20.C (European Economic Community).
2.2.3. Phương pháp PCR
Hỗn hợp phản ứng PCR có thể tích 20 µl bao gồm: 6 µl nước khử ion vô
trùng, DNA khuôn (30 ng/µl), 2 µl primer (10 pmol), 10 µl PCR master mix 2X
(các hoá chất này được tổng hợp bởi Phusabiochem).
Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR đã được cài
đặt chương trình với 40 chu kỳ như sau:

Hình 2.1. Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR.


15
2.2.4. Phương pháp phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD
Phản ứng RAPD-PCR được tiến hành trên tất cả các mẫu với tổng cộng 10
mồi ngẫu nhiêu 10 nucleotide (PhusaBiochem) bao gồm:
Bảng 2.3. Danh mục mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên đoạn

Trình tự đoạn mồi STT Tên đoạn Trình tự đoạn mồi (3’-

mồi

(3’-5’)

mồi

5’)

1

OPA-02

TGCCGAGCTG

6

OPD-01

ACCGCGAAGG

2

OPA-17

GACCGCTTGT

7

OPE-01

CCCAAGGTCC

3

OPB-04

TGATCCCTGG

8

OPC-03

GGGGGTCTTT

4

OPB-14

TCCGCTCTGG

9

OPF-02

GAGGATCCCT

5

OPC-04

CCGCATCTAC

10

OPF-11

TTGGTACCCC

2.2.5. Phân tích sản phẩm phản ứng PCR-RAPD
Sau khi phản ứng PCR kết thúc, điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose
1.5% với điều kiện điện di 30 Vol trong thời gian 3 giờ. Hình ảnh gel được hiển
thị bằng thiết bị UV ECX-20.C (European Economic Community).
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở
các mẫu nghiên cứu và tính toán theo DNA Ladder. Nếu một băng DNA xuất hiện
ở mẫu A nhưng không xuất hiện ở mẫu B hoặc đồng thời xuất hiện ở cả A và B
nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này được gọi là DNA đa
hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu thì gọi là băng đơn
hình.
Các băng được mã hoá bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì kí
hiệu là 1, không có kí hiệu là 0. Các số liệu này được phân tích bằng phần mềm