Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh học dịch chiết n hexane và ethyl acetate hoa đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.64 MB, 66 trang )
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
MAI THỊ HOÀNG YẾN
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE
HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI
TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG
LUẬN VĂN CỬ NHÂN HOÁ HỌC
Đà Nẵng - Năm 2018
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
MAI THỊ HOÀNG YẾN
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE
HOA ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI
TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG
Chuyên ngành
: Hóa hữu cơ
LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. ĐỖ THỊ THÚY VÂN
Đà Nẵng - Năm 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực.
Tác giả luận văn
Mai Thị Hoàng Yến
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ..............................................................4
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC.............................................................................................5
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ
NGOÀI NƯỚC..............................................................................................5
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU
ĐỦ..................................................................................................................5
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ
BÀO...............................................................................................................6
1.5.1. Phương pháp MTT..........................................................................6
1.5.2. Phương pháp SRB...........................................................................7
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......8
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU...................8
2.1.1. Nguyên liệu.....................................................................................8
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu.......................................................8
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................8
2.2.1. Xác định chỉ số vật lí.......................................................................8
2.2.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật...................................................10
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất............11
2.3. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC.......12
2.3.1. Alcaloid..............................................................................................12
2.3.2. Flavonoid........................................................................................... 12
2.3.3. Coumarin............................................................................................12
2.3.4. Saponin.............................................................................................. 13
2.3.5. Đường khử......................................................................................... 13
2.3.6. Polyphenol......................................................................................... 13
2.3.7. Steroid................................................................................................13
2.3.8. Acid hữu cơ........................................................................................14
2.3.9. Chất béo............................................................................................. 14
2.3.10. Carotene...........................................................................................14
2.3.11. Polysaccharide................................................................................. 14
2.3.12. Iridoid...............................................................................................14
2.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NHEXANE VÀ ETHYL ACETATE................................................................. 15
2.5.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức
chế tế bào ung thư........................................................................................... 15
2.5.2. Các dòng tế bào..................................................................................15
2.5.4. Phương pháp thử độc tế bào...............................................................15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 17
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC . 17
3.1.1. Độ ẩm.................................................................................................17
3.1.2. Hàm lượng tro....................................................................................17
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại............................................................ 18
3.2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT
HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC...................................19
3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm...19
3.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Soxhlet.......23
3.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm.......25
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC30
3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT
N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
GC-MS............................................................................................................32
3.4.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết n-hexane hoa Đu
đủ đực bằng phương pháp GC-MS.................................................................32
3.4.2. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate hoa
Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS........................................................... 35
3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT
N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC............................ 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 41
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
bảng
Tên
3.1.
Độ
3.2.
Hàm
3.3
Hàm
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
Kết
dun
Kết
dun
Kết
môi
Kết
môi
Kết
bằn
Kết
môi
Kết
hexa
Kết
ethy
3.12
Kết
n-he
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
Kết
ethy
Địn
Thà
Đu
Thà
hoa
Hoạ
và e
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu
hình
1.1.
2.1.
3.1.
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
Hoa
Mối
Rắn/L
Mối
Rắn/L
Mối
Mối
Mối
Mối
thời g
Mối
Mố
Mối
Mối
3.11
Sắc k
Số hiệu
hình
Tên h
3.12
3.13
Phổ M
3.14.
Phổ M
3.15.
Sắc k
3.16.
3.17.
Phổ M
3.18.
Phổ M
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng
góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Đỗ Thị Thúy Vân người đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình làm khoá luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Hóa Trường Đại học Sư Phạm
Đà Nẵng đã giảng dạy cho em kiến thức về các môn đại cương cũng như các môn
chuyên ngành, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em
trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã luôn tạo điều kiện, quan
tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt
nghiệp.
Một lần nữa xin gửi đến thầy cô, bạn bè cùng các cô chú, anh chị tại các doanh nghiệp
lời cảm ơn chân thành và tốt đẹp nhất!
Đà Nẵng, 15 tháng 4 năm 2018
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
MỞ ĐẦU
1.
Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang
phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong những
giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có
nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên
nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng
nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi
có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C. Sản lượng Đu đủ trên thế giới
khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [9].
Ở
Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở khắp cả nước, trồng nhiều ở các
tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa. Diện tích trồng Đu đủ
của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn
quả [9]. Cây Đu đủ = là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ
thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác nhau.
Quả Đu đủ là nguồn cung cấp nhiều loại enzyme khác nhau. Papain, pepsin có
trong quả xanh giúp tiêu hóa protein trong thức ăn ở môi trường acid, kiềm và trung
tính. Lipase, một enzyme hydrolase liên kết chặt chẽ với phần không tan trong nước
của quả xanh, là một chất xúc tác sinh học cố định. Folic acid trong quả Đu đủ là chất
chuyển đổi homocysteine thành các acid amin như cysteine hoặc methionine. Nếu
không chuyển đổi, homocysteine có thể trực tiếp làm hỏng các thành mạch máu, dẫn
đến nguy cơ đau tim hoặc đột quỵ. Quả Đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho
ruột hoạt động bình thường [20].
Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng
viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh
học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh
[12, 13]. Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [16]. Lá Đu đủ có
hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
dương, các loại nấm [1, 10]. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau
[12, 19].
Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư. Ở nước ta,
cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực
nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế
bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7]. Người dân nước Úc đã dùng lá
Đu đủ chữa trị bệnh ung thư [14]. Ngoài ra, dịch chiết từ lá Đu đủ còn có tác dụng hỗ
trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng
các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các
cytokine này có khả năng chống lại khối u [15].
Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng sử dụng hoa cây Đu đủ
đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng,…;
các bệnh về hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đạo,…; chữa sỏi thận; tác dụng
kích thích tiêu hóa. Ngoài ra, hoa Đu đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ
điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…[8, 10].
Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên
cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này,
chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ
phận khác như rễ, thân và hoa của chúng.
Việc sử dụng hoa Đu đủ đực hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm
dân gian, nhiều người còn e ngại vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh. Do đó,
tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần và hoạt tính sinh
học dịch chiết n-hexane và ethyl acetate hoa Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại
Quảng Nam- Đà Nẵng”.
2.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến các phương pháp chiết (ngâm, soxhlet, siêu
âm), khảo sát thành phần hóa học vàn hoạt tính sinh học của hoa Đu đủ đực góp phần
cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng
cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn.
3.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
-
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Hoa Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng.
Chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực bằng các dung môi khác nhau. Từ các dịch
chiết này, tiến hành khảo sát thành phần các hợp chất hoá học.
-
Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của một số phân đoạn dịch chiết từ hoa Đu
đủ đực.
4.
Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
thế
Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên
giới.
-
Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng
dụng của hoa Đu đủ đực.
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
-
Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;
Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết
siêu âm;
-
Các phương pháp định danh thành phần hóa học;
Sắc
Các phương pháp nghiên cứu xác định công thức cấu tạo hợp chất hóa học:
ký khí-khối phổ (GC-MS),
-
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học hoạt tính gây độc tế bào;
-
Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học.
5.
Bố cục của luận văn
Luận văn gồm 44 trang, 17 bảng, 18 hình ảnh, 20 tài liệu tham khảo.
Với:
Phần mở đầu (3 trang)
Chương 1 – Tổng quan (4 trang)
Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (9 trang)
Chương 3 – Kết quả và thảo luận (24 trang)
Kết luận (1 trang)
Tài liệu tham khảo (3 trang)
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ
Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu Mỹ
được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45
loài [17]. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi và một
loài [1].
Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4
mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất
dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy
nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn được gọi Thù
đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung
(Lào), Má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành
3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây Đu đủ
cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn
đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1).
Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi
nhiệt độ [6].
A: hoa cái
B: hoa lưỡng tính
D: trái của cây cái
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
C: hoa đực
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC
Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học
của hoa Đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một số
sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [5].
Năm 2016, Trần Thanh Hải đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và
Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetatee trong hoa Đu đủ đực
thu hái trên địa bàn tỉnh Quảng Nam [4].
Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và βsitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn
Quảng Nam - Đà Nẵng [12].
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ NGOÀI
NƯỚC
Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố thành phần hóa học của hoa
Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0,07%), alcaloid (0,05%),
tannin (0,002%) và flavonoid (2,8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca,
Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [11].
Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố kết quả trong
hoa Đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoid, steroid, flavonoid, tannin,
glycoside và saponin [14].
Tóm lại đã phân lập được Kaempferol, Kaempferol-3-O-β-glucopyranosid
(Glucosinolate), β-sitosterol glucoside (Sterol) trong hoa Đu đủ đực. Như vậy, thành
phần hóa học hoa Đu đủ đực đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên
cứu còn khá ít.
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HOA ĐU ĐỦ
Tác dụng chống ung thư
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu dịch chiết
ethanol của hoa Đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư
vú [14].
Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả sàng
lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu hái
ở Quảng Nam-Đà Nẵng. Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết chloroform có hoạt
tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B và ung thư
vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/mL.
Tác dụng chống oxy hóa
Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong
cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác
nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,...
Công dụng trong dân gian
Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng
chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ
em. Ngoài ra hoa Đu đủ đực được dùng để chữa sỏi thận hiệu quả [6,11].
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng
sự [18]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia
(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc,
phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều
kiện in vitro.
Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả
trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương
pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
1.5.1. Phương pháp MTT
Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [9]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển
khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào
động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi
thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao.
Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt
động của tế bào.
1.5.2. Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh
giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng
sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của
SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào
không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH
của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường acid nhẹ,
SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố
định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và
đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu hoa của cây Đu đủ đực được thu hái tại. Quảng Nam- Đà Nẵng vào
tháng 01 năm 2017. Hoa Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được
rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu.
Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 2,0 m có nhiều lá và hoa.
Hoa Đu đủ đực nở theo chùm, màu trắng, hoa nở nhiều, còn nhiều nụ, không bị sâu.
Cuống hoa hình trụ, màu xanh lục, thân xốp.
Bột hoa Đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm.
Hình 2.1. Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết n-hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, ethanol và nước
cất.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, tủ
sấy, tủ nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet,
bình định mức, giấy lọc,…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định chỉ số vật lí
Độ ẩm
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Tiến hành:
Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong tủ sấy
đến khối lương không đổi m0. Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ
phòng thì cân khối lượng các cốc sứ.
Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu hoa Đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m 1
0
trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 100 C. Cứ
sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối
lượng mẫu không đổi m2.
Cách tính độ ẩm:
Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi
cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Độ ẩm được tính theo công thức sau
Trong đó:
m0: Khối lượng cốc sứ (g)
m1: Mẫu bột hoa Đu đủ đực (g)
m2: Cốc sứ chứa bột hoa đu đủ sau khi sấy (g)
W: Độ ẩm của mẫu (%)
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử
trong điều kiện nhất định.
Tiến hành:
Cân 5 mẫu hoa Đu đủ đực sấy khô ở trên với khối lượng m 1 đem than hóa sơ bộ
0
trên bếp điện rồi cho vào lò nung ở 400-450 C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho
đến khi thu được tro trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu.
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Sau đó cho vào nung 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình
hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi.
Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy, là hiệu
số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung.
Cách tính kết quả:
Hàm lượng tro được tính bằng công thức:
Trong đó:
m0: Khối lượng cốc sứ
m1: Mẫu hoa Đu đủ đực sau khi sấy khô (g)
m2: Khối lượng của cốc sứ và hoa Đu đủ đực sau khi tro hóa (g)
Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên.
Xác định hàm lượng kim loại
Mẫu hoa đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO 3 10% và được
định mức bằng nước cất đến 10mL. Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác
định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
2.2.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu bột hoa Đu đủ đực thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng. Trong
nghiên cứu này tiến hành 3 phương pháp chiết: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết
siêu âm.
Chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu bột hoa Đu đủ đực trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc
thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có
thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả.
Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại
dung môi n-hexane, ethyl acetate. Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với lượng
bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, với thể tích dung môi n-hexane/ethyl acetate thay đổi
từ 100mL đến 300mL, ngâm trong thời gian 1 ngày. Tiến hành chiết 5 mẫu với tỉ lệ
Rắn/Lỏng khác nhau, lần lượt là 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30. Thu dịch chiết, cô đuổi
dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân.
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung
môi n-hexane, ethyl acetate. Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với tỉ lệ R/L =
1/20 gồm khoảng 10g bột hoa Đu đủ đực và 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate.
Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5 ngày. Thu dịch
chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân.
Chiết Soxhlet:
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung
môi n-hexane, ethyl acetate bằng bộ Soxhlet. Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet với
o
lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng10g, 200mL dung môi n-hexane ở nhiệt độ 78 C
o
(dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ 87,1 C). Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác
nhau, lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 giờ. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng
không đổi rồi cân.
Chiết siêu âm:
Khảo sát nhiệt độ: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng
loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm. Sử dụng phương pháp chiết
siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl
acetate trong 30’. Tiến hành chiết 5 mẫu với nhiệt độ khác nhau, lần lượt là 30, 40, 50,
0
60 và 70 C. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân.
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng
loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm. Sử dụng phương pháp chiết
siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl
0
acetate ở 50 C. Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 30, 60, 90,
120 và 150 phút. Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được
thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS.
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
Luận văn tốt nghiệp
GVHD:ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
2.3. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
2.3.1. Alcaloid
Cân 5g bột hoa Đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform:
ethanol 95 độ : NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có tính base.
Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn.
Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan phần cặn
trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc
thử Mayer, Wagner.
Sau khi thử dịch chiết với:
Thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa vàng, phản ứng dương tính
Thuốc thử Wagner: Xuất hiện kết tủa nâu, phản ứng dương tính
2.3.2. Flavonoid
Ngâm 5g bột hoa Đu đủ đực trong dung môi ethanol, lọc lấy dịch . Cho 1mL dịch
lọc vào ống nghiệm rồi đem thử với các phản ứng:
Phản ứng với dung dịch H2SO4 đậm đăc: Thêm vài giọt dung dịch H 2SO4 đậm đặc
vào ống nghiệm chứa dịch lọc .Nếu là flavone, isoflavone, flavonol cho màu vàng đậm
đến màu cam. Chalcone, aurone cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ. Flavonol cho màu
từ cam đến đỏ.
Phản ứng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống
nghiệm chứa dịch lọc. Nếu là flavone, isoflavone, isoflavanone, flavanone, chalcone,
Leucoanthocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. aurone cho
màu tím đến đỏ tím.
2.3.3. Coumarin
Ngâm 5g bột hoa Đu đủ đực trong 50mL ethanol, lọc lấy dịch lọc, cho 2-3mL dịch
lọc vào 2 ống nghiệm và thử bằng phản ứng mở đóng vòng lactone.
̵̵Ống 1: Thêm 0,5mL dung dịch NaOH 10%
̵̵Ống 2: Giữ nguyên.
Sau đó đun cách thủy cả 2 ống trong vài phút, để nguội thêm vào mỗi ống 4mL
nước cất, nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa bằng H 2SO4 loãng mà ống
1 đục hơn ống 2 thì có coumarin.
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD
