nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-thalassemia
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (860.6 KB, 61 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
…… ***……
LÊ THẾ KHƯƠNG
NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH
β-THALASSEMIA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2009 - 2013
Hà Nội - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
…… ***……
LÊ THẾ KHƯƠNG
NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH
β-THALASSEMIA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2009 - 2013
Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Huy Thịnh
Hà Nội - 2013
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tại trung tâm
gen protein trường đại học Y Hà Nội, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng
tận tình của các thầy, các cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc
tới TS. Trần Huy Thịnh, người thầy đã hết lòng dạy bảo, tận tình hướng dẫn
em những bước đầu tiên trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Tạ Thành Văn, PGS.
TS. Nguyễn Thị Hà, TS.Trần Vân Khánh, những người thầy người cô đã
giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em
trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại Học
Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em
thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn Ths. Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiên
cứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thành
khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, con thực sự biết ơn bố mẹ, mọi người thân yêu trong gia đình
đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăn
trong học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại
học Y Hà Nội.
Hà Nội,20 ngày 6 tháng năm 2013
Lê Thế Khương
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
***
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm
nghiên cứu, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng
được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 20 tháng 06 năm 2013
Người viết khóa luận
Lê Thế Khương
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
NST Nhiễm sắc thể
Cd Codon
Kb Kilo base
bp Base pair
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
PCR Polymerase Chain Reaction
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
BN Bệnh nhân
ĐB Đột biến
BT Bình thường
Hb Hemoglobin
HC Hồng cầu
MCV Thể tích trung bình hồng cầu
MCH Huyết sắc tố trung bình hồng cầu
MCHC Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu
Nu Nucleotid
WHO Tổ chức y tế thế giới
MỤC LỤC
!
"#$%& !
'($)!* +#$,-$
./01$23 454&!6
67849!& !:
;.!<&:
:=$>!?$@58 A52A$B8 A5C
D/$E+!>?F3'
C-$G8%& !
'HIJKL?B@5+M5>45!-$G8%)*G=!)I&!E5;
'7N@57O;
''!N!>PQ5>Q$REGS+>$T?$!5U:
'VWF 5!X!9D
'67N@5J!$?Y!S!5$!>$R4Z"OUD
';J5G=!)I&!E&32X!!S G![$R4>\>$4F ?R4F
OH.UD
':7N@5H?RG]7OC
HIJKL?B)55!^$@?2A@5+M5>45$_)4=2A)!3?>#&
!9!! C
`L?B)!+!?FEa$JC
'`L?B5!N!>PQ5b
`L?BOH.7Ob
6`L?BH?RG]OH.7O'c
''
defg77h7eij'
'J!0152A&G_ '
''70/5G=G5!^$@?'
''kM5$Ml>5!E&#'
'''?F>PKL?B'
''?F>PG=!)I&!Em'D
''6!+!k>^55>4'C
'';!N!>PQc
'
`noeij'
`ET?N=$$!Ek'
'`!* >$p015 q!2A$?_rT?F>P
'?_r7O)/ q!6
''`ET?N$?_rT?F>P ?RG]7OD
`ET?N]=$)#)I&!E>^&8C
6s5KE)I&!E>^&86c
66
g"t6
6`ET?N=$$!Ek6
6'`ET?N$?_r q!2AT?F>P6'
>45T?=>P$?_r q!2AT?F>P)uK!* >$p015 q!^Jl)($!?2X!
v549!)I&!E=$NG_ K!* >)I&!E)01$K!* >w)($!?&x5
G0/5G=G5!N!>PQ5l)8FAR^?$?_2A5>45$?_)4=&8)I
&!E !=$)!3?K!$yGN@5)01$J!0?r2X!v549!$(G q! 6'
`!Q$!GN@5 ?RG]7O2X!$=$&8&!E>0X$)I&!EPNG_ )!
+!KET?Nz )01$$rK{$0X$G|1G2X!K{$0X$$y)I&!ESPCUv)r$r
*=G+M5>^&86'
6`ET?N7O>^&86'
`n"t6C
`en}6b
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG
N5HIJK!*?)I&!E58Fcl~ !2A$=$&!E*&6
N5`ET?N)4q5)I2A)Iw9$$y$=$ •?k?K!=$$!Ev =?
549!2!$y&8'
N5'`ET?N&86c
DANH MỤC HÌNH
PH€P$p?>•$G8% 454&!‚Cƒ;
P'.!s51G54&!„$=$5!!)49G=>!*K=$?$yG€!2A!
S5?qm !2U;
PB?T?NN]?p+0v$?Y!… !‚cƒC
P6/$E+!>?F3>^!, a$*0†5S\?‡!K!4>5ˆ !U
P'#>{ IJ)I&!E58F& !>^5':
P`ET?N=$k'
P'PN)!+!ks5J
P`ET?NK!* >$p015 q!7;l7;‰l76l76‰l7D6
P6`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E+6ˆ6'SU;
P;`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E+DSU;
P:`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E'C :
PD`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!Ee.e :
PC`ET?N)!+!NG_ ?RG]OH.7OD
Pb`ET?NK!* >$p015k&x5 q!I!$?_b
PcPNNG_ 7Ob
P`ET?N]=$)#)I&!E)q51GF+#1G6c
B]Šm`ET?N^>‹Š]=$)#$=$ •?&8)3?&#)I&!E+#1G%6c
P6?=>PG!$!55?qm?>$4 6:
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia là tên một loại bệnh thiếu máu do di truyền. Nguyên nhân
do giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi globin trong phân tử hemoglobin.
Thalassemia là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp ghép từ 2 từ thalass (biển) và
haima (máu), do bệnh lần đầu tiên được phát hiện và phổ biến ở vùng Địa
Trung Hải. Tùy theo sự thiếu hụt khả năng tổng hợp chuỗi alpha (α), chuỗi
beta (β) hoặc chuỗi delta (δ) mà tên gọi của bệnh là α-thalassemia, β-
thalassemia hoặc δ-thalassemia [1].
β-thalassemia là một nhóm hội chứng thiếu máu đặc trưng bởi sự giảm
hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi β globin, điều này gây nên sự thiếu hụt
hemoglobin trong tế bào hồng cầu, giảm sản xuất hồng cầu và gây thiếu máu.
β-thalassemia được phân thành 3 thể nặng, trung gian và nhẹ. Ngoài ra bệnh
cũng liên quan tới sự bất thường của hemoglobin như HbE, HbC, HbS.
Hàng năm tỷ lệ mắc của trẻ sơ sinh ước tính khoảng 1 trong 100.000 trẻ
trên toàn thế giới và 1 trong 10.000 trẻ ở châu Âu [2]. Trong các nước khu vực
Đông Nam Á có tỷ lệ mắc thay đổi từ 3 đến 10%. Ở việt nam theo nghiên cứu của
Nguyễn Công Khanh năm 1993, β-thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu
máu ở trẻ em. Tỷ lệ người mang gen gây bệnh phân bố rộng khắp cả nước và khác
nhau theo vùng miền, dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ này khá cao ở các dân tộc ít người
như Mông(25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8,33%) [1].
Hiện nay, có khoảng hơn 200 đột biến trên đoạn gen tổng hợp chuỗi β
globin đã được xác định. Theo một nghiên cứu trên quần thể người Việt Nam
của M.L.Saovarros Svasti và Trần Minh Hiếu năm 2002 cho thấy các đột biến
chính gây bệnh β-thalassemia là Cd17(AAG-TAG), Cd41/42(-TCTT),
Cd71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A-G), IVS2-654(C>T) và
Cd26(GAG>AAG) [3].
1
Bệnh nhân trước đây được chẩn đoán thiếu máu β-thalassemia chủ yếu
dựa trên các triệu chứng lâm sàng và các thông số huyết học. Tuy nhiên các
chẩn đoán này là chưa đầy đủ và ít có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh.
Ngày nay trên sự phát triển của công nghệ đặc biệt là sinh học phân tử giúp
cho sự chẩn đoán đột biến gen gây bệnh là dễ dàng và chính xác giúp cho sự
hạn chế trẻ sơ sinh mang gen đột biến. Ở nước ta các kỹ thuật giúp cho sự
chẩn đoán đột biến gen đang được nghiên cứu và đạt được một số thành tựu
nhất định. Tuy nhiên sử dụng các kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến gen
β-thalassemia mới chỉ đang nghiên cứu chứ chưa được sử dụng rộng rãi trong
chẩn đoán trước sinh.
Từ những vấn đề nêu trên chúng ta cần tiến hành đề tài “Nghiên cứu và
xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-
thalassemia” với mục tiêu:
Áp dụng kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc và xác định một số đột biến
phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh β-thalassemia
1.1.1. Lịch sử bệnh thalassemia
β-thalassemia được phát hiện từ khá sớm 1925 bởi Lee và Cooley. Ca
bệnh đầu tiên có ngồn gốc từ Hy Lạp và Italy, đã đặt tên là bệnh thiếu máu
Cooley. Tới năm 1936, Wippe và Bradford phát hiện ra có nhiều bệnh nhân
thiếu máu tại vùng Địa Trung Hải giống với trường hợp năm 1925 và đặt tên
cho bệnh là thiếu máu β-thalassemia (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là thiếu máu
vùng biển) [4].
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học.
Thalassemia là bệnh di truyền có sự phân bố liên quan chặt chẽ tới
nguồn gốc dân tộc , tập tính di cư và kết hôn. Bệnh phát hiện trên nhiều nước
trên thế giới, chủ yếu có ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Bắc Phi, Đông
Nam Á. Theo ước tính WHO (1981) trên thế giới có khoảng 70 triệu người
mắc bệnh β-thalassemia, trong đó có khoảng 60 triệu ở Châu Á và 4800 người
ở Châu Âu[2].
Theo nghiên cứu của Renzo Galannello, Raffaella và Origa cứ 100.000
trẻ sơ sinh trên thế giới được sinh ra thì có 1 trẻ mắc bệnh. Trong đó cứ
10.000 trẻ sơ sinh tại châu Âu thì có 1 trẻ mắc bệnh [2].
Ở Việt Nam, trường hợp bệnh α-thalassemia và β-thalassemia được phát
hiện trên cả nước. β-thalassemia gặp nhiều ở dân tộc ít người ở miền bắc,
người Mường 25%, người thái 16,6%, người Nùng 7,1%[5]. Theo nghiên cứu
của Nguyễn Thanh Liêm khi khảo sát nhóm dân tộc Mường tại Kim Bôi Hòa
3
Bình thấy phát hiên đột biến tần số 10,67%. Ngoài ra nghiên cứu phát hiện tỷ
lệ người mang bệnh HbE khoảng 11,65%. Theo Nguyễn Công Khanh, tần
suất HbE xuất hiện khá cao ở nhiều dân tộc ít người ở miền Trung và Nam:
Êđê 41%, Khơme 36,8%, Stieng 55,9% [6]. Người mang bệnh HbE có biểu
hiện lâm sàng giống với bệnh β-thalassemia và thường có sự tương tác của
bệnh β-thalassemia với các bất thường hemoglobin khác.
1.1.3. Sơ lược về hemoglobin.
1.1.3.1. Chuỗi globin thường
Hemoglobin là một protein cấu trúc nằm trong hồng cầu có vai trò quan
trọng trong việc vận chuyển O
2
đến các tổ chức và vận chuyển các sản phẩm
chuyển hóa H+ và CO
2
đến thận và phổi để đào thải. Ngoài ra hemoglobin
còn có chức năng như một enzyme và hệ thống đệm.
Cấu trúc phân tử Hb gồm nhân hem và chuỗi globin trong đó:
Globin có cấu trúc là 2 cặp chuỗi polipeptid. Ở người trưởng thành HbA
chiếm 95% được cấu tạo từ 4 chuỗi globin: 2 chuỗi α và 2 chuỗi β.
Chuỗi alpha tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 16 có kích
thước 141 acid amin.
Chuỗi beta tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 11 có kích
thước 146 acid amin.
Ngoài ra kích thước chuỗi delta, gama là 146 acid amin.
Nhân hem thuộc loại porphyrin là chất có khả năng kết hợp với các phân
tử kim loại. Hem ở người là loại porphyrin ІX kết hợp với Fe
ІI+
[7].
4
Hình 1.1 Mô hình cấu trúc phân tử hemoglobin[8]
1.1.3.2. Các loại hemoglobin sinh lý.
Ở người có sáu loại hemoglobin (Hb) biến đổi phát triển qua từng thời
kỳ phát triển.Ở thời kỳ phôi thai có Hb Gower, Hb Gower2 và Hb Porland.
Hemoglobin ở thời kỳ thai nhi tới trưởng thành là HbA
1
, HbA
2
và HbF. Thành
phần các loại hemoglobin có một tỷ lệ giới hạn nhất định theo lứa tuổi, thay
đổi tỷ lệ này là bệnh lý. [9]
Hình1.2 Sinh tổng hợp globin ở các giai đoạn phát triển khác nhau của
phôi và thai (Nguồn: thalassemia.vn)
Các chuỗi globin được chia làm 2 nhóm: chuỗi kép α gồm chuỗi ζ và α;
và chuỗi kép không α (hay còn gọi chuỗi kép β) gồm các chuỗi ε, β và δ.
5
1.1.4. Phân loại bệnh thalassemia
Hội chứng Thalassemia chỉ bao gồm các bệnh có bất thường về số lượng
chuỗi globin, khác với nhóm bệnh huyết sắc tố khác có sự bất thường về chất
lượng chuỗi globin ví dụ như bệnh huyết sắc tố E, huyết sắc tố F… Trong một
số trường hợp có sự kết hợp giữa sự bất thường về chất lượng và bất thường
về số lượng chuỗi globin.
Tùy theo sự bất thường về số lượng chuỗi globin mà người ta chia
thalassemia thành hai thể lớn là α-thalassemia và β-thalassemia.
β-thalassemia chia làm các thể khác nhau là
•β thalassemia thể nhẹ do đột biến gen HBB dạng dị hợp tử gây nên.
•β thalassemia thể nặng (bệnh Cooley) do đột biến gen HBB dạng đồng
hợp tử gây nên.
Ngoài ra còn có các thể liên kết với các bệnh hemoglobin khác (β-
thalassemia/ HbE, β-thalassemia/HbS, β-thalassemia/HbC và δβ-thalassemia).
1.1.5. Sinh lý bệnh.
Ở người trưởng thành bình thường tỷ lệ HbA chiếm 95% có chức năng
chính vận chuyển oxy cho tế bào. HbA được cấu tạo bởi 2 chuỗi α và 2 chuỗi
β liên kết bằng lực hút tĩnh điện, liên kết ion, liên kết hydro.
Trong hội chứng thalassemia có hiện tượng là thiếu hụt một loại chuỗi
polypeptide thành phần cấu tạo của globin, dẫn đến sự dư thừa của chuỗi kia.
Nếu thiếu hụt chuỗi β thì gọi là bệnh β thalassemia, khi chuỗi β giảm thì
chuỗi α sẽ tăng. Nếu sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi alpha thì gọi là bệnh alpha
thalassemia. Bệnh nhân có biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào từng thể bệnh
và thường có biểu hiện sau:
Giảm tổng hợp Hb.
Hồng cầu nhỏ và nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy.
6
Hồng cầu mất độ mềm dẻo.
Trong tủy hồng cầu non chết trước khi trưởng thành.
Sự giảm tổng hợp Hb có biểu hiện trực tiếp qua thiếu hụt tổng hợp chuỗi
globin. Do đột biến của gen tổng hợp loại globin nào đó. Biểu hiện việc giảm
tổng hợp chuỗi globin là hồng cầu nhược sắc, tăng sinh hồng cầu non trong
tủy. Ở thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa các chuỗi alpha và beta [10].
Ở những người dị hợp tử thì biểu hiện chủ yếu là hồng cầu nhỏ và
nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy. Ở thể nhẹ, sự mất cân bằng
nhẹ giữa các chuỗi alpha và beta thì đặc trưng bởi việc tổng hợp globin.
Những người mang gen dị hợp tử ở máu ngoại vi xuất hiện hồng cầu nhỏ và
nhược sắc. Ngoài ra không thấy sự khác biệt giữa α-thalassemia và β-
thalassemia. Tuy vậy, biểu hiện tăng sinh hồng cầu non trong tủy không có ý
nghĩa trên lâm sàng [10].
Đối với các hồng cầu ở máu ngoại vi các tủa này làm hồng cầu mất độ
mềm dẻo, hồng cầu sẽ cứng đờ khó vượt qua các màng lọc ở lách. Mặt khác
các hạt naỳ làm tăng diện tích tiếp xúc, và dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy
hồng cầu. Các hạt tủa này làm thay đổi tính thấm của màng hồng cầu dẫn đến
mất ion kali trong tế bào. Những tác hại của hạt tủa này dẫn đến sự giảm tuổi
thọ hồng cầu gây nên hiện tượng tan máu [10].
Ở tủy xương, các hạt tủa gắn nên nguyên sinh chất, màng hồng cầu non
làm cho các hồng cầu non bị chết trước khi trưởng thành. Điều này làm tăng
sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy gây biến dạng xương, tang hấp thu sắt
gây nhiễm sắt cho cơ thể. Hiện tượng sinh hồng cầu non nhưng không phát
triển tới giai đoạn trưởng thành gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu
quả. Hiện tượng này là cơ chế chủ yếu gây nên các triệu chứng lâm sàng của
bệnh nhân thalassemia [10].
7
Hình 1.3 Hậu quả sản xuất dư thừa chuỗi α-thalassemia [10].
1.1.6. Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng.
1.1.6.1. β-thalassemia thể nặng (kiểu gen β
+
/β
+
, β
0
/β
+
, β
0
/β
0
)
Trong trường hợp tất cả các gen β Globin không hoạt động, bệnh nhân
không tổng hợp chuỗi β globin và được gọi là β thalassemia thể nặng (major)
hay thể đồng hợp tử (bệnh thiếu máu Cooley). Triệu chứng lâm sàng có biểu
hiện từ rất sớm từ giữa tháng thứ 6 và rõ ràng nhất khi trẻ được 2 tuổi. Trẻ sơ
sinh có biểu hiện thiếu máu mạn tính, xảy ra từ từ, mức độ từ nhẹ tới nặng.
Trẻ gặp vấn đề về ăn uống, tiêu chảy, khó chịu, những cơn sốt tái phát, và tiến
độ mở rộng vòng bụng do lá lách và gan bị nở lớn có thể xảy ra. Ở một số
nước phát triển, bệnh nhân không được điều trị hoặc điều trị muộn, biểu hiện
8
lâm sàng của bệnh thiếu máu chủ yếu được đặc trưng bởi chậm lớn, xanh xao,
vàng da, hệ thống bắp thịt nghèo, gan lách to, vết loét ở chân, phát triển các
cơ quan tạo máu, và xương thay đổi từ mở rộng của tủy xương. Thay đổi
xương bao gồm dị tật ở các xương dài của chân và thay đổi sọ và mặt điển
hình (cấu trúc của hộp sọ, gò má, mũi nghiêng, mắt lệch, và phì đại của hàm
trên, mà có xu hướng để lộ răng hàm trên).
Trong điều kiện được điều trị kịp thời theo chương trình điều trị duy trì
nồng độ Hb tối thiểu 9,5 đến 10,5 g/dL thì cơ thể phát triển bình thường từ 10
đến 12 năm[9]. Bệnh nhân được truyền có thể có các biến chứng liên quan
đến sắt quá tải. Các biến chứng của tình trạng quá tải sắt ở trẻ em bao gồm
chậm phát triển và trì hoãn sự trưởng thành. Sau biến chứng liên quan đến
tình trạng quá tải sắt bao gồm sự tham gia của trung tâm (giãn cơ tim hoặc
loạn nhịp tim), gan (xơ và xơ gan), và tuyến nội tiết (đái tháo đường, sinh dục
muộn và bất thường của tuyến cận giáp, tuyến giáp, tuyến yên, và, ít phổ biến
hơn, tuyến thượng thận). Các biến chứng khác là lách, viêm gan (do nhiễm
với vi rút gây bệnh viêm gan B hoặc viêm gan C), nhiễm HIV, huyết khối tĩnh
mạch và loãng xương [11]. Nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan tăng ở bệnh
nhân bị nhiễm siêu vi gan và tình trạng quá tải sắt. Bệnh nhân không được
truyền máu thường xuyên thường chết trước 30 tuổi. Bệnh nhân được truyền
máu thường xuyên và có lộ trình điều trị phù hợp sống ngoài 40 tuổi. Bệnh
tim do nhiễm sắt là biến chứng quan trọng nhất của tình trạng quá tải sắt trong
bệnh β-thalassemia. Trong thực tế, các biến chứng tim mạch là nguyên nhân
của các trường hợp tử vong ở 71% số bệnh nhân có β-thalassemia lớn [12].
9
Cận lâm sàng:
•Công thức máu: Hb 3-5 g/dL, MCV giảm, hồng cầu nhỏ, hồng cầu hình
bia, nhược sắc.
•Hồng cầu non tăng.
•Fe huyết thanh, ferritin tăng.
•X-quang sọ: tủy rộng, hình bàn chải.
•Điện di Hb: HbF =20÷100%, HbA= 0÷80%, HbA
2
= 2÷7%.
1.1.6.2. β-thalassemia thể trung gian (Kiểu gen β
+
/β
+
)
Bệnh nhân thalassemia trung gian biểu hiện nhẹ hơn thalassemia lớn,
mức độ truyền máu chỉ thỉnh thoảng phải truyền. Tùy theo biểu hiện lâm
sàng, bệnh nhân biểu hiện rõ ràng trong độ tuổi từ 2 đến 6 năm và có khả
năng sống mà không cần truyền máu thường xuyên, tăng trưởng và phát triển
rất chậm. Một số bệnh nhân không có triệu chứng cho đến khi trưởng thành
và chỉ thiếu máu nhẹ. Quá trình tạo hồng cầu tủy và hồng cầu ngoài tủy, cơ
chế tăng tạo hồng cầu tủy xương để khắc phục tình trạng thiếu máu mãn tính
là phổ biến. Hậu quả của nó là biến dạng đặc trưng của xương và khuôn mặt,
loãng xương, gãy xương bệnh lý của xương dài và ảnh hưởng đến lá lách,
gan, hạch bạch huyết, ngực và cột sống. Mở rộng của lá lách cũng là một hệ
quả của vai trò quan trọng của nó trong quá trình tiêu hủy hồng cầu. Quá trình
tạo máu ngoài tủy, ảnh hưởng tới chất lượng hồng cầu và kết quả làm hồng
cầu không hiệu quả và tan máu ngoại vi, bệnh nhân thalassemia trung gian có
thể có sỏi túi mật, xảy ra hơn thường hơn trong thalassemia lớn [13]. Bệnh
nhân thalassemia trung gian thường xuyên phát triển các vết loét ở chân .Mặc
dù bệnh nhân thalassemia trung gian có nguy cơ bị quá tải sắt thứ cấp để tăng
10
đường ruột hấp thụ sắt, thiểu năng sinh dục, suy giáp và bệnh tiểu đường
không phổ biến [14].
Cận lâm sàng:
Công thức máu: Hb= 7÷10 g/dL; MCV= 50÷70fl; MCH= 20÷22pg;
hồng cầu nhược sắc.
Điện di Hb: HbF=20÷80%, HbA=20÷80%;HbA
2
=2÷7%.
1.1.6.3. β-thalassemia nhẹ ( kiểu gen , β
+
/β, β
0
/β)
Mang bệnh thiếu máu nhỏ thường không có triệu chứng lâm sàng nhưng
đôi khi có thiếu máu nhẹ. Tuy nhiên khi cặp vợ và chồng đều bị β-thalassemia
thể nhẹ có xác suất 25% sinh con ra mang kiểu gen đồng hợp tử.
1.1.6.4. Thể phối hợp
β-thalassemia liên quan đến bất thường Hb khác
Sự tương tác của HbE và β-thalassemia trong kiểu hình bệnh thiếu máu
khác nhau, từ một điều kiện không thể phân biệt được mức độ thiếu máu. Tùy
thuộc vào mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng mà được chia làm ba loại:
- HbE/β-thalassemia nhẹ: Nó được quan sát trong khoảng 15% của tất cả
các trường hợp ở Đông Nam Á. Nhóm bệnh nhân này duy trì lượng Hb giữa 9
và 12 g/dL và thường không có vấn đề về ý nghĩa lâm sàng. Có thể không cần
điều trị .
- HbE/β-thalassemia vừa: Đa số các trường hợp HbE/β-thalassemia rơi
vào thể loại này. Mức độ Hb duy trì ở mức 6-7 g/dL và các triệu chứng lâm
sàng tương tự như bệnh thiếu máu trung gian. Truyền máu cần chú ý khả năng
quá tải sắt có thể xảy ra.
11
- HbE/β-thalassemia nặng: Mức độ Hb có thể thấp từ 4-5 g/dL. Bệnh
nhân trong nhóm này biểu hiện các triệu chứng tương tự như bệnh thiếu máu
nặng và đang được coi là bệnh nhân β- thalassemia thể nặng.
Bệnh nhân HbC/β-thalassemia có thể sống bình thường kèm theo các
triệu chứng thiếu máu nhẹ và được chẩn đoán trong các bài kiểm tra thường
xuyên. Biểu hiện lâm sàng là thiếu máu và mở rộng của lá lách. Truyền máu
thường ít khi được yêu cầu. Hồng cầu nhỏ và nhược sắc được tìm thấy trong
mọi trường hợp.
Sự tồn tại hemoglobin của thai nhi (HPFH) với β-thalassemia giảm nhẹ các
biểu hiện lâm sàng khác nhau từ bình thường đến bệnh thiếu máu trung gian.
Bệnh nhân có HbS/β-thalassemia có dặc điểm hồng cầu hình liềm.
Ngoài ra còn các thể phối hợp β-thalassemia với α-thalassemia, hay
HbE/β-thalassemia với α-thalassemia. Trong một nghiên cứu ở Thái Lan có
khoảng 13% trường hợp có sự tồn tại của cả hai loại đột biến gen α và β,
trong đó đột biến xóa đoạn α 3.7 là phổ biến nhất. Tùy thuộc vào loại đột biến
và tỷ lệ giữa hai chuỗi globin được tổng hợp mà đưa đến các mức độ nặng
nhẹ khác nhau. Trong trường hợp này, thấy giảm nồng độ HbF và gia tăng
nồng độ HbE, MCV và HCV giảm nhiều.
β-thalassemia nguyên nhân không do đoạn gen mã hóa chuỗi β-globin.
Ảnh hưởng của quá trình phiên mã, dịch mã tới sự hình thành chuối β-
globin dẫn đến sự thiếu hụt gây bệnh β-thalassemia.
1.1.7. Cơ chế di truyền
β-thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do đột
biến gen β-globin nằm trên cánh ngắn NST 11 quy định (11p15.5) gây giảm
12
hoặc mất khả năng tổng hợp β-globin. β thalassemia có tần số và khả năng
mắc bệnh là giống nhau ở cả 2 giới nam và nữ.
Dưới đây là ví dụ minh họa cho cơ chế di truyền trên NST thường với cả
bố và mẹ mang gen dị hợp tử với một gen đột biến gây nên. Nguy cơ trong
một lần sinh như sau:
50% số con là người lành mang gen bệnh.
25% số con là hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh.
25% số con mắc bệnh β thalassemia thể nặng.
Hình 1.4 Cơ chế di truyền trên nhiễm sắc thể thường
(thefullwiki.org/Thalassemia).
1.1.8. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia
Các trường hợp β-thalassemia có nguyên nhân do đột biến điểm trên gen
HBB. Các đột biến này gây ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp β globin, làm
mất hoặc giảm khả năng tổng hợp.
Hiện nay có trên 200 loại đột biến gen HBB gây bệnh β-thalassemia
được xác định trên thế giới [15], trong đó phổ biến nhất là 5 loại đột biến:
codon41/42(-TTCT), codon17(A>T), -28(A>G), IVS II-654(C>T) và IVS I-
13
5(G>C), chiếm 80% trong tổng số các đột biến được phát hiện. Ở Việt Nam,
theo nghiên cứu của M.L. Saovaros Svasti cho thấy có 8 đột biến thường gặp
và chiếm khoảng 95% các trường hợp β thalassemia bao gồm:
Cd17(AAG>TAG), Cd41/42(-TCTT), -28(A>G), Cd71/72(+A), IVS1-
1(G>T), IVS1-5(G>C),IVS2-654(C>T), Cd26(GAG>AAG). Ngoài ra β-
thalassemia thường kết hợp với bệnh huyết sắc tố E (HbE) gây nên thể
thalassemia đặc biệt.
Bảng 1.1 Một số kiểu đột biến gây β
0
,β
+
thalassemia và các biến thể Hb.
Đột biến β
0
Codon5(-CT) Codon26(G>T) Codon51(-C) IVS1-1(G-A)
Codon 6(-A) Codon 27/28(+C) Codon 67(-TG) IVS1-1(G-T)
Codon 8(-AA) Codon30(AGG>ACG) Codon71/72(+A) IVS1-2(T>A)
Codon8/9(+G) Codon 36/37(-T) Codon 95(+A) IVS1-2(T>C)
Codon14/15(+G) Codon 37(GG>GA) Codon106/107(+G) IVS2-1(G>A)
Codon15(GG-GA) Codon39(C-T) Codon121(G>T) IVS2-1(G>A)
Codon15(GG>AG) Codon41/42(-CTTT) Codon11(-T) IVS2-849(A>G)
Codon16(-C) Codon43(G>T) Codon15(-T) IVS2-850(G>T)
Codon17(A>T) Codon44(-C) Initiation codon (T>G)
Đột biến β
+
-90(C>T) -28(A>C) IVS1-5(G>C) IVS2-654(C>T)
-88(C>T) -28(A>G) IVS1-5(G>A) IVS2-745(C>G)
-87(C>G) Codon 24(T>A) IVS1-6(T>C) Poly A(T>C)
-30(T>A) Codon27(G>T) IVS1-110(G>A) Poly A(A>G)
-29(A>G) Codon29(C>T) IVS2-848(C>A)
Đột biến phối hợp với Hemoglobin
HbS
Codon6 (T>A)
HbC
Codon6 (G>A)
HbE
Codon26 (G>A)
HbD
Codon121(G>C)
Tùy theo loại đột biến và mức độ đột biến giảm hay mất khả năng tổng
hợp β-globin mà có thể đưa đến các thể bệnh khác nhau.
Các đột biến ở vùng khởi đầu làm giảm tốc độ sao chép làm giảm khả
năng tổng hợp β-globin gây β
+
thalassemia. Ví dụ (ATG > ACC, ATG >
14
AGG, ATG>ATA, ATG>ATC, ATG>GTG) là 5 kiểu đột biến thường gặp
thay thế một base ATG.
Đột biến ở một số bộ ba mã hóa tạo thành mã kết thúc do đó không tạo
được mARN hòan chỉnh nên không tổng hợp được chuỗi globin gây ra bệnh
β
0
thalassemia ví dụ Codon17 (AAG>TAG) tạo thành bộ mã kết thúc.
Các đột biến ở đoạn đầu hay đoạn cuối đoạn gen làm rối loạn quá trình
tổng hợp chuỗi β
globin gây ra bệnh β
+
thalassemia.
Các đột biến vùng intron làm chậm quá trình phiên mã mARN gây β
+
thalassemia. Kiểu đột biến này được xếp vào nhóm β
+
thalassemia nhưng có
triệu chứng giống với β
0
thalassemia.
1.2. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột
biến gen.
1.2.1. Phản ứng PCR.
Được Kary Mullis phát minh năm 1983, đến nay được áp dụng rộng rãi
trong việc phân tích bộ gen sinh vật. PCR như một “máy photocopy”, sử dụng
trong một số thành phần cơ bản mà chúng ta sử dụng hàng ngày trong phòng
thí nghiệm để thu được lượng lớn các bản sao chép của một đoạn DNA trong
ống nghiệm.
Nguyên tắc phản ứng PCR: là một phản ứng sinh hóa được điều khiển
bởi nhiệt độ, sử dụng đặc điểm quá trình sao chép DNA với sự tham gia của
enzym chịu nhiệt DNA polymerase, đoạn DNA chứa đoạn gen cần khuếch đại
và các thành phần tạo chuỗi DNA. Phản ứng PCR dựa trên những chu trình
nhiệt, mỗi chu trình có 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và
giai đoạn kéo dài.
15
Hình 1.5. Các giai đoạn trong phản ứng PCR (Molecularstation)
Giai đoạn 1 (biến tính) chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính tách
nhau ra thành 2 chuỗi đơn. Nhiệt độ biến tính trên 90
0
C (92-95
0
C).
Giai đoạn 2 (gắn mồi): nhiệt độ được hạ xuống 40-62
0
C để cho phép các
đoạn oligonnucletid gắn với sợi DNA khuôn. Trong quá trình gắn mồi, DNA
polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.
Giai đoạn 3 (kéo dài) nhiệt độ được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của
enzyme xúc tác cho quá trình kéo dài từ 68-72
0
C.
Tùy thuộc vào lượng sản phẩm cần mà sử dụng số chu trình thích hợp
(từ 25 đến 45 chu trình) [16].
1.2.2. Giải trình tự gen trực tiếp (derect sequencing)
Khi sản phẩm PCR được đưa vào tách dòng thì có thể tiến hành giải
trình tự gen một cách dễ dàng. Tuy nhiên trong trường hợp nhiều sản phẩm PCR
16
