Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo haematococcus pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN PHƯỚC KHA

NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VI TẢO
HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS VÀ CẢM ỨNG
TỔNG HỢP ASTAXANTHIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN PHƯỚC KHA

NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VI TẢO
HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS VÀ CẢM ỨNG
TỔNG HỢP ASTAXANTHIN

Ngành: Quản lý Tài nguyên và Môi trường
Cán bộ hướng dẫn: TS. TRỊNH ĐĂNG MẬU

Đà Nẵng – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đề tài “Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo Haematococcus
pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin” là kết quả công trình nghiên cứu riêng
của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú
nguồn gốc.
Tác giả khóa luận

Nguyễn Phước Kha


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu khoa học tự lực đầu tiên mà
tôi đã hoàn thành trong sự nghiệp học và làm khoa học của tôi. Tuy nhiên, sự quan tâm,
tin tưởng, giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè chính là những yếu tố quan trọng tạo
nên sự hoàn thiện của khóa luận.
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin được chân thành cảm ơn đến những
người luôn đồng hành cùng tôi vừa qua:
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Trịnh Đăng Mậu – người đã định hướng,
động viên, đưa tôi đến gần với nghiên cứu khoa học và đã tận tình chỉ dạy cho tôi
những kiến thức bổ ích trong cả học tập và cuộc sống trong suốt thời gian chuẩn bị và
thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Nguyễn Thị Trang – đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ
tôi trong quá trình làm đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn trong tập thể lớp 14CTM đã nhiệt
tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn trong tập thể nhóm nghiên cứu khoa
học Plankton’s Lab đã hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Sinh – Môi trường đã

trang bị cho tôi kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm cho tôi
thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, Ngày 23 tháng 4 năm 2018

Sinh viên: Nguyễn Phước Kha


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...........................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................1
2.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 2
2.2 Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................ 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................3
1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Haematococcus pluvialis ............................................3
1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố của Haematococcus pluvialis .............................. 3
1.1.2 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái ........................................................3
1.1.3 Thành phần sinh hóa học của tảo H.pluvialis ..................................................5
1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của H.pluvialis ...............6
1.3 Giới thiệu chung về astaxanthin .............................................................................6
1.3.1 Đặc điểm chung ............................................................................................... 6
1.3.2 Cấu trúc astaxanthin ........................................................................................7
1.3.3 Các nguồn cung cấp astaxanthin......................................................................8
1.3.3.1 Nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học ...........................................................8

1.3.3.2 Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên ..........................................................8
1.3.4 Đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin .......................................................10
1.4 Các yếu tố môi trường khác nhau ảnh hưởng đến tích lũy astaxanthin ở vi tảo
H.pluvialis ..................................................................................................................10
1.5 Tình hình nghiên cứu về vi tảo H.pluvialis tổng hợp astaxanthin trên thế giới và
Việt Nam ....................................................................................................................11
1.5.1 Trên thế giới ...................................................................................................11


1.5.2 Ở Việt Nam ....................................................................................................13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................................................14
2.1 Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................14
2.3 Phạm vi và thời gian nghiên cứu ..........................................................................14
2.3.1 Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................14
2.3.2 Thời gian nghiên cứu .....................................................................................14
2.4 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................14
2.4.1 Phương pháp làm sạch và lưu giữ giống .......................................................14
2.4.2 Phương pháp xác định sinh trưởng qua MĐTB.............................................14
2.4.3 Phương pháp phân tích số liệu .......................................................................15
2.5 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................15
2.5.1 Khảo sát môi trường tối ưu ............................................................................15
2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển
của vi tảo H.pluvialis .............................................................................................. 16
2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng cao và sốc muối trong môi
trường nuôi cấy đến sự tích lũy astaxanthin của vi tảo H.pluvialis ........................17
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................18
3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sinh trưởng của vi tảo Haematococcus
pluvialis ......................................................................................................................18

3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo
Haematococcus pluvialis ...........................................................................................19
3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ ssodium nitrate lên sự sinh trưởng của H.pluvialis 19
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dikali phosphate lên sự sinh trưởng của H.pluvialis
................................................................................................................................ 23
3.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng cao và sốc muối trong môi trường nuôi cấy
đến sự tích lũy astaxanthin của vi tảo Haematococcus pluvialis ............................... 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................................28
1. KẾT LUẬN ............................................................................................................28


2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................................30
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Số hiệu bảng

Tên

Trang

1.1

Thành phần dinh dưỡng của tảo H.pluvialis ở 2 giai đoạn
sinh trưởng khác nhau

6

1.2

Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau

11

2.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ sodium
nitrate lên sự sinh trưởng của H. pluvialis

16

2.2

Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ
dipotassium phosphate lên sự sinh trưởng của H. pluvialis

17

2.3

Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng tích lũy astaxanthin

27

3.1

Tốc độ sinh trưởng đạt đỉnh của hai môi trường RM và
BBM ở các nồng độ sodium nitrate khác nhau

22

3.2

Tốc độ sinh trưởng đạt đỉnh của hai môi trường RM và
BBM ở các nồng độ dipotassium phosphate khác nhau

26


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu
hình vẽ
1.1
1.2

Tên
Hình dạng tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis
Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trong vòng
đời của vi tảo H.pluvialis

Trang
4
5

1.3

Cấu trúc của astaxanthin

8

1.4

Phản ứng tổng hợp astaxanthin

8

3.1

Mật độ tế bào trên hai môi trường BBM và RM

18

3.2

Tốc độ sinh trưởng của tảo trên hai môi trường BBM và RM

18

3.3

Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường RM ở các nồng độ
NaNO3

20

3.4

Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi

trường RM có nồng độ sodium nitrate khác nhau

20

3.5

Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường BBM ở các nồng độ
NaNO3

21

3.6

Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi
trường BBM có nồng độ sodium nitrate khác nhau

21

3.7

Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường RM ở các nồng độ
K2HPO4

23

3.8

Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi
trường RM có nồng độ dipotassium phosphate khác nhau

24

3.9

Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường BBM ở các nồng độ
K2HPO4

25

3.10

Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi
trường BBM có nồng độ dipotassium phosphate khác nhau

25

3.11

Phần trăm tế bào tích lũy astaxanthin

26

3.12

Tế bào H.pluvialis tích lũy astaxanthin

26


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Astaxanthin (3, 3’- dihydroxy ß, ß’ carotene - 4,4 - dione) là một sắc tố
carotenoid, được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như các hồi, cá vền, tôm, cua, trứng
cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loài chim [16]. Hoạt tính chống oxy hóa
của chúng cao hơn gấp 10 lần so với các loại carotenoit khác như ß-carotene,
zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và cao hơn gấp 500 lần so với α-tocopherol [38].
Bên cạnh đó, do khả năng ngăn chặn một số loại ung thư, kích thích hệ thống miễn
dịch cao hơn so với ß-carotene và α-tocopherol nên hiện nay, ứng dụng của
astaxanthin còn được mở rộng trong lĩnh vực y dược học [28, 32, 38]. Astaxanthin có
giá trị kinh tế cao được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm, thực phẩm
chức năng và nuôi trồng thủy sản.
Astaxanthin được ứng dụng phổ biến làm thức ăn cho các loài thủy sản như trong
nuôi cá hồi, màu sắc của thịt cá là một tham số chất lượng quan trọng đối với sự lựa
chọn của người tiêu dùng [13, 14]. Màu sắc của cá được tạo bởi sự lắng đọng của các
carotenoid (như astaxanthin và canthaxanthin) trong thịt cá. Nhưng cá hồi không tự
tổng hợp được astaxanthin mà phải được cung cấp từ nguồn thức ăn. Vì vậy, sự hấp
thụ astaxanthin của cá hoàn toàn phụ thuộc vào hàm lượng của chất này có trong
nguồn thức ăn cũng như thời gian cho cá ăn thức ăn có bổ sung thêm astaxanthin [41].
Astaxanthin được bổ sung vào khẩu phần ăn để nhằm tạo màu sắc cho thịt nhằm tăng
chất lượng sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế. Ngoài ra, astaxanthin không những có
vai trò tạo màu hồng đỏ cho thịt cá mà còn có hoạt tính chống oxy hóa và là tiền
vitamin A.
Trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu sử dụng astaxanthin trên thế giới ngày càng
cao nhưng nguồn cung cấp astaxanthin chủ yếu là từ tổng hợp hóa học (chiếm 95%),
nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, nhưng chỉ có 25% astaxanthin được tổng
hợp có hoạt tính và hữu dụng. Do đó, viêc sản xuất astaxanthin từ nguồn tự nhiên vi
tảo Haematococcus pluvialis (H.pluvialis) đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu
của các nhà nghiên cứu và sản xuất ứng dụng vì vi tảo H.pluvialis có khả năng tích lũy

astaxanthin lên tới trên 5-6% trọng lượng khô [4, 6]. Bên cạnh đó, 100% astaxanthin
được chiết xuất từ H.pluvialis có dạng đồng phân 3S-3’S đây là dạng đồng phân có
hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [32].


2

Tuy nhiên, việc sản xuất astaxanthin hiệu quả từ loài vi tảo này còn gặp nhiều
khó khăn bởi vì chúng có tốc độ sinh truởng thấp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều
kiện nuôi cấy. Hầu hết tế bào vi tảo đều duy trì ở trạng thái sinh duỡng, tích lũy rất ít
hoặc không tích lũy astaxanthin khi nuôi ở điều kiện thích hợp. Nhưng dưới điều kiện
stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang không chuyển động và khi được kích thích
phù hợp tế bào tảo có thể tích lũy một luợng lớn astaxanthin. Vì vậy, điều kiện cho tế
bào sinh truởng và tổng hợp astaxanthin là rất khác nhau. Việc xác định rõ ràng yếu tố
dinh dưỡng, môi trường nhân sinh khối vi tảo H. pluvialis và các điều kiện cảm ứng
astaxanthin ở H. pluvialis là cần thiết để đạt được mật độ tế bào cao và giàu hàm lượng
astaxanthin. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu nhân sinh
khối vi tảo Haematococcus pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin”
2. Mục tiêu đề tài
2.1 Mục tiêu tổng quát
Tìm ra được điều kiện nuôi cho hiệu quả sinh trưởng của vi tảo tốt nhất và điều
kiện kích thích phù hợp để tảo tích lũy một hàm lượng lớn astaxanthin.
2.2 Mục tiêu cụ thể
- Xác định các yếu tố dinh dưỡng và môi trường nuôi tối ưu cho nhân sinh khối
vi tảo Haematococcus pluvialis;
- Xác định được điều kiện cảm ứng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo Haematococcus
pluvialis.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về sự ảnh

hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường tối ưu cho sinh trưởng và phát triển vi
tảo Haematococcus pluvialis và các điều kiện cảm ứng tổng hợp astaxanthin.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài làm cơ sở nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thủy hải sản chất
lượng cao với việc bổ sung astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Haematococcus pluvialis
Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào,
sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi có thể di chuyển được [8]. Đây là một loài tảo có
tiềm năng rất lớn vì khả năng tổng hợp astaxanthin của nó. Lượng astaxanthin tối đa
mà loài tảo này có thể đạt được lên tới 4-6% TLK [4, 6].
1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố của Haematococcus pluvialis
Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau [37]:
- Giới: Eukaryota
- Ngành: Chlorophyta
- Lớp: Chlorophyceae
- Bộ: Volvocales
- Họ: Chlamydomonadales
- Chi: Haematococcus
- Loài: Haematococcus pluvialis
Tảo H. pluvialis được phân bố rộng rãi trong nhiều môi trường sống trên toàn thế
giới. Tảo này được tìm thấy ở các vùng ôn đới trên thế giới và đã được phân lập từ
châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Himachal Pradeslv Ấn Độ [36]. Nhiều công trình công
bố đã cho thấy tảo này có thể sinh sống trong những điều kiện môi trường và khí hậu
đa dạng như vùng nước lợ trên những tảng đá trên bờ biển [5]; lưu vực nước ngọt
trong đá dày, tuyết tan chảy trên đảo Blomstrandhalvoya; Na Uy [23]; đài phun nước

khô gần Rozhen, Blagoevgrad ở Blugaria [12]. Với khả năng chống chịu tốt ở các điều
kiện bất lợi, thích nghi được với điều kiện môi trường thay đổi đột ngột bằng cách
hình thành màng dày bao bọc xung quanh tế bào (tế bào dạng cyst) và có khả năng nảy
mầm trở lại khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi [33].
1.1.2 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái
Tảo đơn bào nước ngọt H. pluvialis thuộc nhóm tảo lục hai roi và có khả năng
chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng [11]. Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi. Hình
thái tế bào của H.pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng.
Tế bào có 2 dạng, tương ứng với đặc điểm sinh trưởng: Tế bào sinh dưỡng và nang
bào tử (cyst). Trong đó:


4

Hình 1.1 Hình dạng tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis [26]
A. Tế bào H.pluvialis ở dạng dinh dưỡng,
B. Tế bào H.pluvialis ở dạng nang bào tử (cyst)
- TB sinh dưỡng: màu xanh, dạng hình cầu hoặc elip với đường kính khoảng 10 20µm, có thể chuyển động nhờ 2 roi. Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn tế bào ở dạng
sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a,b và tiền carotenoid, đặc biệt là β-carotene và
lutein cao [42]. Sinh trường quang tự dưỡng khi có ánh sáng [4] và dị dưỡng trong tối
[11].
- Nang bào tử (cyst): Khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cường độ
ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối,…) TB sẽ cảm ứng hình thành nang bào tử và
hình thái thay đổi sang dạng cyst. Tế bào dạng này hình cầu, mất roi, không còn khả
năng di động. Đường kính tăng lên đột ngột tới 40-50 µm [28]. Ngoài ra, những tế bào
nang này có hàm lượng carotenoid thứ cấp như echinenone, canthanxanthin và
astaxanthin tăng trong khi có hàm lượng chlorophyll và tiền carotenoid lại giảm [9].
Tốc độ sinh trưởng của tảo H. pluvialis ở giai đoạn này giảm, tế bào tích lũy một
lượng lớn astaxanthin. Ban đầu, astaxanthin chủ yếu được hình thành tập trung quanh
nhân và quá trình được tiếp diễn đến khi toàn bộ tế bào chuyển sang màu đỏ [25]. Các

tế bào ở dạng cyst có hàm lượng astaxanthin đạt khoảng 4% TLK [2]. Thời gian
chuyển pha mất khoảng vài tuần dưới điều kiện quang tự dưỡng [8]. Cùng lúc với sự
thay đổi hình thái và kích thước tế bào là sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein nội
bào, trong đó diễn ra sự tích lũy astaxanthin cao. Theo một số công bố cho thấy hàm
lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quá trình tích lũy astaxanthin [17], nhưng
trong nghiên cứu của Spery, 1970 [38] lại cho rằng có xu hướng giảm đi.


5

Theo Kobayashi và cs., [21] vòng đời của H. pluvialis trải qua các giai đoạn như
sau (hình 1.2 ):

Hình 1.2 Sự thay đổi hình thái tế bào (A) [26] và sự phân bào (B)
trong vòng đời của vi tảo H.pluvialis [31]
(I) Giai đoạn TB sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng hai roi, phân chia
TB để gia tăng số lượng. Các tế bào chứa hàm lượng chlorophyll và protein cao nhưng
hàm lượng carotenoid trong TB thấp.
(II) Giai đoạn tạo bào nang: Các TB sinh dưỡng chuyển sang dạng màu nâu, hình
khối cầu, mất roi. Trong suốt giai đoạn nang bào, mức độ sinh tổng hợp carotenoid và
protein tăng lên [27].
(III) Giai đoạn tế bào nang hoàn chỉnh: TB nang đã hoàn chỉnh, bất động, tích
lũy hàm lượng carotenoid cao nhất.
(IV) Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein, xuất hiện sự
phân giải carotenoid. Có hai cách thức nảy mầm ở vi tảo H. pluvialis đã được quan sát:
(1) nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu, không di động thành 1 tế bào sinh
dưỡng hình elip, có 2 roi; (2) nảy mầm gián tiếp thông qua pamella (cụm tế bào được
bao bọc bởi một màng). Khi đó màng bao bọc pamella bị vỡ, từ một tế bào nang tạo ra
8 tế bào sinh dưỡng.
1.1.3 Thành phần sinh hóa học của tảo H.pluvialis

Do tảo H. pluvialis có chu kỳ sống phức tạp, vòng đời của tảo có sự xen kẽ giữa
tế bào sinh dưỡng màu xanh với tế bào cyst màu đỏ nên thành phần dinh dưỡng của tế


6

bào tảo này thay đổi rất khác nhau giữa 2 giai đoạn sinh trưởng trong quá trình nuôi
cấy (Bảng 1.1).
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của tảo H.pluvialis ở 2 giai đoạn sinh trưởng khác
nhau [27, 31]

1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của H.pluvialis
Ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis gồm nhiều yếu tố như cường
độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của H. pluvialis dao động từ 2-24klux [10,12,20].
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis dao động từ 15-17oC [25,37]. pH tối
ưu cho sự phát triển của H. pluvialis nằm trong khoảng từ 6,5-8 [28]. Cuối cùng là
nguồn dinh dưỡng: Bao gồm đa lượng và vi lượng. Dinh dưỡng đa lượng được cung
cấp với lượng (carbon, nito, phospho, canxi,…). Các nguyên tố vi lượng chỉ cần cung
cấp với hàm lượng thấp, dao động từ mức µg/l đến mg/l. Một số dinh dưỡng vi lượng
cần thiết cho sinh trưởng của tảo đã được biết gồm sắt, mangan, đồng và các
vitamin… [20].
1.3 Giới thiệu chung về astaxanthin
1.3.1 Đặc điểm chung
Astaxanthin (3,3’- dihydroxy – β, β’-crotenen-4,4’-dione) là một oxycarotenoit,
có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M = 595, điểm nóng chảy xấp xỉ
224oC, một chất thuộc carotenoid. Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản
như cá hồi, cá vền (seabream), tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở


7

một số loài chim [16]. Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein
tạo phức chất màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết bị cắt đứt, giải
phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam. Động vật có vú không có khả năng tổng hợp
astaxanthin mà phải được cung cấp từ khẩu phần ăn. Ở H. pluvialis, astaxanthin được
tổng hợp ở giai đoạn bào nang và là loại sắc tố rất đặc trưng, có giá trị cao.
Astaxanthin có liên quan chặt chẽ với các carotenoid khác như β-carotene,
zeaxanthin và lutein, do đó chúng có nhiều chức năng chuyển hóa (trao đổi chất) và
sinh lý học của carotenoid. Sự hiện diện của hydroxyl và keto ở mỗi vòng ionone, giải
thích một số tính năng độc đáo, như khả năng este hóa, hoạt động chống oxy hóa cao
hơn và cấu hình đối cực hơn các carotenoid khác. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy kết
hợp với các protein, chẳng hạn như trong cơ thể cá hồi hoặc lớp vỏ tôm hùm, hoặc
thành hợp chất muối với một hoặc hai axit béo, để ổn định phân tử. Ở H. pluvialis,
hình thái este hóa chủ yếu, hầu hết là astaxanthin monoester [16].
Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơn các
carotenoid khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu Vitamin E”. Màu sắc của các loại
giáp xác bắt nguồn từ loại carotenoid chúng thu nhận trong thức ăn, chính là
astaxanthin. Nó còn có vai trò thức đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ sống sót
của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi [16].
1.3.2 Cấu trúc astaxanthin
Astaxanthin bao gồm hai vòng đầu cuối được nối bởi một chuỗi polyene. Phân tử
này có hai carbon bất đối xứng nằm ở vị trí 3, 3' của vòng β-ionon với nhóm hydroxyl
(-OH) ở cả hai đầu của phân tử. Trong trường hợp, một nhóm hydroxyl phản ứng với
một axit béo sau đó tạo thành monoester, trong khi cả hai nhóm hydroxyl được phản
ứng với các axit béo thì kết quả được gọi là diester. Astaxanthin tồn tại trong các đồng
phân lập thể, các đồng phân hình học, các dạng tự do và este hóa [40]. Tất cả các hình
thức này được tìm thấy trong các nguồn tự nhiên. Các bộ giải mã (3S - 3'S) và (3R 3'R) là chất dồi dào nhất trong tự nhiên. Astaxanthin tổng hợp bao gồm các đồng phân
của (3S - 3'S) (3R - 3'S) và (3R - 3'R) (Hình 1.3). Trong đó, 3S - 3'S là dạng
astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, dạng 3R - 3'S không có hoạt tính sinh
học, dạng 3R - 3'R có hoạt tính yếu [1].

8

Hình 1.3 Cấu trúc của astaxanthin [29]
(Dạng tự do(A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học (D).
R là các chuỗi axit béo bão hòa hoặc không bão hòa)
1.3.3 Các nguồn cung cấp astaxanthin
1.3.3.1 Nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học
Hiện nay, nguồn astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng
thủy sản. Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn, tạo
ra các màu sắc khác nhau. Dù vậy, nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, không
tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơ gây hại.
Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng rãi nhất
liên quan đến phản ứng Wittig của muối phosphate ở vị trí C15 với dialdehyde ở vị trí
carbon C10 (Hình 1.4A). Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóa canthaxanthin
(Hình 1.4B) [3], một quá trình trùng hợp 3 mạch carbon có chiều dài 10, 20 và 30
nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether [2] và các đồng phân của lutein được
chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để
hình thành astaxanthin (Hình 1.4C) [35].

Hình 1.4 Phản ứng tổng hợp astaxanthin (Phản ứng Witting (A); Hydroxyl hóa
canthaxanthin (B); Oxy hóa zeaxanthin (C) [29]
1.3.3.2 Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên
a. Từ các loại giáp xác


9

Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phần vỏ

ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số. Hàm lượng astaxanthin có trong vỏ
tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140mg/kg khối lượng tươi và
tồn tại ở dạng 3S-3S’. Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồn astaxanthin đáng
kể trong tự nhiên. Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong các nguyên liệu này tương
đối thấp. Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chất dinh dưỡng khác trong vỏ
tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn nhất định trong việc sản xuất [18].
b. Nấm men
Phaffia rhodozyma là một loại nấm men duy nhất được biết đến hiện nay có khả
năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% SKK (nhưng 100% astaxanthin tích lũy ở dạng
đồng phân 3R,3R’) [5] Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởng nhanh và
đạt mật độ tế bào cao trong quá trình lên men. Tích lũy astaxanthin ở nấm men thông
qua con đường menvalonate [35].
Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc rất nhiều vào đặc
điểm sinh học của chủng, phương pháp và điều kiện nuôi cấy [19]. Ngoài ra, do
Ph.rhdozyma có cấu tạo vách tế bào cứng, khó tiêu hóa đối với các động vật nên trong
quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học chứa astaxanthin từ loài nấm men này cần
phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hay xử lý bằng enzyme khác
nhau, nhằm tăng hiệu quả hấp thụ của chất này đối với động vật.
c. Tảo
Astaxanthin có thể được sản xuất từ nhiều loại vi tảo khác nhau như
Ankitrodesmus branuii, Dunaliella salina, Chlamydomonas (<50 µg/g TB)… nhưng
hàm lượng astaxanthin ở những đối tượng này lại khá thấp và không thích hợp để sản
xuất thương mại. Trong khi đó loại tảo lục Haematococcus pluvialis có khả năng tích
lũy một lượng lớn astaxanthin, thu hút các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [39].
Astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis chứa 5% dạng tự do và 95% dạng từ ester
hóa (75% monoester và 20% diester). Trong đấy, 100% astaxanthin được chiết xuất từ
H.pluvialis có dạng 3S-3S’ đây là dạng đồng phân có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất
[32].

d. Các vi sinh vật khác

10

Một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp. Và một
số chủng nấm thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích lũy astaxanthin. Hàm lượng
carotenoid của những sinh vật này thấp đồng thời cũng sinh trưởng rất chậm.
Cá hồi cũng là một nguồn cung cấp astxanthin tự nhiên. Hàm lượng Astaxanthin
trong cá hồi tự nhiên Oncorhynchus được báo cáo trong khoảng 26-38 mg / kg thịt cá
hồi. Hàm lượng Astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương được nuôi là 6-8 mg / kg thịt.
Tôm, cua và cá hồi có thể là nguồn cung cấp astaxanthin trong chế độ ăn kiêng. Cá hồi
đánh bắt tự nhiên là một nguồn cung cấp astaxanthin tốt. Để có được 3,6 mg
astaxanthin một người có thể ăn 165 gram cá hồi mỗi ngày. Astaxanthin bổ sung 3,6
mg mỗi ngày có thể có lợi cho sức khoẻ như báo cáo của Iwamoto et al [43].
1.3.4 Đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin
Astaxanthin có vai trò là chất chống oxy hóa mạnh. Sự trao đổi chất bình thường
ở sinh vật hiếu khí tạo ra các gốc tự do như hydroxyl, peroxide và phân tử oxy có hoạt
tính (reactive oxygeb species – ROS) cần thiết để duy trì sự sống. Tuy nhiên, khi hàm
lượng các chất này quá cao sẽ gây nguy hiểm bởi chũng có thể oxy hóa với các thành
phần của tế bào như protein, lipit, carbonhydrate và ADN. Để kiểm soát và giảm quá
trình này, cơ thể con người sản sinh ra các chất chống oxy hóa như superoxide
dismutase (SOD), catalase, peroxidase… tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, những
hợp chất này không đủ để bảo vệ cơ thể chống lại stress oxy hóa [31]
Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin đã được chứng minh trong một số
nghiên cứu, astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các
carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthxanthin, β-carotene và cao hơn gấp 100
lần so với α – tocopherol. Vì vậy, astaxanthin được gọi là một “super vitamin E”.
Astaxanthin thực hiện các hoạt động chống oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc tự do
hoặc dập tắt các các phản ứng oxy hóa. Đặc tính này của astaxanthin có thể do sự
tương tác vật lý và hóa học của astaxanthin với các màng tế bào [2].

1.4 Các yếu tố môi trường khác nhau ảnh hưởng đến tích lũy astaxanthin ở vi tảo
H.pluvialis
Khả năng tích lũy astaxanthin ở H.pluvialis phụ thuộc rất nhiều vào những thông
số môi trường sau [19]:
Ánh sáng là yếu tố kích thích quá trình sinh tổng hợp carotenoid, đặc biệt
astaxanthin ở H.pluvialis. Cường độ ánh sáng tối ưu cho tổng hợp – tích lũy
astaxanthin ở H.pluvialis dao động từ 75-100 klux. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp
carotenoid còn phụ thuộc vào chất lượng ánh sáng.


11

Nhiệt độ: việc tổng hợp và tích lũy astaxanthin tăng lên dần dần khi tảo được
nuôi trồng ở điều kiện nhiệt độ cao. Nhiệt độ tối ưu cho sự tích lũy astaxanthin là trên
30oC.
Các yếu tố dinh dưỡng như nguồn carbon và nito: Đối với H.pluvialis, giới hạn
nguồn nito là yếu tố chìa khóa cho tổng hợp và tích lũy astaxanthin [21]; Phospho:
Trong điều kiện thiếu hụt phosphate, H.pluvialis có thể tích lũy một lượng lớn
astaxanthin [15]; Stress độ mặn: dưới điều kiện stress độ mặn, tích lũy astaxanthin
trong bào nang xảy ra cả trong tối và ngoài sáng [15]
1.5 Tình hình nghiên cứu về vi tảo H.pluvialis tổng hợp astaxanthin trên thế giới
và Việt Nam
1.5.1 Trên thế giới
Haematococcus được Girod – Chantrans nghiên cứu đầu tiên vào năm 1797 và
tiếp tục được các nhà khoa học như Agardh, Cohn, Braun, Rostafinski, Butschli và các
nhà khoa học khác tiếp tục nghiên cứu cho đến nay. Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ
XIX, người ta đã phát hiện ra các đặc điểm sinh học về vòng đời của loài vi tảo này.
Các tế bào ở trạng thái bất hoạt sau khi được ngâm trong nước trong thời gian dài đã
mất đi khả năng sinh trưởng. Nếu những tế bào này được phơi khô, thậm chí trong một
khoảng thời gian ngắn sau đó ngâm lại trong nước thì có khả năng tăng trưởng rất

nhanh. Như vậy, Haematococcus có khả năng thích nghi với điều kiện luân phiên của
tình trạng ẩm ướt và khô hạn. Trong thời gian đó, người ta đã nghĩ đến việc sử dụng
thiết bị hút ẩm để điều chỉnh quá trình này. Đây là cơ sở khoa học đầu tiên của việc
ứng dụng các đặc tính tự nhiên của loài vi tảo này và manh nha các ý tưởng khởi đầu
cho các tác động của con người nhằm can thiệp vào vòng đời tự nhiên của H.pluvialis
[7]. Từ những năm cuối của thập kỷ 20 của thế kỷ XX, người ta đã phát hiện thấy khả
năng tồn tại trong điều kiện bất lời đối với tế bào bào tử của loài tảo này đáng ngạc
nhiên. Năm 1950, Haematococcus pluvialis đã được xác định trong hệ thống phân loại
[37]. Vòng đời của Haematococcus cũng đã được Kobayashi và cs (1992;1993) công
bố.
Trong những năm gần đây, với sự bùng nổ dân số thế giới, kéo theo hàng loạt
những vẫn đề về sức khỏe . Hiện nay, với mục đích bổ sung các vi chất cần thiết nhằm
tăng cường sức khỏe, ngăn chặn quá trình lão hóa cũng như giảm nguy cơ của một số
bệnh tật, nhu cầu về các hạt chất, đặc biệt là các chất có nguồn gốc tự nhiên là rất lớn,
do đó việc nghiên cứu về các hợp chất có giá trị từ sinh vật có tiềm năng to lớn và
ngày càng được đẩy mạnh. Astaxanthin, một loại sắc tố được tìm thấy nhiều ở vi tảo


12

lục Haematococcus pluvialis (chiếm từ 3 đến 5% khối lượng khô), đã được Hiệp hội
dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận là thực phẩm bổ sung an toàn cho con người
và được tiêu thụ rộng rãi ở nhiều nước châu Âu và Nhật Bản [32]. Astaxanthin tự
nhiên từ H.pluvialis được cho là tốt hơn so với tổng hợp hóa học về hoạt tính sinh học
cũng như độ an toàn [4, 5] và có nhiều ứng dụng quan trọng trong dược phẩm, thực
phẩm chức năng và mỹ phẩm.
Astaxanthin được biết đến với khả năng chống oxy hóa tuyệt vời, gấp nhiều lần
so với các chất kháng oxy hóa khác như β-carotene, vitamin C, vitamin A, làm giảm
đáng kể các gốc tự do trong tế bào [26, 2] và góp phần bảo vệ cấu trúc màng sinh chất
và các lipid khỏi sự oxy hóa [30]. Astaxanthin còn có vai trò kháng viêm, có tác dụng

trong việc ngăn ngừa viêm loét dạ dày do vi khuẩn Helicobacter pylori [25]; bảo vệ hệ
tiêu hóa [31]. Các nghiên cứu trên động vật của Chew và cộng sự, 2004 và trên người
của Park và cộng sự, 2010 cho thấy astaxanthin làm tăng cường chức năng của hệ
miễn dịch. Việc bổ sung astaxanthin vào chế độ dinh dưỡng được xem như một liệu
pháp tiềm năng trong việc ngăn ngừa các bệnh về tim mạch [11], mang lại nhiều lợi
ích cho những người có nguy cơ cao về bệnh tim. Do tan trong lipid nên astaxanthin
có thể di chuyển vào các mạch mãu não, làm giảm triệu chứng của các bệnh như
Alzheimer’s và các vấn đề thần kinh khác nhờ hoạt tình chống oxy hóa của mình.
Nakao và cộng sự năm 2010 đã phát hiện astaxanthin có thể chống lại tế bào ung thư ở
tuyến vú. Trong mỹ phẩm, astaxanthin giúp bảo vệ làn da trước tác hại của tia UV,
làm giảm sự sừng hóa da [2]. Trong nuôi trồng thủy sản, astaxanthin cũng được sử
dụng phổ biến như một chất tạo màu tự nhiên, việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn
trong quá trình nuôi không những làm tăng màu sắc ở thịt cá hồi, tôm mà còn tăng chất
lượng thịt, khả năng nở của trứng, thúc đẩy tăng trưởng và tăng tỷ lệ sống sót [24].
Tuy nhiên, do tính cạnh tranh về giá thành nên phần lớn lượng astaxanthin trên thị
trường hiện nay vẫn là dạng tổng hợp hóa học.
Haematococcus pluvialis có thể được nuôi cấy trong hệ thống kín
(photobioreactor) và các bể ngoài trời, điều kiện nuôi cấy có thể là tự dưỡng hoặc dị
dưỡng. Hiện có 2 quy trình nuôi một pha và hai pha. Tuy nhiên do sự vượt trội về hàm
lượng astaxanthin nên trong nghiên cứu và sản suất thương mại hiện nay, phương pháp
nuôi cấy hai pha được sử dụng phổ biến và ngày càng được cải thiện để nâng cao
lượng sản phẩm.
Quá trình sinh tổng hợp astaxanthin ở H. pluvialis bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố
môi trường khác nhau như cường độ, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, nồng độ đạm và
phosphate, độ mặn, pH và chất điều tiết sinh trưởng. Nhiều nghiên cứu đã tối ưu hóa


13

điều kiện nuôi cấy, giúp tăng nhanh sinh khối và hàm lượng astaxanthin trong tế bào vi

tảo.
1.5.2 Ở Việt Nam
Việt Nam có lợi thế là nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát
triển của vi sinh vật, nhất là tảo ngày càng phát triển. Từ năm 1972 các nhà khoa học
bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do cố GS.TSKH. Nguyễn Hữu Phước làm chủ trì.
Năm 1976, việc thử nghiệm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong 4-5 tháng ở Nghĩa
Đô, Hà Nội và thu được kết quả khá khả quan. Năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí
Minh đã được tiếp nhận giống tảo đầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng. Sau đó, tảo giống
được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng [44].
Tiếp theo những năm sau đó những nghiên cứu tối ưu môi trường sống và về
hình thái tế bào, hàm lượng sắc tố và protein nội bào trong vòng đời của vi tảo được
nghiên cứu sâu hơn. Chẳng hạn như nghiên cứu của Đặng Thị Diễm Hồng và cs, 2010
đã tiến hành nghiên cứu để chọn lọc môi trường để nuôi vi tảo H.pluvialis. Nghiên cứu
của Đinh Đức Hoàng và cs, 2011 đã xác định được sự thay đổi hình thái trong vòng
đời của vi tảo H.pluvialis [40].
Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâu và thu
được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Nhưng cho đến nay việc nuôi trồng đa số
vẫn còn gặp nhiều khó khăn, vì H.pluvialis có tốc độ sinh trưởng thấp, chu kỳ sống
phức tạp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy. Nên chưa đáp ứng được
nhu cầu trong nước và xuất khẩu nước ngoài [7].


14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Giống tảo Haematococcus pluvialis được cung cấp từ khoa Công nghệ sinh học,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tảo được lưu giữ trong môi trường C, ở nhiệt độ
25oC, cường độ ánh sáng 2000 lux, chu kì sáng tối 12:12 giờ.

2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định môi trường nuôi tối ưu cho nhân sinh khối vi tảo H. pluvialis;
- Đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của vi tảo H. pluvialis;
- Khảo sát điều kiện cảm ứng astaxanthin từ vi tảo H. pluvialis.
2.3 Phạm vi và thời gian nghiên cứu
2.3.1 Phạm vi nghiên cứu
- Môi trường nuôi thích hợp cho nhân sinh khối vi tảo H. pluvialis;
- Ảnh hưởng của các điều kiện dinh dưỡng nito và phosphate đến sinh trưởng của vi
tảo H. pluvialis;
- Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl và cường độ ánh sáng (phổ ánh sáng xanh) đến khả
năng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. pluvialis.
2.3.2 Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2017 đến tháng 4/2018.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp làm sạch và lưu giữ giống
Với tảo Haematococcus pluvialis được cung cấp từ khoa Công nghệ sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam. Tảo được lưu giữ trong môi trường C được cấy chuyền,
tạo khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch BBM. Tảo được cấy chuyền lặp lại nhiều lần
nhằm chọn được dòng tảo thuần.
2.4.2 Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào
Dụng cụ để xác định mật độ tế bào là kính hiển vi, buồng đếm Neubauer,
lamen.


15

Pha loãng mẫu (nếu thấy cần thiết) và nhỏ một lượng cần thiết (40µl) chia
đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen sao cho lamen không lệch ra khỏi buồng đếm,
không tạo bọt, sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi. Điều chỉnh tiêu cự của kính

hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên
thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát tế bào rõ hơn. Tiến hành đếm trong cả
16 ô lớn trong buồng đếm, chú ý khi đếm phải qui ước cạnh được đếm trên ô vuông
lớn. Số lần đếm được lặp lại 2 đến 8 lần.
Mật độ TB được tính theo công thức sau:
D = A*X*104
Với:
D: Mật độ tế bào (TB/ml)
A: Tổng số tế bào trong cả buồng đếm
X: Hệ số pha loãng
Dựa vào MĐTB để tính toán các thông số sinh trưởng của tảo như tốc độ sinh
trưởng đặc trung (µ; /ngày) theo công thức sau (Molna và cs, 2001):
- Tốc độ sinh trưởng (ký hiệu là µ; /ngày): µ = (ln Nt – ln N0) / (tt – t0)
Trong đó: Nt, N0 là MĐTB ở thời điểm t và thời điểm ban đầu t0 (TB/ml); t là thời
gian (ngày)
2.4.3 Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu thống kê, xử lý và so sánh được thực hiện trên phần mềm Excel
Microsoft 2013 và phần mềm phân tích thống kê R (3.4.3).
Các giá trị trung bình mật độ tế bào ở các môi trường khác nhau phân tích bằng
phương pháp phân tích phương sai (ANOVA một yếu tố).
Đánh giá sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và nồng độ muối đến khả năng cảm
ứng tích lũy astaxanthin ở vi tảo H.pluvialis dựa vào kết quả phương pháp phân tích
phương sai ANOVA hai yếu tố.
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.1 Khảo sát môi trường tối ưu
Khi tế bào H.pluvialis ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) trong môi
trường BBM. Tế bào được đưa vào 100ml môi trường BBM, RM với mật độ 1,07 x
104 tế bào/ml ở bình thủy tinh ở nhiệt độ 25 ± 0,5oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux,

16

chu kì sáng tối 16:8 giờ. Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau mỗi 2 ngày
nuôi, tốc độ sinh trưởng và hình thái được quan sát dưới kính hiển vi. Tốc độ sinh
trưởng của vi tảo H.pluvialis được đánh giá qua mật độ tế bào bằng buồng đếm
Neubauer.
2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển
của vi tảo H.pluvialis
a. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium nitrate lên sự sinh trưởng của
H.pluvialis
Khi tế bào H. pluvialis ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) trong
môi trường BBM. Thí nghiệm được tiến hành với mật độ tảo ban đầu 1,07 x 104 tế
bào/ml được đưa vào 50ml môi trường thí nghiệm BBM và RM, cường độ chiếu sáng
2000 lux, chu kỳ sáng tối 16:8 giờ và nhiệt độ được duy trì ổn định ở 25 ± 0,5oC. Sự
sinh trưởng của H. pluvialis được thí nghiệm trên 2 nền môi trường BBM, RM có
nồng độ sodium nitrate khác nhau. Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. pluvialis được
đánh giá sau mỗi 2 ngày dưới kính hiển vi thông qua mật độ tế bào bằng buồng đếm
Neubauer.
Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ sodium nitrate lên sự sinh
trưởng của H. pluvialis
Môi trường RM
Nồng độ NaNO3

Môi trường BBM

Số lượng mẫu

Nồng độ NaNO3

Số lượng mẫu

Đối chứng

300 mg/l

3 bình

Đối chứng

250 mg/l

3 bình

Tăng 2 lần

600 mg/l

3 bình

Tăng 2 lần

500 mg/l

3 bình

Tăng 3 lần

900 mg/l

3 bình

Tăng 3 lần

750 mg/l

3 bình

Tăng 4 lần

1200 mg/l

3 bình

Tăng 4 lần

1000 mg/l

3 bình

Tăng 5 lần

1500 mg/l

3 bình

Tăng 5 lần

1250 mg/l

3 bình

Tăng 6 lần

1800 mg/l

3 bình

Tăng 6 lần

1500 mg/l

3 bình

b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dipotassium phosphate lên sự sinh trưởng
của H. pluvialis
Khi tế bào H. pluvialis ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) trong môi
trường BBM. Thí nghiệm được tiến hành với mật độ tảo ban đầu 1,07 x 104 tế bào/ml
được đưa vào 50ml môi trường thí nghiệm BBM và RM, cường độ chiếu sáng 2000
lux, chu kỳ sáng tối 16:8 giờ và nhiệt độ được duy trì ổn định ở 25 ± 0,5oC. Sự sinh
trưởng của H. pluvialis được thí nghiệm trên 2 nền môi trường BBM, RM có nồng độ