ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REAL TIME PCR TRONG PHÁT HIỆN một số đột BIẾN GEN ở BỆNH NHÂNTĂNG SINH tủy mạn ác TÍNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN MAI HỒNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
TRONG PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN Ở
BỆNH NHÂN TĂNG SINH TỦY MẠN ÁC TÍNH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN MAI HỒNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
TRONG PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN Ở
BỆNH NHÂN TĂNG SINH TỦY MẠN ÁC TÍNH
Chuyên ngành

: Xét nghiệm y học

Mã số

:

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Phạm Quang Vinh
2. TS. Dương Quốc Chính

HÀ NỘI - 2018


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABL

: Abelson leukemia virus (gen ABL)

AS-PCR

: Allele specific PCR (Phản ứng khuếch đại chuỗi allen đặc hiệu)

BCR

: Breakpoint cluster region

CALR

: Calreticulin

CML

: Chronic myelogenous leukemia (Bệnh Lơ-xê-mi kinh dòng hạt)

DNA

: Deoxyribonucleotid acid

EDTA

: Ethylenediaminetraacetic acid

EPO

: Erythropoietin

ET

: Essential thrombocythaemia (Bệnh tăng tiểu cầu tiên phát)

EZH2

: Enhancer of zeste homolog2

FAM

: 6-Carboxy Fluorescein

HEX

: Hexacloro- Fluorescein

JAK2

: Janus kinase 2 (Gen JAK2)

MPN

: Myeloproliferative neoplasm (Bệnh tăng sinh tủy mạn)

MPL

: Myeloproliferative leukemia virus oncogene (Gen MPL)

NGS

: Next Generation Sequencing (Giải trình tự gen thế hệ mới)

NST

: Nhiễm sắc thể

PCR

: Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)

Ph

: Philadelphia chromosome (Nhiễm sắc thể Philadelphia)

PMF

: Primary myelofibrosis (Bệnh xơ tủy nguyên phát)

PV

: Polycythaemia vera (Bệnh đa hồng cầu nguyên phát)

RNA

: Ribunocleotid acid

STAT

: Signal transducer and activator of transcription (Phân tử truyền
tín hiệu và hoạt hóa phiên mã)

TET2

: Ten-Eleven translocation oncogene family member

TPO

: Thrombopoietin

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1. Bệnh lý tăng sinh tủy mạn ác tính..........................................................3
1.1.1. Vài nét lịch sử..................................................................................3
1.1.2. Bệnh lý đa hồng cầu nguyên phát – Polycythemia vera.................4
1.1.3. Bệnh lý tăng tiểu cầu tiên phát – Essential thrombocythemia .......5
1.1.4. Bệnh lý xơ tủy nguyên phát – Primary myelofibrosis ....................6
1.1.5. Cập nhật tiêu chuẩn chẩn đoán tăng sinh tủy mạn của WHO năm 2016.....7
1.2. Một số đột biến gen phổ biến gây bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính........8
1.2.1. Đột biến gen JAK2V617F...............................................................9
1.2.2. Đột biến gen CALR.......................................................................11
1.3. Một số phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử................................13
1.3.1. Polymerase chain reaction và AS – PCR......................................13
1.3.2. Real time PCR ..............................................................................14
1.3.3. Next Generation Sequencing – NGS.............................................17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........20
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:...................................................................20
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn:.....................................................................20
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ.........................................................................20
2.1.4. Phương pháp chọn mẫu: thuận tiện...............................................21
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................21
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu:....................................................................21
2.2.2. Thời gian nghiên cứu.....................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................21
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................21


2.3.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................21

2.3.3. Vật liệu nghiên cứu.......................................................................21
2.3.4. Quy trình tiến hành nghiên cứu:....................................................22
2.3.5. Sai số và cách khống chế...............................................................24
2.3.6. Quản lý phân tích số liệu:..............................................................25
2.4. Vấn đề đạo đức nghiên cứu..................................................................25
CHƯƠNG 3. DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................26
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng tham gia nghiên cứu...........................26
3.1.1. Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu........................................26
3.1.2. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu........................................27
3.1.3. Đặc điểm thể bệnh của nhóm bệnh nghiên cứu.............................28
3.1.4. Đặc điểm gen đột biến được nghiên cứu ở nhóm bệnh.................28
3.2. Xây dựng quy trình...............................................................................28
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA................................................................28
3.2.2. Thiết kế mồi và đầu dò..................................................................28
3.2.3. Kết quả tối ưu quy trình Real-time PCR.......................................28
3.3. Đánh giá kết quả ứng dụng quy trình...................................................29
3.3.1. Kết quả ứng dụng quy trình...........................................................29
3.3.2. So sánh kết quả ứng dụng Real-time PCR và kết quả AS-PCR, NGS.....29
CHƯƠNG 4. DỰ KIẾN BÀN LUẬN...........................................................30
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................................31
DỰ KIẾN ĐỀ XUẤT, KIẾN NGHỊ.............................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
KẾ HOẠCH THỰC HIỆN
DỰ TRÙ KINH PHÍ
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Phân bố về giới tính của nhóm nghiên cứu.....................................26

Bảng 3.2. Phân bố giới tính theo từng nhóm bệnh nghiên cứu.......................26
Bảng 3.3. Phân bố độ tuổi của nhóm bệnh nghiên cứu...................................27
Bảng 3.4. Phân bố độ tuổi theo từng nhóm bệnh nghiên cứu.........................27
Bảng 3.5. Phân bố thể bệnh của nhóm bệnh nghiên cứu.................................28
Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ gen đột biến trong nghiên cứu..................................28
Bảng 3.7 Kết quả phát hiện đột biến theo phương pháp Real-time PCR........29
Bảng 3.8. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen nghiên cứu theo một số phương pháp.....29


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein JAK2........................................................10
Hình 1.2. Gen JAK2 đột biến trên exon 14.....................................................10
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Calreticulin...............................................12
Hình 1.4. Gen CALR đột biến trên exon 9......................................................13
Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime-PCR...........................16


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tăng sinh tủy mạn tính (Myeloproliferative neoplasm – MPN) là
nhóm bệnh lý đơn dòng của tế bào gốc vạn năng. Bệnh gây nên do sự
tăng sinh không kiểm soát của các tế bào gốc sinh máu trong tủy
xương, tiến triển mạn tính do liên quan đến khả năng biệt hóa đến giai
đoạn trưởng thành của tế bào dẫn đến tăng sinh các tế bào trưởng thành
ở máu ngoại vi. Những bệnh lý thuộc nhóm này thường có đặc điểm
chung là gan, lách to (do sự sinh máu ngoài tủy, thâm nhiễm của các tế
bào bệnh lý), tủy giàu tế bào, mẫu tiểu cầu tăng sinh và rối loạn hình
thái [1, 2]. Bệnh thường gặp ở người lớn ở độ tuổi 50 – 70, hiếm khi
gặp ở trẻ em với tỷ lệ mắc từ 6 – 9/ 100.000 người.

Các bệnh lý thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính thường gặp gồm
có: (1)Lơ-xê-mi kinh dòng hạt (Chronic Myelogenous Leukemia –
CML), (2)Đa hồng cầu nguyên phát (Polycythaemia vera – PV), (3)
Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential thrombocythaemia – ET), (4)Xơ tủy
nguyên phát (Primary myelofibrosis – PMF) hay còn được gọi là lách
to sinh tủy nguyên phát [1]. Trong quá trình tiến triển của bệnh, các
bệnh lý này có thể chuyển dạng lẫn nhau, và ở giai đoạn cuối của bệnh
10 – 30% bệnh nhân có thể chuyển dạng thành xơ tủy hoặc 10% bệnh
nhân chuyển dạng thành Lơ-xê-mi cấp gây nên sự chồng chéo giữa các
thể bệnh về dấu hiệu lâm sàng cũng như cận lâm sàng [3]. Riêng trong
bệnh lý Lơ-xê-mi kinh dòng hạt (CML), các nhà khoa học đã chứng
minh được vai trò quan trọng của tổ hợp gen lai BCR-ABL (được tạo
thành do kết quả chuyển đoạn t(9:22)(q34;ql l) hình thành nên nhiễm
sắc thể Philadelphia) trong sinh bệnh học và quá trình điều trị [4, 5].
Với các bệnh lý còn lại trong nhóm, chưa phát hiện các bất thường di


2

truyền đặc trưng riêng cho từng bệnh, vì vậy còn gây ít nhiều khó khăn
trong việc chẩn đoán và xếp loại bệnh.
Nhờ vào thành tựu của y sinh học hiện đại ngày nay, các nhà khoa
học đã xác định được vai trò của vật chất di truyền trong cơ chế phát
sinh bệnh, đó là các biến đổi gen, và bất thường nhiễm sắc thể. Vì vậy,
hiện nay đã có nhiều phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để
phát hiện các gen bất thường trong các bệnh máu như: Lơ-xê-mi, rối
loạn sinh tủy, u lympho hay tăng sinh tủy mạn tính…
Tại Việt Nam đã có các công trình nghiên cứu về các bất thường
nhiễm sắc thể hay các gen đột biến để phát hiện và chẩn đoán bệnh lý
tăng sinh tủy mạn như phản ứng khuếch đại allen đặc hiệu (Allele

specific PCR – AS-PCR) hay kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới
(Next Generation Sequencing - NGS). Kỹ thuật NGS có độ chính xác
cao tuy nhiên chi phí cũng rất cao và đòi hỏi nhiều phương tiện kỹ thuật
hiện đại, chuyên sâu mà không phải cơ sở xét nghiệm nào cũng thực
hiện được. Các kỹ thuật truyền thống như AS-PCR hay Multiplex-PCR
đều có độ nhạy không cao và thời gian trả kết quả kéo dài. Do đó chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR
trong phát hiện một số đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn
ác tính” ở nhóm bệnh MPN có nhiễm sắc thể Ph âm tính với 2 mục
tiêu:
1.

Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để phát hiện đột biến gen phổ biến
gồm JAK2V617F và CALR (type 1 & type 2) trong bệnh tăng sinh tủy

2.

mạn ác tính.
Bước đầu đánh giá kết quả phát hiện đột biến gen JAK2V617F và CALR
(type 1 & type 2) ở một số bệnh lý tăng sinh tủy mạn ác tính, không có
nhiễm sắc thể Ph, bằng kỹ thuật Real-time PCR tại viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương từ 1/ 2016 đến 8/2018.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Bệnh lý tăng sinh tủy mạn ác tính
1.1.1. Vài nét lịch sử
Tăng sinh tủy mạn là một nhóm bệnh lý phức tạp do những biến đổi,

rối loạn trong quá trình tăng sinh của tế bào gốc tạo máu. Bệnh được mô
tả lần đầu vào những năm thuộc thế kỷ XIX – XX [6]. Năm 1951,
William Dameshek đã mô tả một vài những đặc điểm giống nhau trên lâm
sàng và hình thái học các tế bào trong tủy xương ở các bệnh nhân được
chẩn đoán mắc Lơ-xê-mi kinh dòng hạt (CML), đa hồng cầu nguyên phát
(PV), tăng tiểu cầu tiên phát (ET) và xơ tủy nguyên phát (PMF). Bốn
bệnh này được gộp chung vào một nhóm và được gọi với thuật ngữ ban
đầu “Rối loạn tăng sinh tủy”.
Năm 1960, việc phát hiện bất thường trên NST số 22 ở bệnh nhân
CML và sau đó được đặt tên NST (Philadelphia) theo thành phố mà
Nowell và Hungerford đã phát hiện. Đến năm 1973, bằng các phương
pháp sinh học tế bào, các nhà khoa học đã chứng minh được NST Ph là
kết quả của chuyển đoạn trên nhánh dài NST số 9 và 22 t(9;22)
(q34;q11) và vai trò quan trọng của gen BCR-ABL trong cơ chế sinh
bệnh học ở bệnh nhân CML, cùng với đó phân chia thành 2 nhóm bệnh:
Nhóm bệnh có Ph (+) ở bệnh nhân CML và nhóm bệnh có Ph (-) ở các
bệnh nhân PV, ET, PMF [6].
Từ năm 2005, cùng với việc phát hiện các bất thường di truyền ở
cấp độ phân tử, WHO đã có những điều chỉnh và cập nhật tiêu chuẩn
chẩn đoán của nhóm “rối loạn tăng sinh tủy” gồm các marker di truyền
như đột biến JAK2V617F và đột biến JAK2 trên exon 12. Với cách tiếp


4

cận đơn giản này đã đơn giản hóa và làm tăng độ chính xác trong việc
chẩn đoán bệnh, và thuật ngữ “rối loạn tăng sinh tủy” khi đó cũng được
chuyển thành “tăng sinh tủy mạn tính” để có những phản ánh tốt hơn về
bản chất của nhóm bệnh lý rối loạn này [7].
1.1.2. Bệnh lý đa hồng cầu nguyên phát – Polycythemia vera (PV).

Đa hồng cầu nguyên phát là một bệnh thuộc nhóm tăng sinh tủy
mạn ác tính, được mô tả lần đầu năm 1892 bởi bác sỹ Vasquez người
Pháp. Bệnh có đặc trưng bởi tình trạng tăng sinh quá mức của tế bào
gốc tạo máu nghiêng về dòng hồng cầu, làm gia tăng số lượng hồng
cầu, nồng độ hemoglobin, hematocrit và độ nhớt máu làm tốc độ tuần
hoàn chậm lại, dễ gây biến chứng tắc mạch. Sự tăng sinh tế bào gốc
cũng làm ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng của tiểu cầu và các
dòng bạch cầu hạt khác [1, 8]. Bằng các nghiên cứu, các nhà khoa học
đã phát hiện thấy các tế bào tiền thân dòng hồng cầu của các bệnh nhân
này có thể tạo hồng cầu mà không cần có sự kích thích của
erythropoietin (EPO) và bệnh do tổn thương tế bào gốc tạo máu tiến
triển có tính dòng. Đây là bệnh lý ác tính khác với đa hồng cầu di
truyền do bất thường EPO – R (receptor của EPO).[9]
Theo báo cáo hàng năm, tỷ lệ bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát
ngày càng gia tăng theo độ tuổi từ 0.7 – 2.6/ 100.000 người ở Châu Âu
[10] và 22/ 100.000 người ở bang Connecticut [11]. Độ tuổi trung bình
của các bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát từ 55 – 60 tuổi, hiếm khi
gặp các bệnh nhân có tuổi dưới 20. [10].
Chẩn đoán PV, thường đánh giá trên những tiêu chuẩn của cả lâm
sàng và chẩn đoán phòng thí nghiệm. Bệnh nhân PV có thể gặp các
triệu chứng lâm sàng như đỏ mặt, đau tức ngực, gan lách to, đổ mồ hôi
về đêm, bị ngứa sau khi tắm nước nóng, mờ mắt, mệt mỏi sút cân, có
các triệu chứng thần kinh hoặc chóng mặt, đau đầu. Bệnh thường tiến


5

triển qua hàng chục năm, điều trị chủ yếu bằng rút máu và hóa chất.
Theo các nghiên cứu thì bệnh nhân PV thường có nguy cơ tắc mạch, do
vậy cần phân biệt với các bệnh lý khác trong nhóm tăng sinh tủy mạn.

[1, 9].
Ở các bệnh nhân PV thường có Hemoglobin, hematocrit tăng cùng với
hình ảnh tủy giàu tế bào và mang gen đột biến JAK2 [1, 3]. Khi nghi ngờ
bệnh nhân mắc PV, cần được làm các xét nghiệm về đột biến gen JAK2 và
nồng độ EPO huyết thanh.
1.1.3. Bệnh lý tăng tiểu cầu tiên phát – Essential thrombocythemia (ET).
Tăng tiểu cầu tiên phát là bệnh lý thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy mạn ác
tính, được mô tả lần đầu vào năm 1934 tại nước Áo [6]. Bệnh đặc trưng bởi
sự rối loạn, tăng sinh quá mức của tế bào gốc tạo máu nghiêng về dòng mẫu
tiểu cầu làm tăng số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi. Các mẫu tiểu cầu tăng
sinh trong tủy xương có rối loạn về biệt hóa dẫn đến tiểu cầu trưởng thành ở
máu ngoại vi có rối loạn về hình thái và chức năng khiến cho tiểu cầu có xu
hướng tăng kết dính tự nhiên gây tắc mạch, huyết khối hoặc giảm kết dính
gây chảy máu trên lâm sàng [1, 2, 6].
Tỷ lệ bệnh nhân ET hàng năm dao động từ 0.6 – 2.53 trường hợp /
100.000 người dân. Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân này từ 50 – 55
tuổi và chiếm ưu thế ở bệnh nhân nữ (tỷ lệ 2:1) [12, 13].
Hầu hết các bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát được phát hiện bệnh một
cách tình cờ khi làm xét nghiệm kiểm tra sức khỏe hoặc vào viện vì các biến
chứng hoặc chảy máu. Các bệnh nhân này thường gặp lách to (> 50% các
trường hợp), có các biểu biện của tắc vi động mạch (cơn đau buốt, hoại tử đầu
chi, loét cẳng chân, tắc tĩnh mạch chi dưới, mạch lách, võng mạch, cơ tim…)
hoặc gặp các biểu hiện chảy máu dưới da, niêm mạc tự nhiên hoặc sau sang
chấn. Trên tiêu bản máu ngoại vi thấy tiểu cầu tập trung thành đám lớn, có


6

kích thước to nhỏ không đều, tiểu cầu khổng lồ, kèm theo hình ảnh tủy giàu tế
bào, tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu với nhiều hình thái [1].

Đột biến gen JAK2V617F được tìm thấy khoảng 50% ở bệnh nhân ET, với
tỷ lệ đồng hợp từ 2 – 4%. Đột biến MPL trên exon 10 cũng được mô tả từ 2 – 5%
bệnh nhân ET. Đột biến có liên quan đến gen CALR được tìm thấy từ 15 – 25%
bệnh nhân ET và PMF (không chứa gen đột biến JAK2 hoặc MPL) [14].
Bệnh nhân ET thường có khuynh hướng huyết khối hoặc chảy máu, có
thể chuyển dạng thành bệnh lý tăng hồng cầu nguyên phát, xơ tủy thứ phát
hoặc hoặc bạch cầu cấp với tỷ lệ 2 – 10% các trường hợp [12, 13]. Tăng tiểu
cầu có thể dẫn tới hội chứng von Willebrand gây nên chảy máu ở các bệnh
nhân này. Ở phụ nữ có thai, tăng tiểu cầu tiên phát có thể có nguy cơ huyết
khối nặng hơn và thường sảy thai ở giai đoạn muộn [15].
1.1.4. Bệnh lý xơ tủy nguyên phát – Primary myelofibrosis (PMF).
Xơ tủy nguyên phát (Hay còn gọi là lách to sinh tủy) là bệnh lý
thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính, được mô tả lần đầu vào
năm 1879 tại Đức [6]. Bệnh có đặc điểm là tăng sinh quá trình sinh
máu kèm theo xơ tủy và dị sản tủy ở gan và lách (Do tình trạng xơ hóa
tủy gây giảm sinh máu, sinh máu không hiệu lực dẫn đến tình trạng
sinh máu bù ở ngoài tủy) [1].
Xơ tủy nguyên phát thường gặp ở nguời lớn tuổi. Độ tuổi trung bình của
nhóm bệnh lý này khi được chẩn đoán là 50 – 65 tuổi (những người nhỏ hơn
50 tuổi thường được chẩn đoán với tỷ lệ < 20%). Tỷ lệ sống trung bình của
nhóm bệnh nhân này là 5 năm, mặc dù có một số bệnh nhân có thể kéo dài sự
sống trên 20 năm [16].
Đột biến gây xơ tủy nguyên phát có liên quan đến gen JAK2, MPL,
TET2, CALR và EZH2, nhưng gen kích hoạt khởi đầu gây nên bệnh lý PMF
hiện vẫn chưa rõ. Theo các nghiên cứu trước đó, cho thấy bệnh lý xơ tủy


7

nguyên phát có 50 – 60% bệnh nhân mang đột biến JAK2V617F, 5 – 10%

bệnh nhân mang gen đột biến MPL, và 15 – 25% mang đột biến CALR [16].
Chẩn đoán xơ tủy nguyên phát được đánh giá theo tiêu chuẩn chẩn đoán
của WHO 2016, dựa trên nguyên tắc cơ bản về hình thái các tế bào tủy
xương, sự xuất hiện tình trạng xơ hóa và kèm theo có mang các gen đột biến
JAK2V617F hoặc MPL, CALR [17]. Việc đánh giá hình thái tế bào tủy
xương là rất quan trọng, từ khi phát hiện các sợi xơ hóa lắng đọng trong mô
song song với diễn biến của bệnh. Ở giai đoạn sàng lọc, không thấy dấu hiệu
của sự gia tăng reticulin và sợi collagen trong khi giai đoạn xơ hóa tủy xương
cho thấy sự gia tăng đáng kể reticulin và các sợi collagen [1]. Sự có mặt từ 10
– 19% của các tế bào blast trong máu hoặc tủy xương có thể xác định được
bệnh đang diễn biến nhanh, và trên 20% các tế bào blast trong máu hoặc tủy
xương có thể xác định bệnh chuyển sang dạng bạch cầu cấp [10].
1.1.5. Cập nhật tiêu chuẩn chẩn đoán tăng sinh tủy mạn của WHO năm
2016
Dựa trên sự kết hợp các đặc điểm di truyền học, hình thái tế bào học và
cơ sở phân tử của các bệnh lý di truyền thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn ác tính
được WHO xác định và cập nhật lại như sau: [7, 17, 18].
Tiêu chuẩn
Tiêu chuẩn WHO 2008
Tiêu chuẩn WHO 2016
Đa hồng cầu nguyên phát (PV) 2 tiêu chuẩn chính và tiêu chuẩn phụ
1. Hb >16.5 g/dL (nam), >16.0
1. Hb >18.5 g/dL (nam), >16.5
g/dL (nữ) hoặc Hct > 0,49
Tiêu chuẩn g/dL (nữ)
2. Mang đột biến JAK2V617F (nam), > 0.48 (nữ)
chính
2. Mang gen đột biến
hoặc đột biến JAK2/ exon 12
JAK2V617F hoặc JAK2/ exon 12.

Tiêu chuẩn 1. Tăng sinh 3 dòng tế bào tủy.
EPO huyết thanh bất thường.
2. EPO huyết thanh giảm
phụ
Tăng tiểu cầu tiên phát (ET) 3 tiểu chuẩn chính và tiêu chuẩn phụ
Tiêu chuẩn 1. SLTC ≥ 450 x109/L
1. SLTC ≥ 450 x109/L


8

chính

2. Tăng sinh lượng mẫu tiểu 2. Tăng sinh lượng mẫu tiểu
cầu, có hình thái lớn, trưởng cầu, có hình thái lớn, trưởng
thành. Không áp ứng tiêu chuẩn thành. Không áp ứng tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn
phụ

của WHO cho CML, PV, PMF, của WHO cho CML, PV, PMF,
tăng sinh tủy thứ phát
tăng sinh tủy thứ phát
3. Có mang gen đột biến 3. Có mang gen đột biến JAK2,

JAK2V617F
MPL, CALR,
Xơ tủy nguyên phát (PMF): 3 tiêu chuẩn chính và ít nhất 1 tiêu chuẩn phụ.
1. Tăng sinh mẫu tiểu cầu có bất
1.Tăng sinh mẫu tiểu cầu có bất

thường hình thái, đi kèm xơ tủy
thường hình thái, đi kèm xơ tủy
2. Không đáp ứng các tiêu
2.Không đáp ứng các tiêu chuẩn
chuẩn của WHO với Ph(+),
của WHO với Ph(+), CML, PV,
Tiêu chuẩn
CML, PV, ET, rối loạn sinh tủy,
ET, rối loạn sinh tủy, các bệnh
chính
các bệnh lý ác tính dòng tủy
lý ác tính dòng tủy khác.
khác.
3. Có mang đột biến JAK2,
3. Có mang đột biến
MPL, CALR,
JAK2V617F
1.Tăng SLHC, SLBC
1. SLBC ≥ 11 x 109/L
Tiêu chuẩn 2.Gan, lách to
2. Thiếu máu
3.LDH huyết thanh tăng
3. Lách to
phụ
4.Thiếu máu
4. LDH huyết thanh tăng
1.2. Một số đột biến gen phổ biến gây bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính.
Năm 2005, hơn 20 kiểu đột biến đã được phát hiện và mô tả ở các bệnh
nhân tăng sinh tủy mạn ác tính. Các đột biến này có liên quan đến con đường
JAK-STAT, yếu tố đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào và

sinh bệnh học của nhóm bệnh lý này [19]. Các dạng đột biến trong nhóm
bệnh lý này thường xảy ra với tần suất lớn trên các gen JAK2 và CALR [20].
Trong đó đột biến JAK2V617F trên exon 14 được tìm thấy đầu tiên ở những
bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ở nhóm có NST Ph âm tính [3, 21].


9

1.2.1. Đột biến gen JAK2V617F [3, 9, 21–23].
Janus kinase 2 (JAK2) là một protein có hoạt tính tyrosine kinase trong
tế bào chất, là thành phần quan trọng, tham gia vào quá trình truyền tín hiệu
từ các receptor của các yếu tố kích thích tạo máu (growth factor) và đóng vai
trò chủ chốt trong con đường JAK-STAT (phân tử truyền tín hiệu và hoạt
hóa phiên mã). Protein JAK2 được hoạt hóa khi các receptor trên màng tế
bào gắn với các yếu tố kích thích tạo máu. Sau khi được dimer hoạt hóa,
JAK2 gắn với các phân tử STAT, phosphoryl hóa để các phân tử này đi vào
nhân tế bào, gắn lên DNA đặc hiệu và bắt đầu quá trình phiên mã làm tăng
sinh và biệt hóa tế bào.
Protein JAK2 có trọng lượng phân tử khoảng 130 kDa, gồm 1132 acid
amin. Cấu trúc phân tử của JAK2 gồm 2 vùng quan trọng: JH1 là vùng có
hoạt tính tyrosine kinase (chứa các tyrosine cần thiết để kích hoạt JAK2), JH2
là một miền pseudokinase có cấu trúc tương tự như vùng JH1 và là vùng có
hoạt tính enzyme. Ở trạng thái bình thường, hoạt tính tyrosine kinase của
vùng JH1 luôn bị ức chế bởi tác dụng của vùng JH2.

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein JAK2


10

Gen JAK2 nằm trên cánh ngắn của NST số 9, (9p24) gồm 15 exon, dài
khoảng 152kb, chứa các trình tự nucleotid mã hóa cho việc tổng hợp protein
JAK2. Năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập bằng những phương pháp
nghiên cứu khác nhau đã phát hiện đột biến điểm G  T trên exon 14 của gen
JAK2 ở vị trí nucleotid 1849. Sự thay thế G  T trên gen JAK2 làm biến đổi
acid amin valine ở codon 617 thành phenylalanine xảy ra ở vùng JH2 của
protein JAK2.

Hình 1.2. Gen JAK2 đột biến trên exon 14
Đột biến JAK2V617F này làm phá vỡ khả năng tự điều hòa của vùng
JH2 gây tăng hoạt tính tyrosine kinase của protein này, thậm chí ngay cả khi
không có các yếu tố kích thích tạo máu và kết quả là tăng sinh không kiểm
soát được các tế bào tạo máu. Dạng đột biến này thường gặp ở 96% bệnh
nhân đa hồng cầu nguyên phát, 55% trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát và
65% các trường hợp xơ tủy nguyên phát. Đây cũng là xét nghiệm giúp phân
biệt với bệnh lý đa hồng cầu di truyền do dột biến gen mang thông tin tổng
hợp EPO – R. Như vậy, có thể thấy đột biến JAK2V617F có vai trò quan
trọng trong cơ chế sinh bệnh học ở nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ác tính
với NST Ph (-).
Người ta quan sát thấy đột biến JAK2V617F xảy ra từ tế bào gốc sinh máu
và trên cả những tế bào nguồn sinh máu đa tiềm năng. Đột biến này được phát
hiện trên tất cả các tất cả các dòng tế bào sinh máu, bao gồm cả lympho B và


11

lympho T. Cho đến nay, người ta vẫn chưa phát hiện thấy đột biến JAK2V617F
ở những người khỏe mạnh hay những bệnh nhân có tình trạng tăng sinh tủy phản
ứng. Đây là một đặc điểm rất quan trọng giúp chẩn đoán phân biệt các bệnh tăng
sinh tủy mạn tính với các bệnh tăng sinh tủy phản ứng.

1.2.2. Đột biến gen CALR (type 1 và type 2) [20, 24–28].
Calreticulin là một gen mã hóa protein Calreticulin, một protein liên kết
Ca2+ với hoạt động đa chức năng, thường tập trung phần lớn ở lưới nội sinh
chất trong tế bào, protein này còn có thể tìm thấy trên bề mặt tế bào hay trong
tế bào chất. Tại lưới nội sinh chất, Calreticulin đóng vai trò quan trọng trong
sự hình thành các nếp gấp của các protein mới hình thành (việc gấp khúc của
các chuỗi polypeptid). Đồng thời liên kết với Ca 2+ và duy trì nồng độ của Ca2+
trong tế bào giúp kiểm soát hoạt động gen, thúc đẩy sự phát triển và phân chia
tế bào, gắn kết, điều chỉnh tế bào và có liên quan đến chu trình apoptosis.
Ngoài ra Calreticulin còn có chức năng ngoại bào khác liên quan đến điều hòa
đáp ứng miễn dịch.
Protein Calreticulin có trọng lượng phân tử khảng 46 kDa, được hình
thành bởi 3 vùng cấu trúc và có chức năng quan trọng: (1) Vùng N-domain
tận liên kết lectin có vai trò quan trọng trong việc gắn Zn 2+ và các hoạt động
chức năng liên quan đến nó. (2) Vùng P-domain giàu proline liên kết với Ca 2+
nồng độ thấp và (3) vùng C-domain có chứa nhiều vị trí để liên kết Ca 2+ để
tạo nên các hoạt động đa chức năng. Calreticulin ở lưới nội sinh chất được
gắn một tín hiệu KDEL (KDEL là một trình tự gồm 4 acid amin: Lysin –
Aspartate – Glutamat – Leucin, có tác dụng như một tín hiệu cho việc lưu giữ
protein này tại lưới nội sinh chất đồng thời thu hồi protein này từ bộ Golgi trở
lại lưới nội sinh chất để thực hiện các chức năng quan trọng của nó).


12

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Calreticulin
Gen Calreticulin nằm trên cánh ngắn của NST 19 (19p13) gồm 9 exon,
dài khoảng 5.89 kb mã hóa cho việc tổng hợp protein Calreticulin. Các đột biến
được phát hiện trên exon 9 của gen CALR xảy ra do thêm đoạn hoặc mất đoạn
hoặc kết hợp cả 2 dạng đột biến tạo nên một đột biến dịch khung, làm thay đổi

trình tự chuỗi acid amin tại vùng C-domain cuối cùng tạo nên protein đột biến bị
thiếu tín hiệu KDEL. Ca2+ gắn với protein đột biến này gây phá huỷ bề mặt tế
bào, từ đó gây phần chia 1 phần CALR với lưới nội sinh chất. Đột biến gen
CALR phổ biến, được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu gồm 2 type:
- Type 1: Đột biến mất đoạn 52 bp (p.L367fs*46). Dạng đột biến type 1
thường chiếm tỷ lệ ≈ 50% các trường hợp đột biến CALR
- Type 2: Đột biến thêm đoạn 5bp TTGTC (p.K385fs*47). Dạng đột biến
type 2 thường gặp ≈ 30% các trường hợp đột biến CALR.

Hình 1.4. Gen CALR đột biến trên exon 9
Với các tế bào gốc sinh máu và tế bào nguồn sinh máu đa tiềm năng, đột
biến CALR có thể không làm giảm quá nhiều lượng Ca 2+ được gắn trên


13

protein Calreticulin ở lưới nội sinh chất làm tín hiệu con đường calcineurin –
NFAT (Nuclear factor of activated T cell) hoạt động kém hiệu quả hơn gây
kích thích các tế bào gốc sinh máu dòng tủy và tế bào nguồn dòng mẫu tiểu
cầu phát triển (Không bao gồm các tế bào nguồn dòng hồng cầu). Điều này có
thể giải thích cho chúng ta thấy trong nhóm bệnh MPN cổ điển, đột biến gen
CALR được tìm thấy ở nhóm bệnh nhân ET và PMF. Tuy nhiên, cũng theo 2
nhóm nghiên cứu khác nhau trong thời gian gần đây đã chứng minh đột biến
gen CALR gây kích hoạt con đường JAK2 thông qua sự liên kết với gen MPL
và gây nên cơ chế tăng tiểu cầu.
1.3. Một số phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử.
1.3.1. Polymerase chain reaction (PCR) và AS – PCR [29, 30].
PCR là phản ứng hóa học tổng hợp DNA dựa trên khuôn mẫu ban đầu
nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Phản ứng dựa trên sự thay đổi
nhiệt độ theo chu kỳ, trải qua 3 giai đoạn: (1) DNA khuôn được biến tính từ

sợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (92º đến 95º). (2) Nhiệt độ được hạ thấp
xuống từ 55º đến 65º để tạo điều kiện cho mồi gắn vào DNA khuôn. (3) Nhiệt
độ tăng lên khoảng 72º cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp kéo
dài chuỗi DNA nhờ trình tự mồi. Sau 3 bước nhiệt độ, chu trình phản ứng
được lặp lại liên tiếp từ 30 – 35 lần. Lượng DNA tạo ra là A x 2 n (trong đó A
là số khuôn DNA ban đầu, n là số chu kỳ nhiệt của phản ứng).
Allele specific PCR (AS – PCR): Là một kỹ thuật cải tiến của PCR
thông thường, được ứng dụng trong sàng lọc và phát hiện các đột biến di
truyền. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc thiết kế một đoạn mồi có trình tự sai
khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotid ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéo
dài chuỗi DNA của enzyme Tag polymerase trong phản ứng PCR. Trong
phương pháp này, 2 ống phản ứng PCR được thiết kế song song: ống thứ nhất
được sử dụng cặp mồi primer đặc hiệu cho allele bình thường, ống thứ hai sử


14

dụng cặp mồi để khuếch đại allele đột biến. Vì vậy, trong phản ứng PCR
thường có ít nhất một sản phẩm: Nếu trường hợp dị hợp tử thì 2 ống PCR đều
có 1 băng sản phẩm khi điện di, nếu trường hợp đồng hợp mang gen bệnh thì
ống thứ hai xuất hiện băng sản phẩm, ngược lại, nếu đồng hợp mang gen bình
thường thì chỉ có ống thứ nhất xuất hiện băng đặc hiệu.
1.3.2. Real time PCR [29, 31].
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA được hiển
thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua hệ thống nhận biết của
máy. Các sản phẩm của quá trình PCR được gắn huỳnh quang và dựa vào
ngưỡng phát hiện huỳnh quang, từ đó sẽ biết được lượng DNA đích ban đầu có
trong ống phản ứng. Sử dụng các chất huỳnh quang gắn vào sợi DNA kép nên
kỹ thuật PCR định lượng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với PCR
truyền thống. Đặc biệt với real-time PCR, phản ứng được thực hiện trong hệ

thống kín, không cần thêm các thao tác phân tích kết quả sau phản ứng, do đó rút
ngắn được thời gian thực hiện và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.
Kết quả của Real-time PCR được thể hiện qua biểu đồ khuếch đại phản
ứng và được biểu thị ngay trên máy sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Biểu
đồ này biểu biện cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận
nguồn ánh sáng kích thích (trục Y) tương ứng với sự gia tăng của các chu kỳ
nhiệt (trục X) của phản ứng. Sự khuếch đại DNA trong phản ứng RealtimePCR trải qua 3 giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn ủ: Xảy ra trong những chu kỳ đầu của phản ứng. DNA đích
được nhân lên và gắn huỳnh quang nhưng số lượng còn ít, cường độ huỳnh
quang thấp chưa đủ phát ra ánh sáng để máy ghi nhận. Giai đoạn này được
biểu thị bằng một đường nằm ngang trong biểu đồ khuếch đại phản ứng.
- Giai đoạn lũy thừa: Khi số lượng bản sao DNA đích đạt đến một
ngưỡng nhất định, sản phẩm DNA có gắn huỳnh quang phát ra cường độ


15

huỳnh quang đủ để máy ghi nhận được. Trong giai đoạn này, số lượng bản sao
DNA và cường độ huỳnh quang đều tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt của
phản ứng. Lúc này đường biểu diễn khuếch đại phản ứng trong đồ thị bắt đầu
đi lên.
- Giai đoạn bình nguyên: Là giai đoạn kết thúc của quá trình phản ứng,
khi lượng dNTP cạn kiệt dần và enzyme Tag polymerase hoạt động không còn
hiệu quả. Giai đoạn này số lượng bản sao DNA đích và cường độ huỳnh
quang sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên bằng một đường nằm ngang trong
biểu đồ khuếch đại phản ứng.

Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime-PCR
Chất phát huỳnh quang được sử dụng cho phản ứng Real-time PCR
thường được chia thành 2 loại:

- Dùng chất phát huỳnh quang là một loại màu chèn vào sợi đôi DNA. Khi
có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại PCR thì chất màu huỳnh quang sẽ bị
chèn vào và tập trung trên các sợi đôi DNA làm cho tube phản ứng phát huỳnh


16

quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Trước đây Ethidium bromide được
sử dụng làm chất chèn nhưng sau này thường sử dụng nhất là SYBR I vì các ưu
điểm vượt trội như màu huỳnh quang nền thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao
nhưng không làm sợi đôi gắn chặt vào nhau khi bị biến tính.
- Dùng chất phát huỳnh quang là các đoạn trình tự dò – probe: Là những
đoạn oligonucleotide sợ đơn có trình tự có khả năng bắt cặp bổ sung đặc hiệu
với DNA đích. Khi có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản
ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phảm khuếch
đại dẫn đến sự phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp (phụ thuộc vào
số lượng bản sao DNA đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng).
1.3.3. Next Generation Sequencing – NGS
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trình tự sắp
xếp của 4 loại nucleotid gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine) và C
(Cytosine) trên phân tử DNA. Trong những năm trước đây, việc đọc trình tự
DNA còn gặp nhiều khó khăn do máy móc có giá thành cao, mất thời gian để
đọc toàn bộ hệ gen do vậy chỉ phù hợp cho kiểm tra các gen riêng lẻ và một
số xét nghiệm chẩn đoán phân tử sử dụng trong các phòng thí nghiệm y học
như di truyền phân tử, di truyền dược học, bệnh về máu và vi sinh… Công
nghệ giải trình tự gen được ứng dụng trong những năm gần đây với những ưu
điểm như: độ nhạy và độ chính xác cao, hiệu suất cao, đã phát triển nhanh
chóng và trở thành một công cụ phân tích quan trọng cho các nhà di truyền
học. Ngày nay, các công ty thương mại đã cho ra đời các thế hệ máy đọc trình

tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Genration Sequencing - NGS). Các kỹ
thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng
huỳnh quang phân tích tự động [32, 33]. Các công nghệ đọc trình tự mới luôn


17

có xu hướng làm tăng dung lượng (throughput), làm giảm thời gian và hạn
chế bớt chi phí xét nghiệm [34].
Sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật NGS là một cuộc cách mạng trong
công nghệ đọc trình tự nói riêng và trong công nghệ sinh học phân tử nói
chung. Với các tiến bộ về thiết bị và hóa chất, hiện nay đọc trình tự bộ gen
của một cơ thể sống có thể được thực hiện tại các phòng thí nghiệm với thiết
bị đọc trình tự thế hệ mới như Illumina MiSeq, Ion-Torrent PGM,…trong thời
gian ngắn (thậm chí chỉ trong 24 giờ) thay vì phải kéo dài hàng năm. Trình tự
bộ gen có thể được đọc dễ dàng với các thiết bị có công suất nhỏ khoảng 6-10
Gbases mà không cần đến hàng trăm Gbases để phát hiện được các tác nhân
gây bệnh, các đột biến gen với tần xuất thấp. Chính vì vậy, kỹ thuật giải trình
tự thế hệ mới là một công cụ không thể thiếu được trong phát hiện và định
lượng các đột biến trong ung thư, trong bệnh di truyền.
Nguyên lý đọc giải trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý
chính. Nguyên lý thứ nhất đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by
synthesis, SBS) đã được các thế hệ máy Roche 454, Ion Torrent và
Illumina sử dụng. Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối
(sequencing by ligation, SBL) được sử dụng ở máy SOLiD do George
Church phát minh. SBL đã được sử dụng để xác định trình tự genome
và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới. Hiện nay, các
dòng máy của Illumina như là MiSeq và HiSeq được ứng dụng rộng
rãi.
Quy trình giải trình tự bằng hệ thống Illumina trước hết đều cần

tạo ra một thư viện các phân mảnh đại diện cho mẫu genome cần giải
trình tự. Đây là giai đoạn chuẩn bị mẫu. Các mẫu DNA quan tâm sẽ bị
cắt thành các phân mảnh có kích thước thích hợp (trung bình 400 –
500bp). Các đầu tận cùng của các phân mảnh ADN được làm bằng và


18

được gắn hai trình tự adapter đặc hiệu vào hai đầu. Khác với hệ thống
454 và hệ thống của ABI sử dụng một phản ứng PCR dựa trên hạt nhũ
tương để tạo ra “polonies”, Illumina sử dụng một phản ứng duy nhất
“cầu nối” khuếch đại xuất hiện trên bề mặt của flow cell. Flow cell về
cơ bản là một tấm kính rất nhỏ có khả năng bám nước rất chặt để cung
cấp một diện tích bề mặt lớn cho hàng ngàn phản ứng hoá học song
song có thể xảy ra trên đó. Bề mặt flow cell được phủ chuỗi đơn
oligonucleotide tương ứng với các trình tự của các adapter đã gắn với
các phân mảnh trong giai đoạn chuẩn bị mẫu. Các phân mảnh sợi đơn
đã gắn adapter được liên kết với bề mặt của flow cell và được tiếp xúc
với các chất phản ứng. Mồi để xảy ra phản ứng tổng hợp chính là trình
tự chuỗi đơn oligonucleotide đã gắn trên bề mặt flow cell. Quá trình lặp
đi lặp lại việc biến tính và mở rộng dẫn đến việc khuyếch đại tại chỗ
một phân tử thành hàng triệu phân tử tại từng vị trí duy nhất trên bề mặt
tế bào. Việc giải trình tự trong khi tổng hợp được tiến hành theo nguyên
lý gắn màu huỳnh quang cho nucleotide cuối cùng và khoá dừng tổng
hợp thuận nghịch, đọc và chụp ảnh từng nucleotide trực tiếp. Giai đoạn
cuối cùng là sử dụng phần mềm chuyên biệt để sắp xếp các trình tự
riêng biệt thành một trình tự thống nhất của hệ gen và tham chiếu với
trình tự tham khảo.
Có thể nói, hệ thống giải trình tự Illumina với công nghệ SBS là
một bước phát triển vượt bậc trong lĩnh vực giải mã DNA. Độ chính

xác của thiết bị lên tới 99,9% với chất lượng dữ liệu (quanlity score) >
Q30. Do vậy, khi kết hợp đúng đắn các phương pháp giải trình tự thế hệ
mới với các phương pháp thế hệ cũ sẽ tạo ra một cuộc cách mạng về
giá thành và hiệu quả giải trình tự.[35, 36]