XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
1
-

MỞ ĐẦU

Ngày nay, loài người thường xuyên phải đối mặt với nhiều dịch bệnh
nguy hiểm có sức tàn phá dữ dội và có qui mô rộng lớn. Đặc biệt ở các nước
đang phát triển và kém phát triển, do điều kiện vệ sinh còn kém nên vấn đề
dịch bệnh lại xảy ra thường xuyên hơn. Nhưng, nhờ có sự phát triển của khoa
học kỹ thuật, mà con người đã tìm kiếm và tổng hợp được nhiều loại thuốc
mới, giúp con người chống lại các dịch bệnh nguy hiểm đó. Một trong số các
loại thuốc quan trọng mà con người đã tổng hợp được, đó là các thuốc kháng
sinh họ
β
-Lactam.
Trong y học hiện đại, các
β
-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan
trọng nhất chữa bệnh cho con người và động vật. Nhờ các thuốc kháng sinh
này mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như: dịch hạch,
tả, thương hàn và điều trị nhiều bệnh gây ra bởi các vi khuẩn.
Hiện nay nhu cầu dùng kháng sinh trên thế giới ngày càng tăng. Trong
việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, người bệnh và thầy thuốc đứng trước
hàng ngàn loại thuốc kháng sinh và mỗi thứ lại có các dạng bào chế khác
nhau để tiêm hoặc uống. Chính vì vậy, nhiều tổ chức, cá nhân đã cho ra đời
nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng gây nguy hại về sức khỏe và kinh
tế cho con người. Đại diện tổ chức Y tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang

chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các nước phát triển, 25% ở các nước đang phát
triển, trong đó các nước ở khu vực châu Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả
được phát hiện chủ yếu là các loại kháng sinh như Ampicillin,
Amoxicillin,…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam
ngày một diễn biến phức tạp nên công tác kiểm tra ngày một khó khăn hơn.
Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn
là một vấn đề rất quan trọng. Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
2
-

hàm lượng kháng sinh đạt hiệu quả cao như phương pháp HPLC, các phương
pháp quang học hay nhóm các phương pháp điện hóa. Von-ampe hòa tan là
phương pháp phân tích lượng vết có độ nhạy cao mà quy trình phân tích đơn
giản. Chính vì vậy tôi đã chọn đề tài: “Xác định một số hợp chất có hoạt tính
sinh học bằng phương pháp von-ampe hòa tan” làm nội dung nghiên cứu
cho luận văn tốt nghiệp của mình.
Trong điều kiện khả thi cho phép và tài liệu tham khảo được, trong luận
văn này tôi tập trung nghiên cứu quy trình phân tích cephalexin bằng phương
pháp von-ampe hòa tan, từ đó áp dụng phân tích một số mẫu thuốc có trên thị
trường.

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
3
-

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về Cephalexin
Kháng sinh β-Lactam là các chất kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-
lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem
trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và
cephalosporin.
Cephalexin là kháng sinh cephalosporin thế hệ I được chiết từ môi
trường nuôi cấy Cephalosporium aeremonium hoặc bán tổng hợp từ các
kháng sinh thiên nhiên.

1.1.1.Cấu trúc phân tử [1]

Cephalexin là hợp chất hữu cơ có công thức phân tử là C
16
H
17
N
3
O
4
S,
phân tử khối là 347,39 gam/mol. Cấu trúc phân tử có dạng như hình 1.1


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của cephalexin

1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng [2,29]
Cephalexin có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vỏ tế bào

vi khuẩn. Nó là kháng sinh uống, có phổ kháng khuẩn như cephalosporin thế
hệ I.

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
4
-

Cephalexin bền vững với pennicilinase của Staphylococcus, do đó có
tác dụng với các chủng Staphylococcus aureus tiết penicilinase kháng
penicillin (hay ampicilin). Cephalexin có tác dụng invitro trên các vi khuẩn
sau: Streptococcus beta tan máu: Staphylococcus, gồm các chủng tiết
coagulase (+), coagulase (-) và penicilinase; Streptococcus pneumoniae; một
số Escherichia coli; Proteus mirabilis; một số Klebsiella spp. Branhamella
catarhalis; Shigella. Haemophilus influenzae thường giảm nhạy cảm.
Cephalexin cũng có tác dụng trên đa số E. Coli kháng ampicillin
Hầu hết các chủng Enterrococcus và một ít chủng Staphylococcus
kháng cephalexin. Proteus indol dương tính, một số Enterobacter spp,
pseudomonas aeruginosa, Bacteroides spp, cũng thấy có kháng thuốc.
Theo số liệu ASTS 1997, cephalexin có tác dụng với Staphylococcus
aureus, salmonella, E.coli có tỉ lệ kháng cephalexin khoảng 50%; Proteus có tỉ
lệ kháng 25%; Enterobacter có tỉ lệ kháng 23%; Pseudomonas areuginosa có
tỉ lệ có tỉ lệ kháng khoảng 20%.

1.1.3. Dược động học [2, 29]
Cephalexin dường như được hấp thu hoàn toàn ở đường tiêu hóa và đạt
nồng độ đỉnh trong huyết tương vào khoảng 9 và 18
g
µ

/ml sau một giờ với
liều uống tương ứng 250 và 500mg; liều gấp đôi đạt nồng độ đỉnh gấp đôi.
Uống cephalexin cùng với thức ăn có thể làm chậm khả năng hấp thu nhưng
không làm ảnh hưởng tới tổng lượng hấp thu. Có tới 15% liều Cephalexin gắn
kết với protein huyết tương. Nửa đời trong huyết tương ở người lớn có chức
năng thận bình thường là 0,5-1,2 giờ, nhưng ở trẻ sơ sinh dài hơn (5 giờ); và
tăng khi chức năng thận suy giảm. Cephalexin phân bố rộng khắp cơ thể,
nhưng lượng trong dịch não tủy không đáng kể. Cephalexin qua được nhau
thai và bài tiết vào sữa mẹ với nồng độ thấp. Cephalexin không bị chuyển

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
5
-

hóa. Thể tích phân bố của cephalexin là 18lit/1,78m
2
diện tích cơ thể. Khoảng
80% liều dùng thải trừ ra nước tiểu ở dạng không đổi trong 6 giờ đầu qua lọc
cầu thận và bài tiết ở ống thận. Với liều 500mg nồng độ cephalexin trong
nước tiểu cao hơn 1mg/ml. Probenecid làm chậm bài tiết cephalexin trong
nước tiểu. Có thể tìm thấy cephalexin ở nồng độ có tác dụng trị liệu trong mặt
và một ít cephalexin có thể thải trừ qua đường này. Cephalexin được thải trừ
qua lọc máu và thẩm phân màng bụng từ 20 đến 50%.

1.1.4. Độ ổn định và bảo quản [2]
Nên giữ viên và nang cephalexin trong lọ kín, bảo quản ở nhiệt độ 15-
30
0

C và tránh ánh sáng.
Siro và dịch treo đã pha nước vẫn giữ được hiệu lực trong 10 ngày nếu
bảo quản ở nơi khô mát, trong tủ lạnh là tốt nhất. Siro đã pha có thể pha loãng
với nước sau đó nên dùng trong vòng 7 ngày.

1.2. Các phương pháp phân tích định lượng Cephalexin
1.2.1. Các phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất
quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…
Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng
nhiều khi xác định cephalexin, đặc biệt trong dược phẩm.
Wei Liu và cộng sự [35], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với
hệ luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp đã
phân tích Cephalexin đạt độ nhạy là 3.10
-7
M.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối
tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất
kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương
tự chất phân tích việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
6
-

trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn
chế của phương pháp này.

1.2.2. Các phương pháp điện hóa
Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu các kháng sinh bằng
phương pháp điện hóa nhưng không nhiều. Các phương pháp điện hóa thường
có thời gian phân tích nhanh, phương pháp có độ chọn lọc cao và có khả năng
phân tích với nồng độ nhỏ.
Theo [18], Ari Ivaska and Fredrik Nordström đã xác định Cephalexin
bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực làm việc Glassy
Cacbon và điện cực so sánh là cực Ag/AgCl, tại pH = 7,3 pic anot oxi hóa
của cephalexin xuất hiện tại +0,8V và tuyến tính trong khoảng nồng độ 10
-3
M
đến 5.10
-7
M.
Theo [6] các tác giả đã nghiên cứu định lượng cephalexin trong chế
phẩm thuốc bột bằng cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm đã
thu được kết quả tương đương với phương pháp HPLC. Với nghiên cứu này
các tác giả đã tìm ra điều kiện đo cephalexin bằng phương pháp cực phổ sóng
vuông là: phải thủy phân Cephalexin trong NaOH 0,1M, đo trong môi trường
có pH = 7, quét thế theo chiều âm, thế sóng thu được trong khoảng -600mV
đến -800mV, E
1/2
= -709mV. Trong khoảng nồng độ 1,2.10
-4
đến 7,2.10
-6

M
nồng độ cephalexin có độ tuyến tính cao với chiều cao pic. Phương pháp có
độ chính xác và độ lệch chuẩn nhỏ (R
2
= 0,9996 và RSD=0,45%) , độ đúng
đạt 99,7%.
Theo [20], các tác giả khẳng định cephalexin có thể xác định được bằng
phương pháp điện hóa trong cả môi trường axit và bazơ. Trong môi trường
HCl 0,1M cephalexin được đo bằng phương pháp DPP có E
pic
= -1V, giới hạn
phát hiện LOD = 2,88.10
-7
M. Trong môi trường kiềm ở pH = 8,3 cephalexin

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
7
-

được đo bằng phương pháp DPP có E
pic
= -0,72V, tuyến tính trong khoảng 10
-
7
đến 10
-5
M, giới hạn phát hiện đạt 2.10
-7

M.
Theo [30] các tác giả xử lí các kháng sinh cephalosporin trước khi đo
bằng cách cho tạo phức với các ion Cu (II), Pd(II) và Zn(II) sau đó đo von-
ampe sóng vuông thì thu được pic cao và rõ nét hơn rất nhiều. Giới hạn phát
hiện LOD có thể đạt 7.10
-10
M.
Theo [32], tác giả Qilong Li and Shouai Chen đã nghiên cứu xác định
cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan và đã thu được kết quả như
sau: Cephalexin phải được thủy phân trong môi trường NaOH 0,1M ở 100
0
C
sau 20 phút, sau đó tiến hành đo với thời gian điện phân là 60 giây thu được
E
pic
= -0,8V, giới hạn phát hiện có thể lên tới 5.10
-10
M.
Như vậy, các phương pháp điện hóa có thể phân tích được cephalexin
trong các chế phẩm thuốc hay trong các mẫu phẩm sinh học đều đạt được giới
hạn phát hiện rất nhỏ, thời gian phân tích tương đối nhanh và có thể phân tích
đồng thời nhiều chất.

1.2.3. Các phương pháp sắc ký
1.2.3.1. Sắc ký bản mỏng TLC
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để
kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều
mẫu song song một lúc rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là
một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên, như
trong [1, 2, 15] thì phương pháp này chủ yếu dùng để định tính các β-lactam.

1.2.3.2. Sắc ký điện di CE
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt
về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
8
-

đã được ứng dụng để tách và xác định kháng sinh Cephalexin trong nhiều đối
tượng mẫu khác nhau.
Theo [36], Yahya Mrestani và các cộng sự đã sử dụng phương pháp
CZE để xác định Cephalexin trong nước tiểu và trong mật. Quá trình xác định
được tiến hành một cách trực tiếp mà không cần xử lý mẫu, các mẫu chỉ việc
pha loãng trong hệ đệm có pH = 6 và bơm trực tiếp vào máy. Các tác giả đã
sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định cephalexin và thu được độ
chính xác cao.


1.2.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô
cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác
nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp
HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định Cephalexin
trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác
vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện
chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho

mục đích này, đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng
phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là
một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối
tượng phức tạp.
Theo [11, 12] các tác giả đã xây dựng được quy trình phân tích
Cephalexin trong huyết tương người tình nguyện bằng HPLC đạt giới hạn
định lượng LOQ = 1,7.10
-6
M và giới hạn phát hiện LOD = 5,5.10
-7
M. Hiệu
xuất
≈
100% và độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (RSD < 3%) chứng tỏ phương
pháp có độ đúng cao đáp ứng nhu cầu của phân tích sinh học.

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
9
-

1.3. Giới thiệu về phương pháp Von-ampe hòa tan (SV) [3,14,16]
1.3.1. Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan
Quy trình chung của phương pháp Von-ampe hòa tan gồm 2 giai đoạn
chính:
- Giai đoạn làm giàu: Chất phân tích được tập trung lên bề mặt điện
cực (dưới dạng kim loại hay hợp chất khó tan). Điện cực làm việc thường là
điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE), cực rắn đĩa quay bằng vật liệu trơ
(than thuỷ tinh, than nhão tinh khiết) hoặc cực màng thuỷ ngân trên bề mặt

cực rắn trơ (MFE).
- Giai đoạn hòa tan: hòa tan chất phân tích khỏi bề mặt điện cực làm
việc bằng cách quét thế theo chiều xác định (anot hoặc catot) đồng thời ghi
đường Von-ampe hòa tan bằng kỹ thuật điện hóa nào đó. Nếu quá trình hòa
tan là quá trình anot, thì lúc này phương pháp được gọi là Von-ampe hòa tan
anot (ASV) và ngược lại nếu quá trình hòa tan là quá trình catot thì phương
pháp được gọi là Von-ampe hòa tan catot (CSV).
Các phản ứng làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực rất phong
phú, nhìn chung gồm ba loại chính:
Làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực dưới dạng kết tủa kim loại:
M
n+
+ Hg + ne M(Hg)
hoặc M
n+
+ ne M
0
(trên bề mặt cực rắn trơ)
Giai đoạn hòa tan quét thế anot:
M(Hg) - ne M
n+
+ Hg
hoặc M
0
- ne M
n+

Trong phương pháp Von-ampe hòa tan để chọn được thế điện phân làm
giàu (E
dp

), người ta dựa vào phương trình Nernst hoặc một cách gần đúng dựa
vào giá trị thế bán sóng (E
1/2
) trên sóng cực phổ của chất phân tích. Ở đây E
dp

Quá trình catot
Quá trình catot
Quá trình anot

Quá trình anot

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
10
-
phải chọn âm hơn so với E
1/2
nếu quá trình là hòa tan anot hoặc dương hơn
nếu là hòa tan catot.
Làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực dưới dạng hợp chất khó
tan hoặc hợp chất với ion kim loại dùng làm điện cực hay ion nào đó trong
dung dịch.
Phương pháp này áp dụng cho cả anion và cation. Trong phương pháp
này, E
dp
được chọn dương hơn so với E
1/2
và nếu phân tích kim loại mà hợp

chất của nó với thuốc thử nào đó có thể kết tủa trên bề mặt điện cực làm việc,
chẳng hạn cực rắn trơ thì các phản ứng xảy ra như sau:
Giai đoạn làm giàu: giữ E
dp
không đổi:
M
n+
+ (n+m)R - me MR
n+m
↓
Giai đoạn hòa tan: quét thế catot
MR
n+m
↓ + me M
n+
+ (n+m)R
(R có thể là chất hữu cơ hoặc OH
-
, )
Phương pháp von-ampe hòa tan catot còn cho phép xác định các chất
hữu cơ hoặc các anion tạo được kết tủa với Hg(I) hoặc là Hg(II) khi dùng điện
cực làm việc là HMDE. Các phản ứng xảy ra như sau:
Giai đoạn làm giàu: giữ E
dp
không đổi
pHg (HMDE) + qX - ne Hg
p
X
q
(HMDE)

Giai đoạn hòa tan : quét thế catot
Hg
p
X
q
(HMDE) + ne pHg (HMDE) + qX
(X có thể là chất hữu cơ hoặc ion vô cơ như halogenua, S
2-
, MoO
4
2-
,
VO
3
2-
, PO
4
3-
…)
Làm giàu chất phân tích lên bề mặt dưới dạng phức hấp phụ.
Theo phương pháp này, chất cần phân tích tạo phức với một phối tử
nào đó trong dung dịch và được hấp phụ lên bề mặt điện cực. Phản ứng có thể
tóm tắt như sau:
Quá trình anot
Quá trình catot
Quá trình anot
Quá trình catot

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới

-
11
-
Giai đoạn làm giàu: giữ E
dp
không đổi
Trong trường hợp đơn giản nhất, Me
n+
phản ứng với L theo phản ứng
dưới, phản ứng này xảy ra trong dung dịch và đây là giai đoạn hóa học của
quá trình:
M
n+
+ nL
ˆ ˆ †
‡ ˆ ˆ
ML
n
n+
(dd); dung dịch
Tiếp theo, phức hình thành hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc
ML
n
n+

ˆ ˆ †
‡ ˆ ˆ
ML
n
n+

(hp); hấp phụ
Sự hấp phụ phối tử L xảy ra trước khi tạo thành phức
nL (dd)
ˆ ˆ †
‡ ˆ ˆ
nL (hp)
Sau đó, phối tử đã hấp phụ phản ứng với M
n+
(giai đoạn hoá học):
M
n+
+ nL (hp)
ˆ ˆ †
‡ ˆ ˆ
ML
n
n+
(hp)
Giai đoạn hòa tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc
này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo phản ứng sau:
ML
n
n+
(hp) + ne → M + nL
Đường von-ampe hòa tan thu được có dạng peak. Thế đỉnh (E
p
) và
cường độ dòng hòa tan (I
p
) phụ thuộc vào các yếu tố như: nền điện ly, pH,

chất tạo phức, bản chất điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa
tan.
Trong những điều kiện xác định, E
p
đặc trưng cho bản chất điện hóa
của chất phân tích và do đó dựa vào E
p
có thể phân tích định tính. I
p
tỷ lệ
thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch theo phương trình:
I
p
= kC
Trong đó k là hệ số tỷ lệ.
Như vậy qua việc đo cường độ dòng ta có thể xác định được nồng độ
chất cần phân tích nếu biết chính xác giá trị của k



Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
12
-
* Ưu điểm của phương pháp von-ampe hòa tan
So sánh các phương pháp phân tích vết khác, phương pháp von-ampe
hòa tan có những ưu điểm sau:
-Phương pháp von-ampe hòa tan có khả năng xác định đồng thời nhiều
kim loại ở những nồng độ cỡ vết và siêu vết.

-Thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan không đắt, nhỏ gọn. So
với các phương pháp khác, phương pháp von-ampe hòa tan rẻ nhất về mặt chi
phí đầu tư cho thiết bị. Mặt khác, thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan
dễ thiết kế để phân tích tự động, phân tích tại hiện trường và ghép nối làm
detector cho các phương pháp phân tích khác.
-Phương pháp von-ampe hòa tan có quy trình phân tích đơn giản:
không có giai đoạn tách, chiết hoặc trao đổi ion nên tránh được sự nhiễm bẩn
mẫu hoặc làm mất chất phân tích do vậy giảm thiểu sai số. Mặt khác, có thể
giảm thiểu ảnh hưởng của các nguyên tố cản trở bằng cách chọn điều kiện thí
nghiệm thích hợp như: thế điện phân làm giàu, thời gian làm giàu, thành phần
nền, pH.
-Khi phân tích theo phương pháp von-ampe hòa tan anot không cần đốt
mẫu nên phương pháp von-ampe hòa tan thường được dùng để kiểm tra chéo
các phương pháp AAS và ICP-AES khi có những đòi hỏi cao về tính pháp lý
của kết quả phân tích.
-Trong những nghiên cứu về động học và môi trường, phương pháp
von-ampe hòa tan có thể xác định dạng tồn tại của các chất trong môi trường,
trong khi đó các phương pháp khác như AAS, ICP-AES, NAA không làm
được điều đó.
* Phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ
Phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ là phương pháp bổ xung cho
phương pháp von-ampe hoà tan anot, và phương pháp này ngày càng được

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
13
-
đẩy mạnh và ứng dụng rộng rãi vì nó có thể xác định lượng vết và siêu vết các
chất vô cơ và hữu cơ mà phương pháp von-ampe hoà tan anot không thể hoặc

khó xác định. về cơ sở lý thuyết, phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ
khác biệt cơ bản với phương pháp von-ampe hoà tan anot ở cơ chế của phản
ứng làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất lên bề mặt điện cực làm việc). Nói
chung nó bao gồm ba giai đoạn: Giai đoạn tạo thành, giai đoạn hấp phụ và
giai đoạn khử hoạt động bề mặt của kim loại. Cơ chế tổng quát của giai đoạn
làm giàu trong phương pháp AdSV như sau: Trước hết phức của ion kim loại
với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi thêm phối tử vào dung dịch phân
tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp phụ lên ranh giới tiếp xúc
dung dịch- điện cực làm việc. Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm
việc được giữ không đổi. Hầu hết các nghiên cứu áp dụng phương pháp
AdSV đều dùng điện cực làm việc là điện cực HMDE.
Trong phương pháp AdSV, khi ghi dòng von-ampe hoà tan, có thể sử
dụng tất cả các kỹ thuật ghi đã được biết đến (DPP, SqW, von-ampe bậc
thang, von-ampe dòng xoay chiều hoà tan bậc một, ). Tín hiệu đỉnh trên
đường von-ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV.
Theo Pihlar, Valenta và Nurnberg tín hiệu von-ampe hoà tan tỉ lệ thuận với
nồng độ bề mặt của phức được hấp thụ lên bề mặt điện cực làm việc theo
phương trình:
Q= n.F.S.C
0

Trong đó: Q (C) là điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp
phụ.
N là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng
F (C/mol) là hằng số Faraday
S (Cm
2
) là diện tích bề mặt điện cực làm việc

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010

Học viên: Phạm Văn Thới
-
14
-
C
0
(mol/Cm
2
) là nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên bề
mặt điện cực.
Với tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh I
p
tỉ lệ thuận với Q, nên I
p
tỉ lệ
với S và C
0
. Vì vậy C
0
tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C),
nên I
p
tỉ lệ với S và C: I
p
~ S.C. Như vậy để nâng cao độ nhạy, có thể tăng
diện tích bề mặt hoặc tăng thời gian hấp phụ là giàu.
Do có những điểm khác biệt về bản chất của phương pháp nên ngoài
những ưu điểm giống như phương pháp von-ampe hoà tan, phương pháp
AdSV còn có những ưu điểm riêng như:
- Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với

phương pháp ASV và CSV: Từ những hiểu bíêt về hoá học phức chất, có thể
lựa chọn được thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với các kim loại cần phân
tích và như vậy có thể sử dụng nhiều thuốc thử tạo phức khác nhau để xác
định rất nhiều kim loại.
- Có thể xác định được tổng kim loại hoà tan trong nước và thươngf đạt
LOD thấp hơn so với phương pháp ASV và CSV: Bằng cách chọn thuóc thử
tạo phức rất bền với kim loại cần phân tích sẽ xác định được tổng kim loại
hoà tan mà không cần xử lí mẫu. Điều này tránh được sự nhiễm bẩn mẫu và
do đó LOD thấp hơn.

1.3.2.Các điện cực làm việc thường dùng trong phương pháp von-
ampe hòa tan
Bình điện phân sử dụng trong phương pháp SV thường gồm 3 điện cực:
-Cực so sánh: thường dùng cực bạc- bạc clorua bão hòa
(Ag/AgCl/KCl
bh
) hoặc cực calomen bão hòa (Hg/Hg
2
Cl
2
/KCl
bh
).
-Cực phụ trợ (cực đối): thường dùng cực Pt hay cực Cacbon.
-Cực làm việc thường dùng các điện cực dưới đây:


Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-

15
-
1.3.2.1. Điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và cực giọt thủy ngân
tĩnh (SMDE)
Cực HMDE là loại điện cực dùng phổ biến nhất trong phương pháp
SV. Nó là một giọt thuỷ ngân hình cầu có kích thước nhỏ được treo ở cuối
của một mao quản có đường kính trong 0,05-0,07mm. Sau mỗi phép đo, giọt
thuỷ ngân bị cưỡng bức rơi khỏi mao quản và nó được thay thế bằng giọt mới
tương tự.
Một kiểu điện cực giống với cực HMDE là cực giọt thuỷ ngân tĩnh
SMDE. Cực HMDE và cực SMDE có ưu điểm là có quá thế hydro lớn:
khoảng -1,5V trong môi trường kiềm và trung tính, -1,2V trong môi trường
axit, nên khoảng điện hoạt rộng và do đó cho phép nghiên cứu phân tích được
nhiều chất. Mặt khác, cực HMDE và SMDE cho các kết quả có độ chính xác
và độ lặp lại cao. Chúng được ứng dụng rộng rãi để xác định hàng chục kim
loại cũng như á kim Cd,Cu, Pb, Zn, In, Bi, Sb, Se, các halogenua và nhiều
hợp chất hữu cơ theo phương pháp ASV hay CSV. Điểm hạn chế của điện
cực HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra giọt thuỷ ngân có kích
thước lặp lại một cách hoàn hảo. Ngoài ra chúng không xác định được những
kim loại có thế âm hơn thủy ngân như Au, Ag.

1.3.2.2. Điện cực màng thuỷ ngân (MFE)
Cực MFE là một màng mỏng thuỷ ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ
(thường là cực rắn đĩa quay) có đường kính từ 2-4mm và làm bằng các vật
liệu trơ như than thuỷ tinh (glassy carbon), graphit, than nhão (paste
carbon), Cực MFE được chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch
Hg(II) 10
-3
- 10
-4

M trên cực rắn đĩa ở thế thích hợp (khoảng –0,8 ÷ -1,3V so
với cực Ag/AgCl/KCl
bh
hoặc Hg/Hg
2
Cl
2
/KCl
bh
) và trong thời gian thích hợp

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
16
-
(điển hình là 1-2 phút). Bằng cách như vậy, cực MFE có thể được hình thành
theo hai kiểu: in situ và ex situ:
-Theo kiểu in situ, dung dịch Hg(II) được thêm vào dung dịch phân tích
như vậy khi điện phân làm giàu, cực MFE được hình thành đồng thời với qua
trình tập trung chất lên cực MFE.
-Theo kiểu ex situ, cực MFE được tạo thành bằng cách điện phân dung
dịch Hg(II) như trên, sau đó tia rửa cẩn thận bằng nước sạch, rồi nhúng cực
vào dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu. Cực MFE dạng ex situ
thường có bề dày màng thuỷ ngân lớn hơn so với dạng in situ.
Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là một vấn đề hấp dẫn các
nhà nghiên cứu. Khi khảo sát các cực MFE được tạo ra theo kiểu in situ và ex
situ, H. Ping Wu cho rằng: cực MFE như một màng mỏng gồm các giọt thuỷ
ngân nhỏ li ti và liên tục trên cực rắn đĩa; kích thước các giọt thuỷ ngân phụ
thuộc vào lượng thuỷ ngân trên bề mặt cực rắn đĩa và thường khoảng từ

<0,1µm đến 1µm.
Ngoài những ưu điểm giống như đối với cực HMDE, cực MFE còn có
một số ưu điểm khác: do nồng độ kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao
hơn, tốc độ khuếch tán các kim loại ra khỏi cực MFE nhanh hơn và có đặc
điểm của quá trình điện hóa lớp mỏng; mặt khác có thể sử dụng cực MFE
quay, nên điều kiện đối lưu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực
MFE có độ nhạy và độ phân giải cao hơn cực HMDE, đặc biệt khi phân tích
các kim loại tan được trong thuỷ ngân tạo thành hỗn hống. Do đó độ nhạy của
phương pháp tăng lên và trong nhiều trường hợp tránh được sự tạo thành
dung dịch rắn và hợp chất gian kim loại.
Nhược điểm: độ lặp lại và độ phục hồi của các phép đo khi đi từ cực
MFE này đến cực MFE khác thường kém hơn so với các cực HMDE và
SMDE.

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
17
-
1.3.3.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan
1.3.3.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính (Linear Scan
Voltammetry)
Trong kỹ thuật này, thế được quét tuyến tính theo thời gian như trong
phương pháp cực phổ cổ điển, nhưng tốc độ quét lớn hơn (khoảng từ 10-30
mV/s). Đồng thời ghi dòng là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc. Khi
dùng cực HMDE với tốc độ quét thế > 20mV/s, quá trình oxy hóa khử kim
loại (khi phân tích theo phương pháp ASV) là thuận nghịch, thì theo
Nicholson và Shain, Reinmuth dòng đỉnh hòa tan tuân theo phương trình:
Ip= D
1/2

.t
dp
.C. [k
1
.n
2/3
.v
1/2
.r – k
2
.D
1/2
.n]
Trong đó, Ip (A) - độ lớn dòng đỉnh trên đường von-ampe hòa tan
K
1
và k
2
- hằng số
n - số e trong phản ứng điện cực
D (cm
2
/s) - hệ số khuếch tán của kim loại trong hỗn hống
r (cm) - bán kính của HMDE
t
dp
(s) - thời gian điện phân
v (mV/s) - tốc độ quét thế
C (mmol/L)- nồng độ ion kim loại trong dung dịch phân tích
Vries và Van Dalen cho rằng khi phân tích theo phương pháp ASV: cực

MFE có độ nhạy và độ phân giải đỉnh cao hơn so với cực HMDE. Roe và
Toni cũng có kết luận tương tự và đưa ra phương trình dòng đỉnh trên cực
MFE (nếu cực MFE có bề dày màng thuỷ ngân < 10μm và tốc độ quét thế <
1V/min):
Ip = n
2
.F
2
.S.
l
.C.
v
e


Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
18
-
Trong đó, S (cm
2
) và
l
(cm) là diện tích và bề dày màng thuỷ ngân, e
là cơ số của logarit tự nhiên, F (C/mol) là hằng số Faraday, các đại lượng
khác tương tự trên.
Nghiên cứu phương pháp ASV trên cực rắn đĩa, Brainina đã thiết lập
được các phương trình dòng đỉnh và thế đỉnh đối với hệ thuận nghịch và bất
thuận nghịch. Nhưng các phương trình đó rất phức tạp, nên khó sử dụng trong

phân tích.
Kỹ thuật von-ampe quét thế tuyến tính có nhược điểm là độ nhạy chưa
cao, LOD còn lớn, do nó còn bị ảnh hưởng nhiều của dòng tụ điện.

1.3.3.2. Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP(Differential Pulse
Voltammetry)
Kỹ thuật DP là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay. Theo kỹ
thuật này, những xung thế có biên độ như nhau khoảng 10-100 mV và bề rộng
xung không đổi khoảng 30-100 ms được đặt chồng lên mỗi bước thế. Dòng
được đo hai lần: trước khi nạp xung (I
1
) và trước khi ngắt xung (I
2
), khoảng
thời gian đo dòng thông thường là 10-30 ms. Dòng thu được là hiệu giá trị của
hai dòng và I được ghi là hàm của thế đặt lên cực làm việc.

Hình 1.2: Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe xung vi phân

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
19
-
Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự
tăng dòng Faraday (I
f
) và dòng tụ điện (I
c
). Dòng tụ điện giảm nhanh hơn

nhiều so với dòng Faraday vì I
c
~ e
-1/RC*
và I
f
~ t
-1/2
, ở đây t là thời gian, R là
điện trở, C* là điện dung vi phân lớp kép. Theo cách ghi dòng như trên, dòng
tụ điện được ghi trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung là gần như nhau
và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là dòng Faraday. Như vậy, kỹ thuật
DP cho phép loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tự điện, dẫn đến LOD thấp hơn
khoảng 1000 lần khi dùng cực HMDE. Mặt khác, với kỹ thuật DP cực MFE
đạt được LOD thấp hơn khoảng 3-5 lần so với cực HMDE.

1.3.3.3.Kỹ thuật von-ampe sóng vuông SqW (Square Wave
voltammetry)
Kỹ thuật này được Barker đề ra từ năm 1958, theo kỹ thuật này điện
cực giọt thuỷ ngân được phân cực bởi một điện áp một chiều biến thiên đều
theo thời gian có cộng thêm một điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số
khoảng 200Hz và biên độ có thể thay đổi từ 1-50 mV. Trong mỗi chu kỳ xung
dòng được đo ở hai thời điểm: thời điểm 1 ứng với dòng dương I
1
, thời điểm 2
ứng với dòng âm I
2
. Dòng thu được là hiệu của hai dòng I
1
và I

2
, theo cách ghi
như vậy có thể loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tụ điện.

Hình 1.3. Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe sóng vuông

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
20
-
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu
Mục đích nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình phân tích định
lượng cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan, từ đó áp dụng xác
định hàm lượng Cephalexin trong một số mẫu thuốc trên thị trường. Vì vậy
nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Khảo sát các điều kiện thủy phân
2. Khảo sát các phương pháp ghi đường hòa tan
3. Khảo sát các điều kiện đo tối ưu
4. Khảo sát ảnh hưởng của các kháng sinh
β
-lactam khác
5. Xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp
6. Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường

2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất
2.2.1. Thiết bị
Thiết bị phân tích điện hoá đa năng μ-Autolap ghép nối với hệ 3 điện

cực 663 của Metrohm. Hệ điện cực gồm 3 điện cực sau:
- Điện cực so sánh là điện cực Ag/AgCl
- Điện cực làm việc là điện cực giọt thuỷ ngân treo HMDE
- Điện cực phù trợ là điện cực Cacbon
Máy đo pH của hãng Orion research.

2.2.2. Dụng cụ
Pipet: 1ml; 2ml; 5ml
Bình định mức: 25ml; 50ml; 100ml; 500ml
Cốc nhỏ: 250ml


Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
21
-
2.2.3. Hoá chất
Axit axetic đặc
Natriaxetat
NaOH
H
3
PO
4

H
3
BO
3

Cephalexin, Cephaclor, Cephotaxim chuẩn và mẫu thuốc có trên thị
trường.


2.2.4. Chuẩn bị dung dịch
Ø Pha dung dịch đệm axetat
- Pha dung dịch CH
3
COOH 0,1M: Lấy 0,6ml axit axetic 98% định mức
thành 100ml dung dịch bằng nước cất 2 lần.
- Pha dung dịch CH
3
COONa 0,1M: Cân 1,3608gam muối
CH
3
COONa.3H
2
O hoà tan và định mức thành 100ml bằng nước cất 2 lần.
Dung dịch đệm axetat được pha bằng cách trộn hai dung dịch trên theo
tỉ lệ thích hợp để thu được pH tương ứng.

Ø Pha dung dịch đệm vạn năng
- Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp ba axit H
3
PO
4
; H
3
BO

3
và CH
3
COOH
cùng ở nồng độ 0,04M.
Lấy 2,24ml dung dịch H
3
PO
4
98% + 2,4ml dung dịch CH
3
COOH 98%
+ 3,12gam H
3
BO
3
rồi định mức thành 1lit.
- Dung dịch B. Là dung dịch NaOH 0,2M. Lấy 4 gam NaOH rắn hoà tan
vào nước cất rồi định mức thành 500ml.
- Pha dung dịch đệm vạn năng bằng cách trộn hai dung dịch A và B theo tỉ
lệ thích hợp.


Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
22
-
Ø Pha dung dịch chất chuẩn 10
-2

M
- Cân 347,39mg cephalexin chuẩn, pha bằng nước hai lần cất rồi định
mức thành 100ml
- Cân 367,8mg cephaclor chuẩn, pha bằng nước cất hai lần rồi định
mức thành 100ml
- Cân 445,47mg cephotaxim chuẩn, pha bằng nước cất hai lần rồi
định mức thành 100ml
Các dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch nồng độ
thấp được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày.

Ø Pha dung dịch mẫu thực
- Lấy 5 viên nang cephalexin 500mg của công ty MKP trộn đều rồi
đem cân lấy 347,39 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành
100ml ta thu được dung dịch gốc 10
-2
M. Các dung dịch có nồng độ
thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc.
- Lấy 5 viên nang cephalexin 500mg của công ty GLM trộn đều rồi
đem cân lấy 347,39 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành
100ml ta thu được dung dịch gốc 10
-2
M. Các dung dịch có nồng độ
thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
23
-
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện thủy phân
3.1.1. Khảo sát sự xuất hiện pic của cephalexin
Về mặt lý thuyết, một chất muốn xác định được bằng phương pháp
von-ampe hòa tan thì bản thân nó hoặc các sản phẩm trung gian hình thành từ
chất đó phải có hoạt tính điện hóa.
Theo các tài liệu tham khảo được, thì bản thân Cephalexin không có
hoạt tính điện hóa nhưng sản phẩm của phản ứng thủy phân bằng dung dịch
NaOH thì lại có hoạt tính điện hóa theo cơ chế sau:
Ban đầu khi thủy phân xảy ra quá trình mở vòng
β
-Lactam như sơ đồ sau:



A
N
là các bazơ như NaOH,…. Sản phẩm mở vòng (gọi là X) sẽ kết hợp
với Hg tạo sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực (anot) trong giai đoạn làm
giàu.
Hg -2e + X = HgX

Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-
24
-
Quá trình hòa tan sẽ là quá trình ngược lại và xẩy ra trên catot, vì vậy
được gọi là hòa tan catot.
Vì vậy, tôi tiến hành khảo sát trong hai trường hợp: Đo trực tiếp trong

một số dung dịch chất nền và đo sau khi đã được thủy phân bằng dung dịch
NaOH 0,1M.
Khi đo trực tiếp Cephalexin trong nền đệm axetat và nền đệm vạn năng
ở các pH < 7 thì không thấy có pic xuất hiện.
Khi đo trực tiếp trong nền đệm axetat và đệm vạn năng ở các pH > 7 và
trong nền là dung dịch NaOH 0,1M đã có pic xuất hiện nhưng pic không cao
và không cân đối (hình 3.1).
-400m-500m-600m-700m-800m-900m-1.00
U (V)
-80.0n
-60.0n
-40.0n
-20.0n
I (A)

Hình 3.1. Phổ thu được khi đo trực tiếp trong nền có pH >7
(1) đệm axetat; (2) đệm vạn năng; (3) dung dịch NaOH

Như trên đã phân tích, trong môi trường kiềm cephalexin sẽ bị thủy
phân. Sự xuất hiện pic trên hình 3.1 có thể được lí giải là do sản phẩm thủy
1

2

3


Luận văn thạc sỹ khoa học Năm 2010
Học viên: Phạm Văn Thới
-

25
-
phân của cephalexin đã có phản ứng điện hóa. Do đó tôi tiến hành đo sau khi
đã được thủy phân bằng dung dịch NaOH 0,1M trong khoảng thời gian 30
phút, phổ thu được khi đo đã có pic xuất hiện và tương đối cao. Sự xuất hiện
pic sau khi đã được thủy phân càng chứng tỏ phản ứng điện hóa có được là do
vòng
β
-Lactam đã được mở vòng. Để kiểm tra pic xuất hiện có phải là pic
của chất phân tích hay không, tôi cho thêm chất phân tích vào dung dịch đo,
sau khi sự thủy phân xảy ra tôi đo thì thấy pic xuất hiện cao hơn và có cùng vị
trí với pic ban đầu (hình 3.2).

-400m -600m -800m -1.00 -1.20
U (V)
-150n
-100n
-50.0n
0
I (A)

Hình 3.2. Phổ thu được khi đo trong dung dịch NaOH
sau khi cephalexin đã thủy phân 30 phút với nồng độ 10
-7
M và 2.10
-7
M

Như vậy, píc xuất hiện chính là pic của sản phẩm thủy phân Cephalexin
trong môi trường NaOH. Do đó, trong các lần đo sau tôi tiến hành đo trong

nền là dung dịch NaOH và đo sau khi đã được thủy phân.
10
-
7

2.10
-
7