Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
BƯỚC

ĐẦU

XÁC

ĐỊNH

SÁU

HỢP

CHẤT

ISOFLAVONE TRONG BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC
Sinh viên thực hiện
Lớp
Chuyên ngành
Khóa
GVHD

Đà Nẵng , ngày 19 tháng 4 năm 2018.

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường được sự quan tâm và giúp
đỡ của các thầy cô khoa Hóa Học, Trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng, đặc biệt dưới
sự hướng dẫn tận tình của TS Bùi Xuân Vững em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
của mình.
Em xin trân trọng cảm ơn thầy đã luôn dành thời gian và tâm huyết của mình để
truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu, luôn định hướng, góp ý sửa
chữa những chỗ sai để từ đó giúp em biết nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết về nội dung, cũng
như các vấn đề liên quan đến khóa luận và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến các thầy cô giáo ở phòng thí nghiệm, thầy cô
trong khoa Hóa cùng tất cả bạn bè và gia đình đã giúp đỡ, góp ý và chỉ bảo tận tình
trong suốt thời gian em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng em xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã dành thời
gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đề tài tốt nghiệp của em.
Em xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, ngày

tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện:


HPLC

High-pe

OKR

Okara (b

DMSO

Dimethy

AOAC

Associa


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
1.1. Giới thiệu về isoflavone....................................................................................3
1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu trúc và hoạt tính của isoflavone............3
a) Nguồn gốc, đặc điểm............................................................................................3
b) Tính chất, cấu trúc................................................................................................3
1.1.2. Vai trò, ứng dụng của isoflavone.....................................................................6
a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương...................................................................6
b) Tác dụng trên tim mạch........................................................................................6
c) Tác dụng trên các chức năng nhận thức...............................................................7
d) Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormone.......................................................7
1.2. Giới thiệu về bã đậu nành................................................................................7
1.2.1. Đặc điểm của bã đậu nành[11].......................................................................8
1.2.2. Những nghiên cứu liên quan đến bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm 8
1.3 Tổng quan về các nghiên cứu chiết isoflavone từ bã đậu nành trong và ngoài

nước.......................................................................................................................... 9
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước............................................................................9
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước........................................................................... 10

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC [8]....................11
1.4.1 Khái niệm....................................................................................................... 11
a) Định nghĩa về sắc ký........................................................................................... 11
b) Sắc ký lỏng hiệu nâng cao-HPLC....................................................................... 11
1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký..................................................................... 12


1.4.3. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ các cấu tử chất tan........................13
1.4.4 Đặc tính sắc kí của chất tan........................................................................... 13
a) Tính chất lưu giữ................................................................................................. 13
b) Hệ số phân bố K.................................................................................................. 14
c) Hệ số dung lượng k’............................................................................................ 14
d) Hệ số chọn lọc..................................................................................................... 15
1.4.5 Hệ thống HPLC.............................................................................................. 16
a) Bình chứa dung môi............................................................................................ 16
b) Áp suất trong cột tách......................................................................................... 16
c) Hệ thống bơm...................................................................................................... 17
d) Hệ thống tiêm mẫu.............................................................................................. 17
e) Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao............................................................................. 18
f) Detector............................................................................................................... 18
g) Bộ phận ghi tín hiệu............................................................................................ 20
h) Thiết bị in dữ liệu................................................................................................ 20
1.4.6 Các bước tiến hành sắc ký.............................................................................. 21
a) Chuẩn bị dụng cụ và máy móc............................................................................ 21
b) Chuẩn bị dung môi pha động.............................................................................. 21
c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC...................................................................................... 21
d) Cách vận hành thiết bị........................................................................................ 21
1.5 Kết luận............................................................................................................ 22
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............23
2.1. Nguyên liệu..................................................................................................... 23

2.2 Hóa chất và thiết bị......................................................................................... 23
2.2.1 Hóa chất......................................................................................................... 23


2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích........................................................................ 25
2.4 Các phương pháp nghiên cứu......................................................................... 26
2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone [3], [4]......................................... 26
Quy trình công nghệ chiết isoflavone bằng phương pháp chiết lắc thông

a)

thường
.................................................................................................................................. 26

b) Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm........27
2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng HPLC [1], [2], [6], [9] 28

a) Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone........28
•

Chọn bước sóng............................................................................................... 28

•

Chọn tốc độ dòng............................................................................................. 28

b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động.................................................................... 29
c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính................................................................... 31
d) Phân tích định tính isoflavone............................................................................. 31
e) Phân tích định lượng isoflavone.......................................................................... 31

•

Quy trình chuẩn bị mẫu đo HPLC................................................................... 32

•

Xác định hàm lượng isoflavone....................................................................... 32

2.4.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo [14]............................................................. 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 34
3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động................................................. 34
3.2 Kết quả khảo sát các mẫu đậu nành có isoflavone theo hệ 1....................... 36
3.3 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính................................................ 39
3.4 Khảo sát độ lặp lại của phép đo...................................................................... 45
3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [14]........................48
3.6 Kết quả định tính isoflavone trong mẫu dịch bã........................................... 48
3.5 Kết quả đo mẫu thực....................................................................................... 50


3.6 Áp dụng đường chuẩn trong tính toán hàm lượng isoflavone trong bã đậu
nành........................................................................................................................ 53
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................... 59
4.1. Kết luận........................................................................................................... 59
4.2. Đề xuất............................................................................................................ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 60


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của isoflavone..................................................................... 3
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Isoflavone[9]............................................................... 3

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của các aglucones............................................................. 4
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của các - Glucozit........................................................... 4
Hình 1.4: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B......................................13
Hình 1.5: Sơ đồ máy HPLC......................................................................................... 16
Hình 2.1 Bã đậu nành tươi, bã khô và bột bã.............................................................. 23
Hình 2.2 Thiết bị khuấy và thiết bị li tâm.................................................................... 24
Hình 2.3 Thiết bị lọc chân không và thiết bị cô quay chân không...............................24
Hình 2.4 Máy lắc và thiết bị sấy.................................................................................. 25
Hình 2.5 Tủ lạnh và thiết bị cất nước.......................................................................... 25
Hình 2.6 Thiết bị HPLC............................................................................................... 25
Hình 2.7 Quy trình chiết isoflavone trong phòng thí nghiệm....................................... 26
Hình 2.8 Quy trình chiết isoflavone bằng phương pháp khuấy có hỗ trợ siêu âm trong
phòng thí nghiệm......................................................................................................... 27
Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 1.................................................... 34
35
Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 2.................................................... 35
Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 3.................................................... 35
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của thành phần pha động theo hệ 1.................36
Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu cao hạt đậu nành.................................................................. 36
Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu dịch hạt đậu nành chiết bằng cồn 80%.................................37
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu hạt khô.................................................................................. 37
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu cao bã đậu nành.................................................................... 38


Hình 3.9 : Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành................................................................ 38
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc dện tích peak vào nồng độ Daizdin.............41
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào glycitin...........................42
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào genistin..........................42
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Daidzein............................................... 43
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ glycitein...........43

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistein..........44
Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu dịch bã chiết bằng etanol.................................................... 51
Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc............................52
Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc.............53


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Danh sách của các isoflavones[9], [3]..........................................................5
Bảng 2.1. Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml)................................................... 31
Bảng 3.1. Kết quả đo chuẩn STD OKR1...................................................................... 39
Bảng 3.2. Kết quả đo chuẩn STD OKR2...................................................................... 39
Bảng 3.3. Kết quả đo chuẩn STD OKR3...................................................................... 40
Bảng 3.4. Kết quả đo chuẩn STD OKR4...................................................................... 40
Bảng 3.5. Kết quả đo chuẩn STD OKR5...................................................................... 41
Bảng 3.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzin......................................... 45
Bảng 3.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitin......................................... 45
Bảng 3.9. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistin........................................ 46
Bảng 3.10. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Daidzein.....................................46
Bảng 3.11. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitein...................................... 47
Bảng 3.12. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistein..................................... 47
Bảng 3.13. Kết quả LOD và LOQ................................................................................ 48
Bảng 3.14. Kết quả đo dịch bã chiết bằng cồn 80%.................................................... 51
Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc.........................52
Bảng 3.15. Kết quả đo mẫu bã khô chiết theo AOAC bằng siêu âm kết hợp lắc..........53
Bảng 3.16. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy.............54
Bảng 3.17. Hàm lượng isoflavone................................................................................ 55
Bảng 3.18. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy.............56
Bảng 3.19. Hàm lượng isoflavone trong 1 g bã khô..................................................... 56
Bảng 3.20. Nồng độ các hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy.............57

Bảng 3.21. Hàm lượng isoflavone trong 1g bã khô...................................................... 58


LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong nhiều thập kỷ trước, việc sử dụng các loại thực phẩm từ đậu nành đã
được cho là có liên quan đến một số lợi ích đối với sức khoẻ của con người như: chống
ung thư, giảm nguy cơ của chứng loãng xương và hạ thấp mức cholesterol huyết
tương…Một trong những hoạt chất quý góp phần tạo nên các khả năng phòng bệnh,
chữa bệnh của đậu nành là các phytoestrogen.
Phytoestrogen là thành phần có thể gặp với hàm lượng tương đối cao ở nhiều
thực phẩm quen thuộc, đặc biệt là trong đậu nành và các thực phẩm được chế biến từ
đậu nành. Phytoestrogen trong đậu nành là isoflavones có cấu trúc hóa học rất gần với
estrogen, một nội tiết tố nữ có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ xương, bằng cách
làm giảm tỷ lệ tiêu hao xương và kích hoạt hình thành các tế bào tạo xương.
Trong tự nhiên, nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như:
củ sắn dây, quả thạch lựu, đậu nành và đặc biệt nguồn nguyên liệu rẻ tiền từ phụ phế
phẩm của ngành công nghiệp chế biến đậu nành, bột đậu nành, đậu khuôn,…rất phong
phú. Sữa đậu nành Vinasoy, Vinamilk, Tribeco… hàng năm thải ra một lượng bã rất
lớn. Riêng nhà máy Vinasoy-Quảng Ngãi mỗi ngày thải ra gần 30 tấn bã đậu nành
nhưng hướng giải quyết chủ yếu là bán cho người dân làm thức ăn gia súc. Tuy nhiên,
lượng bã này vẫn còn chứa một lượng các chất dinh dưỡng đáng kể: protein, hàm
lượng xơ, gluxid,… và đặc biệt là hoạt chất isoflavone. Việc thu nhận isoflavone từ
nguồn phụ phẩm bã đậu nành có một ý nghĩa to lớn, vừa góp phần giải quyết vấn đề
môi trường và hơn hết là mang đến rất nhiều lợi ích cho con người.
Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bã đậu nành (okara),
nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học trong bã đậu nành
(đặc biệt là các isoflavone), cũng như ứng dụng bã đậu nành trong công nghiệp thực

phẩm. Hơn nữa, nguồn phế liệu là bã đậu nành thì lại rất dồi dào. Từ những lý do trên, tôi
chọn đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành bằng phương
pháp HPLC” để nghiên cứu cho đề tài tốt nghiệp của mình. Công trình nghiên cứu bã đậu
nành như là một món quà nhỏ góp phần vào kho tàng tư liệu nước nhà.

1 | P a g e


2.Mục đích của đề tài

➢

Xây dựng phương pháp xác định isoflavone trong đậu nành bao gồm:

-

Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

-

Khảo sát các quy trình xử lý mẫu.

-

Thẩm định phương pháp đã xây dựng.

➢

Áp dụng phương pháp xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành
được thu nhận tại 5 cơ sở chế biến đậu phụ và sữa đậu nành trên địa bàn Thành

phố Đà
Nẵng.

2 | P a g e


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về isoflavone
1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu trúc và hoạt tính của isoflavone
a)

Nguồn gốc, đặc điểm
Isoflavone là phytoestrogen có nhiều trong các thành phần của thực vật tự

nhiên. Hơn 300 loài thực vật, bao gồm cả rễ và đặc biệt là hạt của chúng có chứa
isoflavone. Các nguồn chứa isoflavone nhiều hơn cả ở cây họ đậu, bông cải xanh, súp
lơ, lúa mạch…và đậu nành là nguồn chính chứa isoflavone. Ngoài ra, chất chiết xuất
từ rượu vang đỏ chứa một lượng nhỏ isoflavone và thực vật tự nhiên như: cỏ ba lá đỏ,
mầm cỏ linh lăng, và hạt lanh đều chứa isoflavone. Trong số các nguồn trên thì đậu
nành và các sản phẩm từ đậu nành là một trong những nguồn giàu isoflavone nhất[12].
b) Tính chất, cấu trúc
Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenol (các chất có nhiều vòng
phenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí gắn
của vòng benzen) (Kaufman và cs. 1997) [12].
Các isoflavone có hoạt tính chống oxy hóa và được coi là các chất ứng dụng
trong điều trị ung thư (Salakka và cs. 2006).
Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: Avà B nối với dị vòng pyron

C [9].

B

A

C

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của isoflavone
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Isoflavone[9].

3 | P a g e


Isoflavone có đến 12 đồng phân được phân lập từ đậu nành và được xếp vào 4
nhóm chính cụ thể như sau:

❖

Aglycones (daidzein, genistein, glycitein).

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của các aglucones

❖

B-glucosides (daidzin, genistin, glycitin).

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của các - Glucozit

❖

Malonyl-glucosides (malonyl-daidzin, malonyl-genistin, malonyl- glycitin).

4 | P a g e


❖

Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, acetyl-glycitin).

Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.1 bởi
tác giả Mortensen cùng các cộng sự.
Trong đó, hai hợp chất isoflavone quan trọng nhất là daidzein và genistein.
Bảng 1.1. Danh sách của các isoflavones[9], [3].
Tên
Daidzein
Glycitein
Genistein
Daidzin
Glycitin
Genistin
Acetyl hoặc
Manolyl daidzin
Acetyl hoặc
Manolyl glycitin
Acetyl hoặc
Manolyl genistin
Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” chủ yếu là daidzin và genistin.
Daidzin và genistin là những phân tử lớn, tan tốt trong nước, tính phân cực cao nên
khó hấp thu qua ống tiêu hóa. Muốn cho dễ hấp thu và có giá trị sinh học, phải thủy phân
chúng thành các aglycone, tức làm mất thành phần glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần

có xúc tác enzyme đặc hiệu là glycosidase. Ống tiêu hóa của người không tạo ra được
glycosidase, nên cơ thể không thể thủy phân được isoflavone. Do đó, isoflavone

5 | P a g e


chưa có giá trị sinh học. Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo ra được
enzyme glycosidase cần cho quá trình thủy phân nêu trên, giúp cho isoflavone được
hấp thụ. Các aglycone sẽ được hấp thu ở ruột non. Lactobacillus sporogenes là vi
khuẩn chính sản xuất glycosidase, giúp cân bằng tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân
daidzin và genistin sang daidzein và genistein có hoạt tính phytoestrogen [10] .
Các phytoestrogen có nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Một trong những tác
dụng quan trọng là gắn thuốc chỉ vào các thụ thể estrogen đặc hiệu, sau đó kích thích
thụ thể tạo nên “tác dụng estrogen”.
1.1.2. Vai trò, ứng dụng của isoflavone
a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương
Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ Châu Á
thấp hơn hẳn so với các nước ở phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử dụng
nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành. Hiệu lực của isoflavone từ đậu nành trên quá trình
dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật độ
khoáng ở xương (BMD) tới các đốt sống L2-L4 khi so sánh với phụ nữ theo chế độ ăn
nghèo đậu nành.
Hiệu lực của isoflavone đậu nành trên chuyển hóa của xương cũng được khẳng
định trong các nghiên cứu lâm sàng khác và còn được xác minh qua các nghiên cứu
trên chuột cống cắt bỏ buồng trứng. Isoflavone còn làm giảm nguy cơ loãng xương
nhờ ức chế được hoạt tính của hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu
xương nhờ hoạt tính estrogen của thuốc này[10].
b) Tác dụng trên tim mạch
Chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành
(CHD). Isoflavone đậu nành có những tác động khác nhau chống rối loạn lipit-máu ở

người mãn kinh, có thể cắt giảm được nguy cơ co tim mạch. Đậu nành và các chất
chiết xuất của đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ
kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ [7], [10]:



Làm giảm huyết áp tâm trương.

6 | P a g e




Làm giảm cholestreron toàn phần, giảm cholestreron “xấu” (tức

LDL –
cholestreron), giảm triglyxerid, tăng HDL – C, giảm tỷ số cholestreron toàn phần/HDL
– C, giảm tỷ số LDL – C/ HDL – C.



Chống tiểu cầu.



Ngăn chặn sự tiến triển của các mảng xơ vữa.



Cải thiện tính đàn hồi động mạch.



Chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự lipoperoxy
hóa của lecithin và của LDL – cholesterol sản sinh ra các sản phẩm cuối cùng có hại, vì
các sản phẩm này có ái lực rất cao với thành động mạch và gây ra những mảng xơ vữa.

c) Tác dụng trên các chức năng nhận thức
Liệu pháp thay thế hormon (HRT) đã chứng tỏ có tác dụng thuận lợi trong điều
trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao tuổi. Vì vậy, có thể suy ra là
phytoestrogen cũng có thể có các lợi ích tương tự [10].
d) Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormone
Tỷ lệ một số loại u phụ thuộc hormone (như u ở màng trong tử cung, ở vú, buồng
trứng) thay đổi rất rõ rệt, nhưng tỷ lệ này rất thấp ở phụ nữ châu Á. Nhận xét này về dịch
tễ cho thấy có liên quan đến chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành ở dân cư châu Á.

Các nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng đã chứng minh hiệu lực của
phytoestrogen làm giảm nguy cơ ung thư ở màng trong tử cung, ở vú và buồng trứng.
Kết quả chưa hoàn toàn chắc chắn, cần các nguyên cứu tiếp theo để mang lại một kết
luận rằng isoflavone từ đậu nành có thể ngăn ngừa hữu hiệu các loại u nêu trên. Nhưng
chắc chắn rằng isoflavon từ đậu nành không làm tăng nguy cơ ung thư mặc dù
isoflavone có tác dụng estrogen [10].
1.2. Giới thiệu về bã đậu nành
Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara) là một sản phẩm phụ được tạo ra trong quá
trình sản xuất đậu phụ hoặc sữa đậu nành. Okara có nghĩa là phần cặn vỏ. Ở mỗi nước có
cách gọi khác nhau như tại Trung Quốc, okara được biết đến rộng rãi nhất như douzha
(cặn đậu nành), đậu phụ Zha (cặn đậu phụ) ngoài ra cũng được gọi là cặn đậu phụ Zha-

7 | P a g e

tsu. Đến nay thuật ngữ okara là từ chung để sử dụng cho bã đậu nành. Đây là phần bã
và các chất dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi tách khỏi dịch các
chất tan có màu trắng hay trắng ngà nằm trên mặt lưới sau khi lọc sữa (Shurtleff el al,
2004) [11].
Bã đậu nành được thu nhận thông qua quá trình ly tâm từ đậu nành sau sản xuất
đậu phụ hoặc sữa đậu nành. Cứ khoảng 1,1÷1,2kg bã đậu nành tươi được tạo ra từ quá
trình sản xuất 1kg đậu nành (Khare và cs., 1995).
Số lượng rất lớn của okara sản xuất hàng năm gây ra một vấn đề xử lý đáng kể.
Okara đôi khi được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi nhưng hầu hết là bán phá giá và bị
đốt cháy như chất thải. Tuy nhiên, trong thành phần của okara chứa nhiều xơ và các
chất khác: protein, lipit,… Các thành phần khác cũng có khả năng hiện diện trong
okara bao gồm: isoflavone, lignans, phytosterol, coumestans, saponin và phytates.
Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy okara có chức năng ngăn ngừa: bệnh tiểu đường,
tăng lipid máu, béo phì và có các hoạt động chống oxy hóa.
Vì vậy, okara có thể được sử dụng như một thành phần chức năng với các thuộc
tính tăng cường sức khỏe. Đồng thời, việc nghiên cứu okara còn có một ý nghĩa to lớn
trong việc giải quyết vấn đề về môi trường.
1.2.1. Đặc điểm của bã đậu nành[11]
Okara bao gồm chủ yếu là các chất không hòa tan từ đậu tương. Do đó, nhiều
celluloses và hemicelluloses, protein và chất béo.
Trong bã chứa một lượng lớn chất xơ như: cellulose, hemicellulose và lignin
chiếm khoảng 50%, khoảng 25% protein, dầu 10÷15%, ít tinh bột và carbohydrate đơn
giản, tro 3,5%.
1.2.2. Những nghiên cứu liên quan đến bã đậu nành trong công nghiệp thực phẩm
Trong bã đậu nành ngoài thành phần có giá trị hòa tan và không hòa tan như: chất
xơ, protein, chất béo,…thì trong thành phần còn chứa một hoạt chất rất quan trọng, đó là
isoflavone. Isoflavones thuộc về một nhóm lớn các polyphenol, đóng một vai trò quan
trọng trong sức khỏe con người. Những tên gọi như các thành phần hoạt tính sinh học
thường hiện diện với lượng thấp trong thực phẩm, nhưng có một giá trị cao do chúng

8 | P a g e


ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Isoflavones có vai trò trong việc chữa bệnh ung
thư vì có liên quan đến hormone, loãng xương, và hậu hội chứng mãn kinh.
Isoflavones chiếm khoảng 0,1% vật chất khô của okara, mỗi năm nếu số lượng lớn các
okara bỏ đi, thì đồng nghĩa với một lượng lớn isoflavones bị lãng phí. Chính vì thế, mà
ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt chất quý này trong và ngoài nước.
Hiện nay trên thế giới, các nghiên cứu cho thấy okara có chức năng ngăn ngừa
bệnh tiểu đường, tăng lipid máu, béo phì và các hoạt động chống oxy hóa. Vì vậy, nó
có thể được sử dụng như một thành phần chức năng với các thuộc tính tăng cường sức
khỏe. Người ta tiến hành sấy okara tươi và nghiền ra thành bột nhằm thay thế một
phần bột mì để sản xuất bún và bánh mì, cung cấp lợi ích cho người tiểu đường. Okara
cũng có thể được sử dụng trực tiếp như là một sản phẩm thực phẩm, chẳng hạn như
okara tempeh thường được sử dụng phổ biến ở Indonesia. Tuy nhiên, việc chấp nhận
okara là sản phẩm thực phẩm cũng còn hạn chế chính vì thế mà đa phần chúng được sử
dụng làm thức ăn gia súc hoặc bị bỏ đi.
Các tác giả khác khám phá việc sử dụng nó như là cơ chất cho quá trình lên
men để sản xuất các thành phần có giá trị như axit xitric hoặc các kháng sinh
lipopeptide iturin A.
ỞViệt Nam bã đậu nành được tạo ra từ các nhà máy sản xuất sữa rất lớn. Cụ thể
nhà máy sữa đậu nành Vinasoy-Bắc Ninh với công suất thiết kế 180 triệu lít/năm tương
ứng với nhu cầu tiêu thụ 15 nghìn tấn đậu nành hạt/năm và tạo ra hơn 20 nghìn tấn bã đậu
nành. Hai nhà máy nghiền đậu nành là nhà máy Bunge Việt Nam và nhà máy Quang
Minh, hoạt động với tổng công suất tiêu thụ 4.000 tấn đậu nành một ngày, năm 2012 cung
cấp cho thị trường 650.000 tấn bã đậu nành và 180.000 tấn khô dầu đậu nành.

Tuy nhiên hiện nay bã đậu nành chủ yếu làm thức ăn cho gia súc và làm phân
bón vi sinh. Hầu như chưa có ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp.
1.3 Tổng quan về các nghiên cứu chiết isoflavone từ bã đậu nành trong và ngoài

nước
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước

9 | P a g e


Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu chiết isoflavone từ đậu nành rất phổ biến và
đang được quan tâm nhiều bởi những tác dụng tuyệt vời mà hợp chất này mang lại. Tuy
nhiên, gần đây việc nghiên cứu chiết isoflavone từ phụ phế phẩm của đậu nành là bã đậu
nành đang là hướng đi mới cho nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới.
Theo Lena Jankowiak và các cộng sự (2014) trên tạp chí Food Chemistry đã sử
dụng nước làm dung môi để chiết isoflavone từ okara. Tại một tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
0

thấp là 20/1, nhiệt độ 20 C, thì có đến 47% của isoflavone được chiết xuất từ ethanol
70%. Cũng với điều kiện này với thêm pH=10 khi tiến hành khai thác bằng nước thì cũng
không có khác biệt mấy giữa isoflavone khai thác trong nước và trong ethanol 70%. Chính
vì thế, họ đã sử dụng nước làm dung môi để chiết isoflavone từ okara [3].

Cũng từ tác giả Lena Jankowiak và các cộng sự (2014) nhưng trên tạp chí
Journal of Food Engineering khi nghiên cứu về tiềm năng sản xuất isoflavone từ okara
thô. Nước và ethanol là 2 dung môi được tác giả sử dụng để chiết isoflavone vì tính
thân thiện với môi trường và không độc hại của chúng. Một loạt các nồng độ của
ethanol đã được thử nghiệm (0÷90%) để khai thác ở nhiệt độ thường. Tác giả đã nhận
thấy rằng có thể thu nhận isoflavone từ okara thô. Đồng thời, tác giả cũng đưa đến kết
luận: nồng độ tối ưu của isoflavone trong chiết xuất đã đạt được với nồng độ ethanol
giữa 50÷70%. Nồng độ ethanol trên 60% yêu cầu một tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao
do độ ẩm cao trong okara. Tăng nồng độ ethanol sẽ hạ thấp hàm lượng protein, tương
ứng với sự gia tăng độ tinh khiết. Một hàm lượng nước cao trong dung môi kết hợp
khai thác một số lượng lớn của các thành phần khác [3].

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
So với thế giới thì việc tận dụng các nguồn phế phẩm từ công nghiệp thực phẩm
ở trong nước để tiến hành nghiên cứu sản xuất ra sản phẩm mới vẫn còn nhiều hạn
chế.
Đặc biệt, việc nghiên cứu chiết tách isoflavone từ bã đậu nành vẫn chưa được quan
tâm chú trọng khi mà hàng năm có rất nhiều nhà máy sản xuất sữa đậu nành đã thải ra
hàng tấn phế phẩm này.
Việc nghiên cứu chiết tách isoflavone ở trong nước cũng đã có một vài nghiên
cứu nhưng người ta tiến hành khai thác hoạt chất quý này chủ yếu ở các loại thực vật:
sắn dây, đậu nành, cỏ 3 lá,…Theo tác giả Đỗ Thị Hoa Viên (2004) đã tiến hành tách
10 | P a g e


chiết phytoestrogen (isoflavone) từ đậu tương và sắn dây, sau đó tiến hành định tính để
nhận biết sự có mặt của isoflavone bằng sắc ký bản mỏng và định lượng từng cấu tử
isoflavone nhờ HPLC. Kết quả, tác giả đã khẳng định được sự có mặt của isoflavone
và định lượng được 2 cấu tử có trong isoflavone là: Genistein và Daidzein [7].
Có thể nói, tính cho đến thời điểm hiện nay thì vẫn chưa có công trình nghiên
cứu nào tiến hành khai thác isoflavone từ bã đậu nành.
1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC [8]
1.4.1 Khái niệm
a)

Định nghĩa về sắc ký
Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906):
Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách

trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy.
Định nghĩa của IUPAC (1993):
Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố

giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo
một hướng xác định.
b) Sắc ký lỏng hiệu nâng cao-HPLC
Sắc kí lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ phát triển
nhanh nhất, được áp dụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách nào và có khả
năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kì phức tạp trong hóa học và trong sinh học.
Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục đóng một vai trò
quan trọng trong tất cả những lĩnh vực của phân tích hóa học, mặc dù có những tiến bộ
hơn nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các kỹ thuật vật lí đo
lường.
Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột, sắc
kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) nổi lên như một phương pháp được ưa thích cho kỹ
thuật tách và phân tích định lượng của rất nhiều loại mẫu.

11 | P a g e


Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg.
Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như không giới hạn do HPLC đã trở thành một công
cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp.
1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu
được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang
theo dọc hệ thống sắc kí (cột) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.
Trong HPLC pha động là pha lỏng, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ
trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn.
Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố
giữa pha động và pha tĩnh. Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm
chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết
quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình

các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh.
Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra
sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ.
Mẫu

Cột

Detector

Sắc
kí

12 | P a g e


Hình 1.4: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B
1.4.3. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ các cấu tử chất tan
Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ
thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân
tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là:
•

Thành phần và tính chất của pha động.

•

Kiểu và tính chất của pha tĩnh.

•

Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh.

•

Nhiệt độ

•

Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là:
o

Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự

khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt.
o Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng
kém.
1.4.4 Đặc tính sắc kí của chất tan
a)

Tính chất lưu giữ
Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động

và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu, trong đó:

▪

Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời

điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của
pic).

▪

Thời gian lưu tRi là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ
phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.
Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi:
V’R = VR –VM

hoặc t’R = tR – tM

(thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của
pha động).

13 | P a g e


Ở

đây tM là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu trong

pha động). Trong sắc kí khí, tM được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển đi
qua cột.
Tương ứng tM có thể tích VM biểu thị thể tích trống của cột (bao gồm cả thể tích
của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột
và thể tích detectơ).
b) Hệ số phân bố K
Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết
lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố
của chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động

và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có
một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được
cho bởi hệ số phân bố nhiệt động:
=

Ở đây CS và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng.
Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha.
Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là
tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột.
c)

Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được

sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột.
Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan
trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động:
′=

.

.

= .

Tỉ số VM/Vs được gọi là tỉ số thể tích pha

14 | P a g e