Nghiên cứu một số chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng cao chất lượng dầu (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***

NGUYỄN THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC
KHÁNG VI KHUẨN KHỬ SULFATE NHẮM ỨNG DỤNG
CHỐNG ĂN MÕN VÀ NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG DẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC
KHÁNG VI KHUẨN KHỬ SULFATE NHẮM ỨNG DỤNG
CHỐNG ĂN MÕN VÀ NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG DẦU
Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học)
Mã số: 8 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa

Hà Nội – 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng trong luận văn này là trung thực và
chưa được nhóm nghiên cứu nào khác công bố dưới bất kỳ hình thức nào.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh
giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài
liệu tham khảo.

Tác giả

Nguyễn Thanh Bình


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa, Trưởng
phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và
kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và làm
luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô Khoa đào tạo sau đại học, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Đặc biệt là các thầy cô chuyên ngành Vi sinh
vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Vi sinh vật

dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp đúng thời hạn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người thân
luôn bên cạnh động viên và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành tốt luận văn.

Hà Nội, ngày …tháng… năm 2018

Nguyễn Thanh Bình


iii

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
PHẦN 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 4
1.1. Vai trò của ngành công nghiệp dầu khí ..................................................... 4
1.2. Vi khuẩn khử sulfate (KSF) ...................................................................... 5
1.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử sulfate đến quá trình ăn mòn thiết bị bằng
kim loại và chất lượng dầu trong công nghiệp dầu khí .................................... 6
1.4. Các phương pháp hạn chế vi khuẩn khử sulfate thường dùng trong công
nghiệp dầu khí ................................................................................................. 8
1.5. Chất hoạt động bề mặt sinh học .............................................................. 10
1.5.1. Khái niệm chất hoạt động bề mặt sinh học ....................................... 10
1.5.2. Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học ......................................... 10
1.5.3. Tính chất của chất hoạt động bề mặt sinh học................................... 12
1.5.4. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học . 14
1.5.5. Ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học .................................. 15

1.6. Khả năng kháng vi khuẩn gây hại của chất hoạt động bề mặt sinh học tạo
ra từ vi sinh vật.............................................................................................. 15
1.7. Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn khử sulfate bằng chất hoạt
động bề mặt sinh học tạo ra từ vi sinh vật...................................................... 16
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 19
2.1. Vật liệu ................................................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ....................................................................... 20
2.2.1. Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi sinh vật nghiên cứu...20
2.2.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH bằng chỉ số nhũ hóa E2421
2.2.3. Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp CHĐBMSH có
khả năng ức chế vi khuẩn KSF ................................................................... 22


iv
2.2.4. Xác định đặc điểm sinh hóa của chủng nghiên cứu bằng kít chuẩn sinh
hóa API ...................................................................................................... 22
2.2.5. Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trình tự gen
16S rRNA .................................................................................................. 22
2.2.6. Nuôi cấy và làm giàu vi khuẩn KSF ................................................. 23
2.2.7. Xác định hàm lượng sulfide.............................................................. 23
2.2.8. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
CHĐBMSH của chủng vi khuẩn lựa chọn .................................................. 24
2.2.9. Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sự sinh tổng hợp CHĐBMSH từ
chủng lựa chọn ........................................................................................... 24
2.2.10. Lên men, tách chiết CHĐBMSH .................................................... 25
2.2.11. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từ
chủng vi khuẩn lựa chọn ............................................................................ 25
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 27
3.1. Lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề
mặt sinh học cao............................................................................................ 27

3.2. Sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật tổng hợp CHĐBMSH ức chế vi
khuẩn khử sulfate .......................................................................................... 28
3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc điểm sinh hóa của
chủng vi khuẩn 310-RP3-1 ............................................................................ 29
3.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chất hoạt
động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn ....................................... 32
3.5. Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt
sinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn ........................................................... 41
3.6. Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩn
lựa chọn ........................................................................................................ 42
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHĐBMSH

Chất hoạt động bề mặt sinh học

KSF

Khử sulfate

VSV

Vi sinh vật

mN/m

Millinewton / meter (đơn vị đo sức căng bề mặt)

Cs

Cộng sự

IARC

Cơ quan nghiên cứu ung thư Quốc tế

GDP

Gross Domestic Product (tổng sản lượng quốc nội)

DO

Diesel Oil

CFU

Colony-forming unit


vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH theo nguồn gốc VSV [36]. ............................ 11
Bảng 3.1. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng vi khuẩn và ..... 27
Bảng 3.2. Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tổng hợp bởi 10
chủng VSV nghiên cứu .................................................................................... 29

Bảng 3.3. Kết quả các phản ứng sinh hoá của kit chuẩn API 50 CHB của chủng
310-RP3-1 ........................................................................................................ 31
Bảng 3.4. Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp CHĐBMSH của
chủng 310-RP3-1 ............................................................................................. 41
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển
của chủng vi khuẩn KSF D. vulgaris DSM644 theo thời gian .......................... 43
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển
của chủng vi khuẩn KSF Desulfovibrio sp. RP3-303 theo thời gian ................. 44


vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh mô phỏng quá trình ăn mòn kim loại của vi khuẩn KSF ...... 7
Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng 310-RP3-1 ......................................... 30
Hình 3.2.Chủng 310-RP3-1 sau khi sốc nhiệt (80oC, 15 phút) .......................... 30
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng 310-RP3-1 dưới kính hiển vi điện tử
quét ............................................................................................................ 30
Hình 3.4. Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn 310-RP3-1 ................................ 32
Hình 3.5. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1
trên các nguồn carbon khác nhau ...................................................................... 33
Hình 3.6. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với nguồn carbon ...... 33
Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các nồng
độ glucose khác nhau ....................................................................................... 34
Hình 3.8. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các nồng độ glucose
khác nhau ......................................................................................................... 34
Hình 3.9. Khả sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với
các nguồn nitơ khác nhau ................................................................................. 35
Hình 3.10. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các nguồn nitơ
khác nhau ......................................................................................................... 35
Hình 3.11. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP31 với các nồng độ NaNO3 khác nhau ................................................................ 37

Hình 3.12. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các nồng độ
NaNO3 khác nhau............................................................................................. 37
Hình 3.13. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP31 với các giá trị pH khác nhau .......................................................................... 38
Hình 3.14. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các giá trị pH ..... 38
Hình 3.15. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP31 với các nhiệt độ khác nhau ............................................................................ 40
Hình 3.16. CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310-RP3-1 với các nhiệt độ ....... 40


viii
Hình 3.17. Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp CHĐBMSH của
chủng 310-RP3-1 theo thời gian ....................................................................... 41
Hình 3.18. Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển
của chủng vi khuẩn KSF D. vulgaris DSM644 theo thời gian .......................... 43
Hình 3.19. Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển
của chủng vi khuẩn KSF Desulfovibrio sp. RP3-303 theo thời gian ................. 44


1
MỞ ĐẦU
Dầu khí là ngành công nghiệp mũi nhọn, mang lại nguồn lợi to lớn cho
nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên, trên
thực tế, sản lượng dầu thu được từ khai thác sơ cấp (tự phun bằng chính năng
lượng tự nhiên của vỉa) chỉ chiếm phần rất nhỏ tổng lượng dầu khai thác.
Nguyên nhân là do độ nhớt, sức căng bề mặt làm cho tính thấm và linh động
của dầu mỏ thấp, dẫn đến sản lượng dầu khai thác chưa cao. Do đó, việc khai
thác dầu thứ cấp (bơm ép nước biển hay nén khí vào giếng khoan để duy trì áp
suất vỉa) nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi dầu đang được ứng dụng rộng rãi.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy, vi khuẩn khử sulfate (KSF) là một
trong những nhóm vi khuẩn xuất hiện phổ biển trong nước biển. Khi nước biển
được sử dụng để bơm ép vào lòng vỉa, các vi sinh vật (VSV) gặp điều kiện

thuận lợi sẽ phát triển tạo thành các màng biofilm gây bít nhét vỉa, làm giảm
khả năng tiếp nhận nước bơm ép. Vi khuẩn KSF sinh ra khí H2S không chỉ là
tác nhân gây ăn mòn, phá hỏng hệ thống đường ống, làm tắc các thiết bị khoan
và bơm ép nước mà còn làm thối dầu, gây khó khăn cho việc tách nước từ dầu
và làm giảm chất lượng dầu dẫn đến cản trở việc thu hồi dầu. Hơn nữa, khí H2S
còn gây độc hại trực tiếp tới con người và sinh vật sống.
Do đó, bên cạnh việc tìm kiếm các giải pháp để nâng cao hiệu suất khai
thác dầu, các công ty dầu khí trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang tăng
cường các biện pháp diệt vi khuẩn KSF, nhóm vi khuẩn gây tác hại nghiêm
trọng đến quá trình khai thác, vận chuyển cũng như lưu trữ dầu làm giảm chất
lượng và giá trị thương mại của dầu.
Hàng năm, nhu cầu sử dụng chất diệt khuẩn trong ngành khai thác dầu
khí là rất lớn. Đối với các đơn vị khai thác trong nước, chỉ tính riêng tại Liên
doanh dầu khí Việt-Nga (Vietsovpetro) mỗi năm sử dụng hàng trăm tấn chất
diệt khuẩn cho nước bơm ép. Các chất diệt khuẩn được sử dụng để ức chế vi


2
khuẩn nói chung và vi khuẩn KSF nói riêng thường được tổng hợp từ các hợp
chất hóa học như chloride, glutaraldehyde, isothiazolones, formaldehyde và các
muối amoni bậc bốn. Các hợp chất này rất độc hại đối với con người và hệ sinh
thái, gây ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất của sinh vật sống. Vì vậy, việc
tìm kiếm các “chất diệt khuẩn xanh” (green biocides) có nguồn gốc từ VSV
hiệu quả và thân thiện với môi trường đang thu hút được sự quan tâm nghiên
cứu của các nhà khoa học trên thế giới.
Trong công nghiệp dầu khí, người ta thường sử dụng các chất hoạt động
bề mặt sinh học (CHĐBMSH) từ VSV có khả năng phân hủy dầu để nâng cao
hiệu suất thu hồi dầu tam cấp thay cho các chất hoạt động bề mặt hóa học đắt
tiền, độc hại với môi trường sống và con người. Một ứng dụng tiềm năng nữa
của CHĐBMSH sinh tổng hợp từ VSV phải kể đến là khả năng kháng khuẩn.

Trên thế giới, đã có các công trình công bố về khả năng kháng khuẩn của
CHĐBMSH sinh tổng hợp từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, B. licheniformis,…),
nấm men (Candida albicans, C. bombicola,…), hay xạ khuẩn (Streptomyces
lunalinharesii…). Các CHĐBMSH này đã được ứng dụng trong y dược và công
nghiệp thực phẩm, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, đồng thời ức chế
ngăn chặn sự kết dính và tạo màng sinh học của các nhóm vi khuẩn gây hại (E.
coli, Staphylococcus aureus…).
Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn đề cập ở trên, đề tài luận văn
“Nghiên cứu một số chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động
bề mặt sinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn
và nâng cao chất lượng dầu” mở ra hướng nghiên cứu trong việc tạo
CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng cao
chất lượng dầu. Kết quả thu được từ đề tài luận văn có ý nghĩa khoa học và thực
tiễn nhằm ứng dụng trong công nghiệp dầu khí.


Mục tiêu nghiên cứu
Lựa chọn chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt

sinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng cao
chất lượng dầu.


3


Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Sàng lọc tuyển chọn một số chủng VSV tạo CHĐBMSH

kháng vi khuẩn KSF

Nội dung 2: Phân loại chủng VSV lựa chọn
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng tạo
CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF của chủng lựa chọn
Nội dung 4: Lên men và thu nhận CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF
Nội dung 5: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn KSF của CHĐBMSH
kháng vi khuẩn KSF lựa chọn


4

PHẦN 1.

TỔNG QUAN

1.1. Vai trò của ngành công nghiệp dầu khí
Dầu khí đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, cũng như đối
với từng quốc gia. Ngành dầu khí luôn là ngành mũi nhọn của các quốc gia xuất
khẩu dầu mỏ, cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho xã hội hiện đại, đặc
biệt là để sản xuất điện và nhiên liệu cho các phương tiện giao thông vận tải.
Ngành dầu khí còn cung cấp đầu vào cho các ngành công nghiệp khác như: công
nghiệp hóa chất, phân bón và nhiều ngành khác - trở thành ngành năng lượng
quan trọng, cần thiết đối với đời sống xã hội. Ngành dầu khí mang lại lợi nhuận
lớn cho các quốc gia sản xuất, chế biến và xuất khẩu dầu khí. Trong quá trình
công nghiệp hóa và hiện đại hóa, ngành dầu khí đóng vai trò quan trọng và đem
lại ý nghĩa to lớn cho nền kinh tế nước ta.
Ngành công nghiệp dầu khí Việt Nam (PVN) luôn duy trì vai trò là đầu
tàu kinh tế của đất nước, trong khi khối doanh nghiệp Nhà nước đóng góp
khoảng 42% GDP của cả nước, riêng PVN đã chiếm khoảng 20 - 26% GDP,
mức cao nhất so với cả nước trong giai đoạn 2008 – 2015. Vài năm trở lại đây,
dù đang phải đối diện với nhiều khó khăn, đặc biệt trong bối cảnh giá dầu

xuống thấp, kinh tế thế giới có nhiều biến động, PVN vẫn đóng góp trên 10%
ngân sách.
Sự phát triển của ngành dầu khí còn góp phần bảo đảm môi trường tăng
trưởng và giải quyết việc làm, an sinh xã hội. Đặc biệt sự phát triển khai thác
dầu khí trên biển, đã góp phần quan trọng khẳng định chủ quyền lãnh hải Việt
Nam. Các nguồn lực đem lại từ phát triển ngành dầu khí giúp cân đối vĩ mô,
thúc đẩy tăng trưởng chung của cả nền kinh tế. Tuy nhiên, sau nhiều năm đưa
vào khai thác và sử dụng, hệ thống trang thiết bị phục vụ ngành dầu khí đã và
đang xuống cấp nghiêm trọng. PVN đã phải tiêu tốn không ít tiền bạc cho việc
sửa chữa, thay mới. Không những thế ngành công nghiệp dầu khí trên thế giới


5
nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phải đối mặt với việc chua hóa dầu,
đặc biệt là tình trạng ăn mòn các hệ thống máy móc thiết bị bằng kim loại sử
dụng trong khai thác, vận chuyển và dự trữ dầu mỏ. Nguyên nhân chủ yếu gây
ra ăn mòn và chua hóa dầu hiện nay được cho là do vi khuẩn khử sulfate, nhóm
vi khuẩn phổ biến trong nước biển nơi có hàm lượng SO42- cao .
1.2. Vi khuẩn khử sulfate (KSF)
Vi khuẩn KSF là nhóm vi khuẩn kị khí bao gồm vi khuẩn thật (Bacteria)
và vi khuẩn cổ (Archaea). Nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên,
chủ yếu ở các vùng trầm tích, bùn lắng ở đáy sông, hồ, ao tù, trong đất, trong
các vùng có nhiệt độ cao như suối nước nóng và đặc biệt có rất nhiều trong các
mỏ dầu. Thỉnh thoảng cũng phát hiện thấy chúng trong các lắng cặn thủy vực
hiếu khí do chúng có khả năng hình thành những ổ nhỏ kị khí và phát triển khá
tốt trong điều kiện đó. Ngoài ra, người ta còn tìm thấy chúng trong các mạch
nước ngầm dưới đất, trong các vỉa than ngậm nước, thậm chí trong đường tiêu
hóa của bò, cừu, sâu bọ… [45].
Vi khuẩn KSF đầu tiên được Beijerinck phân lập vào năm 1895 từ các
ống nước dẫn nước có tên là Spirillum Desulfurcccicans [53]. Vi khuẩn này

hình xoắn, di động, có khả năng sử dụng nguồn sulfate (SO42-) và các chất khác
làm chất nhận điện tử. Năm 1926, các nhà khoa học Nga và Mỹ đồng thời phát
hiện ra vi khuẩn KSF trong các giếng khoan dầu khí [3]. Vi khuẩn KSF có khả
năng tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau như trên cạn, dưới nước, trong
điều kiện vi hiếu khí, chúng sẵn sàng trở thành dạng hoạt động bất cứ lúc nào
khi môi trường xung quanh ở dạng kị khí [45].
* Đặc điểm phân loại của vi khuẩn KSF
Vi khuẩn KSF đại diện cho nhóm vi khuẩn kị khí, có khả năng khử
sulfate thành sulfide. Theo khóa phân loại đầu tiên của Postgate năm 1984, vi
khuẩn KSF được chia thành hai chi: chi không tạo bào tử là Desulfovibrio và
chi có khả năng tạo bào tử là Desulfotomaculum. Theo khóa phân loại mới của


6
Bergey năm 1984, Desulfovibrio được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram âm còn
Desulfotomaculum được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương [39].
Vi khuẩn KSF có kích thước tế bào tương đối nhỏ, dao động trong
khoảng: 0,3 – 1,5µm × 0,8 – 10µm. Hình dạng bên ngoài của chúng rất đa dạng:
hình cầu như Desulfococus nultivorans, hình que như Desulfomicrobium
baculatum, hình sợi như Desulfonema magnum, hình hạt đậu như Desulfovibrio
saprovorans…. Tuy nhiên, hình dạng của tế bào cũng thay đồi thùy thuộc vào
điều kiện nhiệt độ. Mặt khác, hình dạng tế bào cũng thay đổi trong một số điều
kiện nuôi cấy đặc biệt như: nuôi cấy trong thời gian dài, trong môi trường có
chất diệt khuẩn…. [39].
Theo phương pháp phân loại truyền thống, vi khuẩn KSF được phân loại
dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa như:
-

Theo hình dạng tế bào, khả năng di động, hàm lượng guanine và

cystosine (%GC) trong ADN.
-

Dựa vào loại enzyme khử sulfate thành sulfide.

-

Dựa vào protein chuyển điện tử.

-

Dựa vào quá trình trao đổi chất chia thành 2 nhóm chính: nhóm oxy hóa

không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đến acetate. Thuộc nhóm này chủ yếu là
các loài thuộc chi Desulfovibrio spp; nhóm oxy hóa hoàn toàn các hợp chất hữu
cơ (bao gồm cả acetate) thành CO2. Trong nhóm này có sự đa dạng các loài vi
khuẩn KSF khác nhau như Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp.,
Desulfosarcina spp… [31].
Ngày nay, bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA, vi khuẩn
KSF được chia thành 7 nhánh tiến hóa, trong đó có 5 nhánh thuộc vi khuẩn thật và
2 nhánh thuộc vi khuẩn cổ bao gồm 29 chi với hơn 100 loài đã được xác định.
1.3. Ảnh hƣởng của vi khuẩn khử sulfate đến quá trình ăn mòn thiết bị
bằng kim loại và chất lƣợng dầu trong công nghiệp dầu khí
Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành của
ngành công nghiệp dầu khí là sự có mặt của các VSV không mong muốn trong


7
đường ống thu gom dầu, đặc biệt là các VSV tạo màng sinh học, trong đó có
nhóm vi khuẩn KSF. Các VSV này gây ra rất nhiều vấn đề nghiêm trọng như

làm tắc nghẽn đường ống dẫn dầu, gây ăn mòn sinh học dẫn đến thủng đường
ống dẫn dầu và ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm trong quá trình
khai thác dầu [40], [51].
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nguyên nhân chủ yếu gây ăn mòn đường
ống dẫn dầu, các bể chứa và các thiết bị kim loại liên quan đến khai thác và
lọc hóa dầu trong ngành công nghiệp dầu khí là do nhóm vi khuẩn KSF [11],
[21], [52].
Trong quá trình khai thác dầu khí ngoài khơi, một lượng nước biển đã
được loại bỏ oxy thường được bơm vào các giếng dầu nhằm duy trì áp suất
trong giếng và tăng cường khai thác dầu thứ cấp. Vì thế, các vi khuẩn bản địa
xung quanh khu vực có dầu cũng được theo vào trong giếng khoan. Các điều
kiện kỵ khí kết hợp với hàm lượng sulfate cao trong nước biển đã thúc đẩy sự
sinh trưởng mạnh mẽ của vi khuẩn KSF trong các giếng khoan cũng như hệ
thống khai thác, tồn chứa và vận chuyển dầu. Vi khuẩn KSF khử sulfate thành
sulfide, sau đó kích thích hoạt động của gốc sulfide và làm tăng cường quá trình
ăn mòn đường ống [13], [19]. Khả năng ăn mòn đường ống và bể chứa dầu
bằng kim loại được mô phỏng trên Hình 1.1

Hình 1.1. Hình ảnh mô phỏng quá trình ăn mòn kim loại của vi khuẩn KSF


8
Vi khuẩn KSF sinh ra khí H2S không chỉ là tác nhân gây ăn mòn, phá
hỏng hệ thống đường ống, làm tắc các thiết bị khoan và bơm ép nước mà còn
làm chua hóa dầu mỏ, làm giảm chất lượng dầu dẫn đến ảnh hưởng đến giá
thành sản phẩm dầu tạo thành. Không những thế, lượng H2S do vi khuẩn KSF
tạo ra còn có tác hại không nhỏ đến quá trình sinh hoạt của con người thậm chí
dẫn đến tử vong khi hít phải lượng H2S lớn.
Như vậy, việc hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn KSF
trong các thiết bị liên quan đến khai thác và lọc hóa dầu ở các công trình biển là

thực sự rất cần thiết hiện đã và đang được các nhà khoa học và các công ty dầu
khí trên thế giới quan tâm nghiên cứu.
1.4. Các phƣơng pháp hạn chế vi khuẩn khử sulfate thƣờng dùng trong
công nghiệp dầu khí
Hiện nay, nhằm giảm thiểu và hạn chế số lượng vi khuẩn KSF người ta
thường sử dụng các chất diệt khuẩn hóa học để diệt nhóm vi khuẩn này. Các
chất diệt khuẩn công nghiệp được sử dụng để ức chế vi khuẩn KSF thường
được tổng hợp từ các hợp chất hóa học như chloride, glutaraldehyde,
isothiazolones, formaldehyde và các muối amoni bậc bốn….
-

Formaldehyde: Formaldehyde được sử dụng như một chất diệt khuẩn

được công bố sớm nhất bởi Loew và Fisher năm 1886. Formaldehyde có thể
giết chết phần lớn các loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn KSF bằng cách tấn
công màng tế bào, phản ứng với protein và lipopolysacchrides tạo thành các
chất độc hại đối với tế bào chất của vi khuẩn. Ngoài ra, formaldehyde còn có
khả năng làm giảm độc tính của các protein bằng cách phản ứng với các nhóm
amin và sulfhydryls (nhóm chức của axit amin cystein) [44].
-

Isothiazolone: Isothiazolone là một hợp chất dị vòng, các dẫn xuất của nó

như benzisothiazolone (BIT), N-methylisothiazolone (MIT) và 5–chloromethylisothiazolone (CMIT) được sử dụng rộng rãi để làm chất diệt khuẩn công
nghiệp. Cơ chế diệt khuẩn của isothiazolone khá phức tạp, bao gồm 2 bước


9
chính: ức chế quá trình trao đổi chất và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng
cách ức chế hoạt động của enzyme dehydrogenases và gây tổn thương không

thể phục hồi dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn [49], [54].
-

Glutaraldehyde: Glutaraldehyde (C5H8O2) là một hợp chất di-dehyde 5

carbon bão hòa thường được sử dụng như chất cố định bộ phận trong phân tích
tế bào dưới kính hiển vi điện tử. Dung dịch glutaraldehyde có nồng độ từ 0.1 –
1% được sử dụng làm chất diệt khuẩn. Glutaraldehyde có khả năng diệt khuẩn
do nhóm carbonyl (C=O) tương tác với axit nucleic và protein của tế bào, qua
đó cho phép tạo liên kết chéo với nhóm amin trên bề mặt tế bào và màng tế bào
của vi khuẩn từ đó làm bất hoạt vi khuẩn.
Tuy được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dầu khí nhưng các hợp chất
này rất độc hại đối với con người và hệ sinh thái, gây ức chế sự sinh trưởng và
trao đổi chất của sinh vật sống.
Có nhiều báo cáo về mức độ độc hại của formaldehyde đối với con
người, động vật và môi trường. Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ phân loại
như là chất có khả năng gây ung thư ở người và được Cơ quan nghiên cứu ung
thư quốc tế (IARC) coi là chất gây ung thư đã biết ở người. Trong cơ thể,
formaldehyde có thể làm cho các protein liên kết không đảo ngược được với
DNA. Các động vật trong phòng thí nghiệm bị phơi nhiễm một lượng lớn
formaldehyde theo đường hô hấp trong thời gian sống của chúng có nhiều dấu
hiệu của ung thư mũi và cổ họng hơn so với các động vật đối chứng.
Isothiazolone được biết là chất có độc tính thủy sinh cao và một số dẫn xuất có
thể gây ra quá mẫn cảm khi tiếp xúc trực tiếp hoặc qua không khí.
Glutaraldehyde là một chất khử trùng mạnh, độc và gây kích ứng mạnh [37].
Mặc dù chất diệt khuẩn hóa học kể trên có hiệu quả hạn chế số lượng vi
khuẩn KSF tại các công trình dầu khí trên biển và làm giảm thiểu đáng kể việc
làm thối dầu của nhóm vi khuẩn này nhưng chúng lại ảnh hưởng tiêu cực đến
sức khỏe con người và hệ sinh thái biển. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chất

10
diệt khuẩn an toàn, hiệu quả, có nguồn gốc từ các VSV có ích để thay thế các
chất diệt khuẩn hóa học độc hại hiện đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu
của các nhà khoa học trên thế giới.
Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, CHĐBMSH được tổng hợp từ
VSV có vai trò đáng kể trong việc nâng cao hiệu suất thu hồi dầu tam cấp thay
cho các chất hoạt động bề mặt hóa học đắt tiền, độc hại với môi trường sống và
con người. Khả năng ức chế vi khuẩn, nấm men và nấm mốc của CHĐBMSH
tổng hợp từ VSV cũng đã được các nhà khoa học trên thế giới công bố [16],
[17], [18].

Như vậy, trong tương lai, có thể sử dụng CHĐBMSH sinh tổng

hợp từ VSV để diệt vi khuẩn KSF nhằm giảm thiểu tác hại của nhóm vi khuẩn
này. Đây là một hướng nghiên cứu mới hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho
ngành dầu khí của nước ta nói riêng cũng như các nước khai thác và xuất khẩu
dầu khí trên thế giới nói chung.
1.5. Chất hoạt động bề mặt sinh học
1.5.1. Khái niệm chất hoạt động bề mặt sinh học
Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất lưỡng
cực có hoạt tính bề mặt do VSV tạo ra. Chúng có cấu tạo gồm hai phần: phần
ưa nước (hydrophilic) và kỵ nước (hydrophobic). Phần kỵ nước là các axit béo
chuỗi dài hoặc dẫn xuất của axít béo; phần ưa nước có thể là mono-, oligo-,
hoặc polysaccharide, peptide, protein….
CHĐBMSH thu được nhờ lên men VSV. Cũng giống như chất hoạt động
bề mặt được tổng hợp hóa học, CHĐBMSH đặc trưng bởi: sự đa dạng về cấu trúc
hóa học, có hoạt tính bề mặt có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, khả năng chịu nhiệt,
pH và chịu lực ion, khả năng phân hủy sinh học và tính độc thấp. Hiện nay,
CHĐBMSH được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp [9], [55].

1.5.2. Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học
CHĐBMSH là những hợp chất rất đa dạng về cấu trúc hóa học và hoạt
tính bề mặt. Rosenberg và Ron (1999) đã chia CHĐBMSH thành hai nhóm: các


11
CHĐBMSH có khối lượng phân tử thấp và các CHĐBMSH có khối lượng phân
tử cao. CHĐBMSH có khối lượng phân tử thấp bao gồm các glycolipid,
lipopeptid và lipoprotein. Các CHĐBMSH khối lượng phân tử cao như các chất
nhũ hóa thực phẩm, biodispersan... [43].
Ngoài cách phân loại nói trên, CHĐBMSH còn được phân loại dựa vào
nguồn gốc VSV. CHĐBMSH tạo ra từ VSV được chia thành các nhóm nhỏ như
Bảng 1.1 [36].
Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH theo nguồn gốc VSV [36].
CHĐBMSH
Vi sinh vật
Arthronbacter paraffineus
Corynebacterium sp
Trehalose lipids
Mycobacterium sp
Rhodococus erythropolis, Norcardia sp
Rhamnolipids

Sophorolipids

Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas sp, Serratia rubidea
Candida apicola, Candida bombicola
Candida lipolytica
Candida bogoriensis

Alcanivorax borkumensis

Glycolipids

Cellobiose lipids
Polyol lipids

Arthrobacter sp, Corynebacterium sp
R. erythropolis, Serratia marcescens
Tsukamurella sp
Ustilago maydis
Rhodotorula glutinous

Arthrofactin

Rhodotorula graminus
Lactobacillus fermentii
Acinetocbacter calcoaceticus (RAG1)
Pseudomonas sp, Candida lipolytica
Arthrobacter sp, Corynebacterium sp

Lichenysin A, Lichenysin B
Surfactin

Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis, Bacillus pumilus

Diglycosyl diglycerides
Lipopolysaccharides

12

Viscosin
Ornithine, lysine peptides

Phospholipids
Sulfonylipids
Acid béo

Pseudomonas fluorescens
Thiobacillus thiooxidans
Streptomyces sioyaensis
Gluconobacter cerinus
Acinetocbacter sp
T. thiooxidans
Corynebacterium alkanolyticum
Capnoytophaga sp
Penicillium spiculisporum

Alasan

Corynebacterium lepus
Arthrobacter paraffineus
Talaramyces trachyspermus
Norcadia erythropolis
Acinetobacter radioresistens

Streptofactin
Particulate sufactant(PM)

Biosur PM

Streptomyces tendae
Pseudomonas marginalis
Pseudomonas maltophilia

(Corynomycolic acids,
spiculisporic acids, etc)

1.5.3. Tính chất của chất hoạt động bề mặt sinh học
Mỗi loại VSV khác nhau có khả năng tạo ra các CHĐBMSH có bản chất
hóa học khác nhau. Do đó, CHĐBMSH có nhiều tính chất khác nhau như hoạt
tính bề mặt, khả năng chịu nhiệt, pH, phân hủy sinh học, không độc hại….
*Hoạt tính bề mặt.
Nghiên cứu của Cooper and Paddoc (1984) đã cho thấy sophorolipid tạo
ra bởi chủng nấm men Torulopsis bombicola có khả năng giảm sức căng bề mặt
của n-hexadecane từ 40 mN/m xuống 5 mN/m [12]. Theo Luna và cộng sự
(2013), CHĐBMSH được tạo ra bởi chủng nấm men Candida sphaerica UCP
0995 có khả năng giảm sức căng bề mặt của nước từ 72 xuống 25 mN/m [30].
*Khả năng chịu nhiệt, pH và chịu lực ion
Nhiều CHĐBMSH không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như
nhiệt độ, pH. Chúng có thể phát triển ở môi trường có điều kiện khắc nghiệt.


13
Theo Jenaman và cộng sự (1983) thì chủng Bacillus licheniformis JF-2 trong
giếng khoan dầu ở Cater, Oklahoma, có khả năng phát triển ở môi trường kị khí
có nồng độ NaCl lên tới 10%. Chủng này không bị tác động bởi nhiệt độ trên
50oC và sống được trong môi trường pH dao động từ 4,6 - 9,9 [26]. Một
lipopeptide từ Bacillus subtilis LB5a vẫn giữ được ổn định sau khi khử trùng

(121oC/20 phút) và sau 6 tháng bảo quản ở -18oC, hoạt tính bề mặt không thay
đổi khi pH thay đổi từ 5 – 11 và chịu được nồng độ NaCl lên tới 20% [33].
*Khả năng bị phân hủy sinh học và tính độc thấp
Không giống các chất hoạt động bề mặt hóa học, CHĐBMSH dễ dàng bị
phân hủy trong môi trường. Do đó, chúng đặc biệt thích hợp với các ứng dụng
liên quan đến môi trường như phục hồi sinh học và xử lý ô nhiễm môi trường.
Ngoài ra, chúng đã được minh chứng là hầu như không độc. Vì vậy,
CHĐBMSH được nhiều công ty trên thế giới nghiên cứu, ứng dụng không
những trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường mà còn được ứng dụng trong
các ngành công nghiệp đòi hỏi sản phẩm có độ an toàn cao như thực phẩm, mỹ
phẩm và dược phẩm [26]. CHĐBMSH do Pseudomonas aeruginosa được so
sánh với chất hoạt động bề mặt hóa học Marlon A – 350 về phương diện gây
độc và gây đột biến. Các phân tích đều cho thấy Marlon A – 350 có khả năng
gây độc và gây đột biến, còn CHĐBMSH do Pseudomonas aeruginosa được
đánh giá là tác nhân không gây độc, không gây đột biến [15].
*Đa dạng về cấu trúc hóa học
CHĐBMSH là nhóm đa cấu trúc, mỗi loài VSV khác nhau có thể tạo ra
các loại CHĐBMSH khác nhau có bản chất và trọng lượng phân tử khác nhau.
Do đó CHĐBMSH rất đa dạng về mặt cấu trúc. Với sự đa dạng này mà chúng
có những đặc tính như tạo bọt, giữ ẩm, hòa tan, khả năng hoạt động bề mặt và
khả năng nhũ hóa… nên CHĐBMSH được sử dụng rộng rãi trong các ngành
công nghiệp [36].


14
1.5.4. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học
Từ những năm 1950 đến nay, nhiều nhà khoa học đã không ngừng tìm
kiếm và phát hiện ra những loài VSV có khả năng tạo CHĐBMSH.
Lần đầu tiên Bayer và Gutnik (1950) đã phát hiện vi khuẩn Acinetotacter
calcoacetius RAG – 1 có khả năng tạo CHĐBMSH. Sau đó La Rivie (1955)

phát hiện ra khả năng ứng dụng các chất này trong khai thác dầu khí. Một số
nhóm nghiên cứu trên thế giới như Khopade và cs (2012); Chakraborty và cs
(2011); Liu và cs (2010) đã phát hiện các chủng Bacillus velezensis H3,
Saccharopolyspora sp. A9 và Streptomyces sp. có khả năng tạo CHĐBMSH cao
[10], [27], [29]
Ndlovu và cộng sự (2017) phát hiện ra hai chủng vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens ST34 và Pseudomonas aeruginosa ST5 phân lập từ một nhà
máy xử lý nước thải có khả năng tạo CHĐBMSH có khả năng kháng khuẩn [38].
Kiều Thị Quỳnh Hoa và cộng sự (2016 - 2018) đã phân lập và tìm kiếm
được nhiều chủng vi khuẩn và nấm men thuộc các chi Candida; Pseudomonas
và Bacillus có khả năng tạo CHĐBMSH với hiệu suất cao trên nguồn carbon
duy nhất là dầu thô và dầu DO. Các chủng này được xem là có tiềm năng cao
trong việc ứng dụng để nâng cao hiệu suất khai thác dầu và xử lý môi trường
cát, trầm tích hay nước biển ô nhiễm dầu. [1], [2].
Các loài VSV khác nhau có thể tạo ra các loại CHĐBMSH có bản chất
hóa học và trọng lượng phân tử khác nhau. Các nhà khoa học đã tách chiết và
mô tả được bản chất hóa học của các CHĐBMSH do một số chủng vi khuẩn tạo
ra. Mulligan và cộng sự (2005) đã tổng kết được một số VSV có khả năng sinh
tổng hợp CHĐBMSH và bản chất hóa học của từng chất do các chủng tương
ứng tạo ra: Bacillus subtilis tạo CHĐBMSH có bản chất hóa học là sufactin,
Acinetobacter sp. tạo CHĐBMSH có bản chất là Phospholipid, Candida
tropicalis tạo CHĐMBMSH có bản chất là mannan (Bảng 1.1.)…[36]


15
Hiện nay, CHĐBMSH tổng hợp từ vi khuẩn và nấm men là đối tượng
được quan tâm nhiều nhất trong các VSV tạo CHĐBMSH vì dễ nuôi cấy, chu
kỳ sinh trưởng ngắn, tạo ra lượng sinh khối lớn…. Những nghiên cứu đã công
bố cho thấy tiềm năng tạo CHĐBMSH của vi khuẩn và nấm men là rất lớn.
1.5.5. Ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học

CHĐBMSH được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:
-

Công nghiệp dệt nhuộm: là chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm.

-

Y dược: kháng khuẩn, kháng nấm, đồng thời ức chế ngăn chặn sự kết

dính và tạo màng sinh học của các nhóm vi khuẩn gây hại (Escherichia. coli,
Staphylococcus aureus…).
-

Công nhiệp thực phẩm: chất nhũ hoá cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp.

-

Công nghiệp mỹ phẩm, : chất tẩy rửa, Cetyl stesulfat, sunfosucinat Na,

chất tạo bọt trong phối chế dầu gội, sữa tắm…
-

Ngành in: chất trợ ngấm và phân tán mực in…

-

Xây dựng nhũ hoá nhựa đường: làm tăng cường độ đông rắn của bê tông.

-

Công nghiệp khoáng sản: làm chất tuyển nổi, chất nhũ hoá, chất tạo bọt

làm giàu khoáng.
-

Nông nghiệp: Chất dễ gia công thuốc bảo vệ thực vật.

-

Dầu khí: làm chất nhũ hoá, tăng cường khai thác dầu.

-

Xử lý ô nhiễm môi trường: xử lý ô nhiễm dầu, ô nhiễm kim loại nặng.

1.6. Khả năng kháng vi khuẩn gây hại của chất hoạt động bề mặt sinh học
tạo ra từ vi sinh vật
Từ lâu các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng các vi
khuẩn gây hại của CHĐBMSH tạo ra từ VSV. Các công trình nghiên cứu cho
thấy các thành tựu to lớn mà CHĐBMSH mang lại.
Theo Fernandes và cộng sự (2007) CHĐBMSH tạo ra từ Bacillus subtilis
R14 có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh đặc biệt là
Enterococcus faecalis. Đường kính vòng kháng khuẩn do CHĐBMSH tạo ra