Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetate lá đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

TRẦN NGUYỄN XUÂN TRINH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng- Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện
Lớp
Giáo viên hướng dẫn

: Trần Nguyễn Xuân Trinh
: 14CHD
: GS.TS Đào Hùng Cƣờng

Đà Nẵng-Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành đến thầy GS.TS.Đào Hùng Cƣờng đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ
trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy cô
giảng dạy cô và công tác tại phòng thí nghiệm Khoa Hóa - Đại học Sư phạm Đà Nẵng
và Nhà trường đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp cho em
hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin phép được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian
quý báu để nhận xét, tham gia và đánh giá khóa luận này.

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Trần Nguyễn Xuân Trinh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ ............................................................................. 4
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƢỚC ............................................................................................................. 5

1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI
NƢỚC ............................................................................................................................. 5
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ ... 8
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO . 13
1.5.1. Phương pháp MTT ...........................................................................................................13
1.5.2. Phương pháp SRB ............................................................................................................14
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................ 15
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................15
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ....................................................................................15
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 16
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lí .....................................................................................16
2.2.1.1. Độ ẩm ....................................................................................................... 16
2.2.1.2. Hàm lượng tro .......................................................................................... 16
2.2.1.3. Xác định hàm lượng kim loại ................................................................... 17
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá
Đu đủ đực .......................................................................................................................................17
2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật ............................................................. 17
2.2.2.2. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất .................... 18
2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực .........................................................18
2.2.3.1. Alcaloid .................................................................................................... 18
2.2.3.2. Flavonoid ................................................................................................. 19
2.2.3.3. Coumarin ................................................................................................ 19
2.2.3.4. Saponin .................................................................................................... 20
2.2.3.5. Đường khử ............................................................................................... 20
2.2.3.6. Polyphenol ............................................................................................... 21
2.2.3.7. Steroid ...................................................................................................... 21
2.2.3.8. Axit hữu cơ ............................................................................................... 21
2.2.3.9. Chất béo ................................................................................................... 22
2.2.3.10. Carotene ................................................................................................. 22

2.2.3.11. Polysaccarid .......................................................................................... 22
2.2.3.12. Iridoid .................................................................................................... 23
2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết .........................................................................................23
2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết ethyl acetace ...............................................24
2.2.5.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức
chế tế bào ung thư ................................................................................................. 24
2.2.5.2. Các dòng tế bào ....................................................................................... 25
2.2.5.3. Phương pháp ............................................................................................ 25
2.2.5.4. Thử độc tế bào ......................................................................................... 25
2.2.6. Định danh sơ bộ một số hợp chất có trong cao chiết ethyl acetate .....................26
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 27
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ........ 27

3.1.1. Độ ẩm ..................................................................................................................................27
3.1.2. Hàm lượng tro ...................................................................................................................27
3.1.3. Hàm lượng một số kim loại ...........................................................................................28
3.2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP
CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI ETHYL ACETATE 29
3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm ..................29
3.2.1.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate ........ 29
3.2.1.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi ethyl acetate ........ 30

3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi ethyl acetate. ............32
3.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm .........................33
3.2.3.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate .. 33
3.2.3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate ... 35
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC .......... 36
3.4. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT ................................................................. 38

3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT ETHYL
ACETATE TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ............................................................................... 38
3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC-MS ............. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 43
1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 43
2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 43
O........................................................................................... 44



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S

:

Singlet (NMR)

ppm

:

Parts per million

δ

:

Độ chuyển dịch hóa học (NMR)

BuOH

:

Butanol

CHCl3

:

Chloroform

EtOAc

:

Etylacetate

EtOH

:

Ethanol

GC-MS :

Gas chromatography-Mass spectrometry

MeOH

:

Methanol

Me

:

Methyl

NMR

:

Nuclear magnetic resonance

SRB

:

Sulforhodamine B


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
bảng
1.1

1.2

Tên bảng

Trang

Thành phần hóa học cây Đu đủ

8

Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung
thư khác nhau trong điều kiện in vitro

10

1.3

Hoạt tính chống ung thư của glucosinolate, phenolic,
flavonoid, carotenoid và alcaloid trong Đu đủ

11

3.1

Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu lá Đu đủ đực

27

3.2

Kết quả hàm lượng tro của nguyên liệu lá Đu đủ đực

28

3.3

Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ
đực

28

3.4

Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi
etylacetat

29

3.5

Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung
môi ethyl acetate

31

3.6
3.7
3.8

Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet tối ưu bằng dung
môi ethyl acetate
Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm tối ưu bằng dung

môi ethyl acetate
Kết quả khảo sát nhiệt độ siêu âm tối ưu bằng dung môi
ethyl acetate

32
34
35

3.9

Định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực

36

3.10

Khối lượng cao chiết từng phân đoạn

38

3.11

Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết ethyl acetate

39

3.12

Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate trong lá
Đu đủ đực

40


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu
hình

Tên hình

1.1

Trang
5

1.2

Công thiức cấu tạo cảu hợp chất trong cây Đu đủ

7

2.1

Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực

15

2.2

Sơ đồ điều chế các cao chiết

24

3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6

Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời
gian chiết ngâm dầm
Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo tỉ lệ
Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm
Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo
thời gian chiết Soxhlet
Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời
gian chiết siêu âm
Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo
nhiệt độ chiết siêu âm
Sắc ký đồ GC-MS của dịch ethyl acetate lá Đu đủ đực

30
31
33
34
36
40

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người
đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong
những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm
có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất
thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng
nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới. Sản lượng
Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [11].
Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam.
Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng
khoảng 200-350 nghìn tấn quả [11]. Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả
sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục
đích chữa bệnh khác nhau.
Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng
viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh
học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh
[29, 30]. Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi
khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [1, 16]. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng
kháng viêm, giảm đau [21, 47].
Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư. Ở nước ta,
cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực
nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế
bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7]. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên
cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế
một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,...
Chính bởi công dụng chữa bệnh củ
ều đề tài nghiên

cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học củ
chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ cái. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về lá
của cây Đu đủ đực.
Đối với việc sử dụng cây Đu đủ hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệ
ọ
ứng minh. Vì


2
vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần
hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học
cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn
bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên
cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl
acetate cây Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
chiết ethyl acetate lá Đu đủ đực (Carica papaya L.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Lá Đu đủ

ảng Nam-Đà Nẵng.

dung môi ethyl acetate. Từ dịch chiết
này, tiến hành định danh các hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết ethyl acetate trên 3 dòng tế
bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1.
- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên.

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế
giới về loài cây này.
- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng
dụng của các bộ phận của cây Đu đủ.
4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;
- Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu
âm;
- Các phương pháp định danh thành phần hóa học;
-

gây độc tế bào;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học.


3
5. Bố cục của luận văn
Khóa luận gồm 46 trang, 15 bảng, 10 hình ảnh, 36 tài liệu tham khảo. Với:
Phần mở đầu ( 3 trang)
Chương 1- Tổng quan ( 11 trang)
Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm ( 12 trang)
Chương 3 – Kết quả và thảo luận ( 13 trang)
Kết luận và kiến nghị ( 1 trang)
Tài liệu tham khảo (1 trang)


4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu Mỹ
được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45
loài [28]. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi và một
loài [1].
Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4
mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất
dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy
nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn được gọi Thù
đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung
(Lào), Má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành
3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây Đu đủ
cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn
đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1).
Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi
nhiệt độ [8]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm:
- Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung
của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài,
mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp.
- Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc.
Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày
trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá
dày.
- Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây
thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây.
Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận
chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11].

A: hoa cái

B: hoa lưỡng tính

C: hoa đực


5

D: trái của cây cái

E: trái lưỡng tính

F: cây đực

Đu
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƢỚC
Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được
alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [12].
Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích
các chất carotenoid trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ
tương ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không
xác định được lycopene [8].
Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ phân
đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong đó, sterculin A
và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ
[5].
Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ
nhựa quả Đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [9].
bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexanee, CH2Cl2, EtOAc, buthanol).
Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic,
ap

1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI
NƢỚC

[30].


6
Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập được 2 alcaloid piperideine là
dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31].

[29].
t như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid
protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [18].

[25]: carotene, palmatic, stearic, lioleic,
linolenic, benzylisothiocyanate, β-sitost
alcaloid
carpaine, pseudocarpain, glucose, fructose, xylitol, enzym proteolytic, papain,
chemopapain, glutamine cyclotransferase, chymopapain A,
lysozyme.
Năm 2012, Adlin Afzan và cộng sự đã xác định được 12 hợp chất có trong lá Đu
đủ [16] bao gồm alcaloid piperideine là carpaine; acid hữu cơ: acid malic, acid quinic;
dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl
malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2); flavonol
glycoside:
quercetin-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl)
glucopyranoside
(manghaslin), kaempferol-3-O- (2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranoside
(clitorin), quercetin-3-O-rutinoside (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin).
Năm 2013, Ikeyi Adachukwu và cộng sự đã phân tích thành phần hóa học trong

lá Đu đủ. Kết quả cho thấy có sự xuất hiện của các hợp chất alcaloid, flavonoid,
saponin, tannin và glycoside bằng các thuốc thử đặc trưng [15].
Năm 2015,
Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0.07%), alkaloid (0.05%),
tannin (0.002%) và flavonoid (2.8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca,
Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [19].
Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa
học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS
bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và hexadecanoic
acid, methyl ester (18,25%) [20].
Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong cây Đu đủ:


7

β-sitosterol

Daucosterol

Sterculin A

Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Carpaine

Pseudocarpaine

Dehydrocarpaine I

Dehydrocarpaine II

. Công thức cấu tạo các hợp chất trong cây Đu đủ


8
Bảng 1.1. Thành phần hóa học cây Đu đủ

Nhóm chất

Thành phần hóa học

Phenolic,

5,7-dimetthoxy coumarin, Axit Protocatechui, Axit ρ-coumaric, Axit

Flavonoid

Caffeic, Kaempferol, Quercetin
Choline

Alcaloid
Glycoside

Prunasin, Sambunigrin

Sterol

β-sitosterol, Daucosterol

Triterpene

Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Acid hữu cơ

Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl malate, ρcoumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2),
feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2)

Như vậy, thành phần hóa học các bộ phận của cây Đu đủ cái đã được nghiên
cứu. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá, quả và các bộ phận khác như rễ, thân,
hạt,… cây Đu đủ cái. Tuy nhiên nghiên cứu về các bộ phận như hoa và lá cây Đu đủ
đực lại rất ít.
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vật được
các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [3, 39, 49]. Hoạt tính sinh học các bộ phận của cây
Đu đủ như lá, quả được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá
phong phú.


có
tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và
Staphylococcus aureus [1].
Năm 2012, Moses Alo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng nước
lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17].
Năm 2015, K. Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của lá
Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm. Kết quả cho


9
thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dương: Staphylococcus

aureus và Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm: Escherichia coli,
Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Vibro chloreae
[26].
Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết các bộ phận cây Đu đủ cái
có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm của cây Đu đủ đực.

.ết với cồn
từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma
TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự
tăng sinh khối u [7].
Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng
gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc
các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư
máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng
thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [10].

= 2,8 μg/mL. Đồng thời nghiên cứu này đã
chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của
50

các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D. Mức độ biểu
hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63%. Các kết quả
này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [36].
ịnh được phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 của lá Đu
đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư
phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50
ợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ phân đoạn CH2Cl2 của lá Đu
đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào
ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư

vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [6].
Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng Đu đủ để ức chế, tiêu diệt tế
bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2:


10
Bảng 1.2. Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung thƣ khác
nhau trong điều kiện in vitro
Dòng tế bào ung thƣ
Tế bào ung thư vú T47D

Phƣơng pháp
xử lý

Kết quả

Phân
mảnh - Các phân mảnh protein gây độc
protein RIPS tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL)
phân lập từ lá
- Kích thích quá trình tự chết với
biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và
BCl-2 (giảm 63%)

- Tế bào ung thư dạ dày
- Ung thư tuyến tụy
- Ung thư buồng trứng

Dịch
chiết

nước của lá Đu
đủ
(1,25-27
mg/mL)

Tác dụng chống ung thư, nồng độ
tác dụng phụ thuộc vào từng dòng
tế bào ung thư và ngăn chặn sự
tổng hợp AND

- Tế bào lymphoma
- Ung thư vú MCF-7
- Ung thư tử cung
- Tế bào T
- Tế bào lymphoma
- Bệnh bạch cầu mãn tính
- Ung thư gan Hep G2
- Ung thư phổi PC 14
- Ung thư tuyến tụy

Dịch
chiết Ức chế sự tăng sinh của các dòng
nước của lá Đu tế bào khối u rắn và tế bào tạo máu
đủ (0,625-20 Dịch chiết nước lá Đu đủ làm giảm
mg/mL)
cytokine IL-2 và IL-4, trong khi đó
lại làm tăng cytokine Th1 như là
IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và
TNF-α

- Ung thư biểu mô H2452
- Ung thư vú MCF-7
- Ung thư phổi LU-1
- Ung thư vú MCF-7
- Ung thư biểu mô KB

Phân
đoạn
dichloromethan
từ dịch chiết
methanol lá Đu
đủ

Ức chế đáng kể sự phát triển của tế
bào ung thư phổi (IC50 tương ứng
18,21 µg/mL), tế bào ung thư vú
(IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và
tế bào ung thư biểu mô (IC50 tương
ứng 18,44 µg/mL)


11
- Ung thư biểu mô KB

Chất tinh khiết Carpaine và Pseudocarpaine ức

- Ung thư máu HL-60

Carpaine
và chế đáng kể sự phát triển của tế

Pseudocarpaine bào ung thư biểu mô (IC50 lần lượt
phân lập từ lá tương ứng 1,13 và 1,66 µg/mL), tế

- Ung thư phổi LU-1
- Ung thư vú MCF-7

Đu đủ

bào ung thư máu (IC50 lần lượt
tương ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế
bào ung thư phổi (IC50 lần lượt
tương ứng 1,29 và 2,17 µg/mL) và
tế bào ung thư vú (IC50 lần lượt
tương ứng 1,34 và 2,43 µg/mL)

Tóm tắt các kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, cơ chế tác
dụng của các nhóm chất glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alcaloid đã
được tìm thấy trong các phần khác nhau của cây Đu đủ được thể hiện ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Hoạt tính chống ung thƣ của phenolic, flavonoid và alcaloid trong Đu
đủ
Các hợp chất đã đƣợc chiết tách

Hoạt tính chống ung thƣ của các hợp
chất tinh khiết

Nhóm chất: Phenolic, Flavonoid
- Ức chế sự tăng sinh tế bào
- Cảm ứng biểu hiện gen ức chế khối u
5,7-dimetthoxy coumarin: 0,14 mg/g

- Tăng cường chức năng miễn dịch

Acid Protocatechui: 0,11 mg/g
Acid ρ-coumaric: 0,33 mg/g

- Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu
kỳ phân bào

Acid Caffeic: 0,25 mg/g

- Ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn

Kaempferol: 0,03 mg/g

- Cảm ứng quá trình tự chết

Quercetin: 0,04 mg/g

- Ức chế sự truyền tín hiệu
- Ngăn chặn sự hình thành mạch máu
trong khối u.


12

Nhóm chất: Alcaloid
Nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế
các tế bào ung thư:
Carpaine

- Ung thư biểu mô KB

Pseudocarpaine

- Ung thư máu HL-60
- Ung thư phổi LU-1
- Ung thư vú MCF-7

Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây Đu đủ cái có nhiều
hợp chất có hoạt tính chống ung thư.



các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non. Hai
tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β-carotene. Kết quả cho thấy hoạt tính
chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt. Tuy
nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [14].
Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định các bộ phận cây Đu đủ cái có hoạt
tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô,
nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Đu
đủ cái còn rất hạn chế. Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của cây Đu đủ
đực.



Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch
chiết cồn từ lá cây Đu đủ [33]. Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết


13

lá Đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở
chuột.

ca
RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30
µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở
nồng độ thử 20 µg/mL) [6].
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng
sự [29]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia
(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc,
phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều
kiện in vitro.
trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro,
,
phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến.
1.5.1. Phƣơng pháp MTT
Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [11]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để
triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của
tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế
bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi
thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao.
Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt
động của tế bào.

Tetrazolium (màu vàng)

Formaran (màu tím)

14
1.5.2. Phƣơng pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh
giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng
sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của
SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào
không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH
của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ,
SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố
định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và
đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.


15
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam – Đà Nẵng. Lá
Đu đủ đực, sau khi được thu hái sẽ đem rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột
để sử dụng cho nghiên cứu.
Cây Đu đủ đực được chọn lấy cao khoảng 1,5m -10m có nhiều lá và hoa. Lá to
hình chân vịt, mọc so le, cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8 -9 thùy sâu, mỗi thùy lại
bị khía thêm nữa như bị xẻ rách. Lá Đu đủ đực được lựa chọn phải có màu xanh mướt,
không non không già. Sau khi hái đem vào bỏ cuống, rửa sạch rồi thái nhỏ khoảng 1 -2
cm, vẩy cho ráo nước. Đem ra chỗ nắng to, phơi thật khô rồi đem nghiền nhỏ thành
bột.
Bột lá Đu đủ đục hơi thô, màu xanh, được bảo quản trong tủ lạnh khi chưa dùng
đến.

Hình 2.1. Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết ethyl acetate.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không,
máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, binh tam giác, các loại
pipet, bình định mức, giấy lọc,…


16
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lí
2.2.1.1. Độ ẩm
- Tiến hành :
Chuẩn bị các cốc sứ được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong
tủ sấy đến khối lương không đổi m0. Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt
nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ.
Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu nguyên liệu lá đu đủ đực, cân lấy khối lượng
chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ
100°C. Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân
đến khối lượng mẫu không đổi m2.
- Cách tính độ ẩm:
Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau
khi cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Độ ẩm được tính theo công thức sau :

%
Trong đó:

m1 m2
.100
m1

m1: khối lượng mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực khô (g).
m2: mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi sấy (g)
W : độ ẩm của mẫu(%).
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.

Kết quả khảo sát độ ẩm của lá đu đủ đực được trình bày qua bảng 3.1.
2.2.1.2. Hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu
thử trong điều kiện nhất định.
- Tiến hành:
Cân 5 mẫu lá đu đủ đực sấy khô với khối lượng m1 đem than hóa sơ bộ trên bếp
điện rồi cho vào lò nung ở 500-550ºC trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho đến khi thu
được tro trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu