Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang - thành phố Đà Nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

LÊ TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ TẠO
CHẾ PHẨM THÔ CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME
PHYTASE TỪ ĐẤT THUỘC ĐỊA BÀN HUYỆN
HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng - năm 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô
của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành
phố Đà Nẵng” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chƣa
từng đƣợc công bố. Các số liệu liên quan đƣợc trích dẫn có ghi chú nguồn gốc, đã
công bố theo đúng quy định.
Đà Nẵng, tháng 05 năm 2018

Lê Trần Diệu Linh


ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đỗ Thu Hà
ngƣời đã luôn quan tâm và tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh
nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa -Môi trƣờng - Đại học Sƣ PhạmĐại học Đà Nẵng đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất có thể giúp cho em hoàn
thành khóa luận.
Cuối cùng, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và anh chị
khóa trên đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian
làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Lê Trần Diệu Linh


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .........................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.................................................................................... 2
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ..................................... 2
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ........................................................................... 3
1.2. ENZYME PHYTASE .......................................................................................... 4
1.2.1. Nguốc gốc enzyme phytase .............................................................................. 6
1.2.2. Đặc điểm enzyme phytase ................................................................................ 7
1.2.3. Ứng dụng của enzyme phytase ......................................................................... 9

1.3. LÊN MEN XỐP ................................................................................................. 12
1.3.1. Khái niệm lên men xốp ................................................................................... 12
1.3.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật lên men xốp ........................................ 12
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở
VIỆT NAM ............................................................................................................... 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................................. 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................ 14
1.5. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ ................................................................................................................. 15
1.6. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU ....................................... 16
1.6.1. Địa hình và đất đai .......................................................................................... 16
1.6.2. Đặc điểm khí hậu và thổ nhƣỡng .................................................................... 16
CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 17
2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 17
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 17


iv

2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................ 17
2.2.1. Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa .................................................................... 17
2.2.2. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm .................................................. 17
2.2.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 18
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất........................................................... 18
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào ......... 19
2.3.3. Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phƣơng pháp Koch) ............ 20
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme phytase ............................................. 21
2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển
chọn ......................................................................................................................... 23

2.3.6. Giữ giống VSV ............................................................................................... 24
2.3.7. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................... 24
2.3.8. Phƣơng pháp tạo chế phẩm enzyme phytase .................................................. 27
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 32
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE ........ 32
3.3. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NUÔI CẤY CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT
SINH ENZYME PHYTASE TUYỂN CHỌN .......................................................... 38
3.4. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE
ĐƢỢC TUYỂN CHỌN ............................................................................................ 44
3.4.1. Nhân trình tự gen 18S rRNA của các mẫu nấm NM1 và NM4 ...................... 44
3.4.2. Giải trình tự và lập cây phân loại .................................................................... 45
3.5. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH ENZYME PHYTASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP ....... 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 57
1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 57
2.KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 59


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU

: Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)

CT

: Công thức

KL

: Khuẩn lạc

KLTB
HSCC

: Khối lƣợng trung bình
: Hệ sợi cơ chất

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

MT

: Môi trƣờng

NM

: Nấm mốc

STT

: Số thứ tự

TB

: Trung bình

TP

: Thành phố

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

PSM

: Phytase screening media


vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc của inositol

3

Hình 1.2

Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein

3

Hình 1.3

Phản ứng xúc tác của enzyme phytase

5

Hình 2.1

Mối tƣơng quan giữa nồng độ K2HPO4 với OD

23

Hình 2.2.

Chu trình gia nhiệt chƣơng trình chạy PCR

25

Hình 2.3.

Hình 3.1.

Hình 3.2.

Hình 3.3

Hình 3.4.

Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.

Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình 3.10.
Hình 3.11.

Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme
phytase
Một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PSM
Một số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PSM
Tỉ lệ % các chủng vi khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh
phytase mạnh
Hình ảnh phân giải acid phytate của VK-1 và VK-4 trên
môi trƣờng PSM
Hình ảnh phân giải acid phytate của NM-1 và NM-4 trên
môi trƣờng

Khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn VK-1
Chủng nấm mốc NM-1trên môi trƣờng PDA và Cơ quan
sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dƣới kính hiển vi
Chủng nấm mốc NM-4 trên môi trƣờng và cơ quan sinh
sản của chủng nấm mốc NM-4 dƣới kính hiển vi
Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy
Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời
gian nuôi cấy
Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của

28

35

35

37

38

38
39
41

42
43
44
44

vii

mẫu NM1
Hình 3.12

Hình 3.13

Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của
mẫu NM4
Giản đồ phả hệ chủng nấm NM1, NM4 và một số chủng
nấm khác

45

45

Hình 3.14

Giống cấp 2 chủng VK-1 sau 3 ngày nuôi cấy dịch thể

47

Hình 3.15

Sơ đồ quy trình lên men xốp chủng vi khuẩn VK-1

47

Hình 3.16

Hình3.17

Hình 3.18.

Hình 3.19.

Hình 3.20.

Hình 3.21.

Khảo cơ chất thích hợp cho lên men xốp chế phẩm
phytase thô
Khảo sát cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng vi
khuẩn VK-1
Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme
phytase của chủng VK-1 tuyển chọn
Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme
phytase trên môi trƣờng xốp của chủng VK-1.
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
thích hợp
Ảnh hƣởng pH đến khả năng sinh hoạt tính enzyme
phytasecủa cung VK-1

48

49

51

53

54

55


viii

DANH MỤC BẢNG
Số hiệu

Tên Bảng

bảng

Trang

Bảng 1.1.

Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng

4

Bảng 2.1.

Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phốt pho vô cơ và OD 700 nm

22

Bảng 2.2.

Thành phần phản ứng PCR

25

Bảng 2.3.

Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc

27

Bảng 2.4.

Bảng 2.5.

Bảng 2.6.

Bảng 2.7.

Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cơ chất lên men đến hoạt tính
enzyme của chủng VSV tuyển chọn
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả
năng sinh enzyme phytase của chủng VSV tuyển chọn
Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme
phytase của VSV trên môi trƣờng bán rắn.
Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên men đến hoạt
tính enzyme của chủng vi sinh vật tuyển chọn

29

29

30

31

Số chủng vi sinh vật sinh trƣởng trên môi trƣờng sàng lọc
Bảng 3.1

đƣợc phân lập từ đất tại các xã thuộc H.Hòa Vang -TP.Đà

33

Nẵng
Khả năng sinh enzyme phytase của một số chủng nấm mốc
Bảng 3.2

Bảng 3.3

và vi khuẩn trên môi trƣờng PSM có bổ sung CaCl2
Đặc điểm nuôi cấy và hình thái chủng VK-2 sinh phytase
mạnh

36

39

Bảng 3.4

Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc NM-1, NM-4

40

Bảng 3.5

Hoạt độ enzyme của chủng MN-1, MN-4 và VK-2 qua các

42


ix

thời gian nuôi cấy dựa trên so sánh trình tự nucleotide của
gen mã hóa 18S rARN
Kết quả ảnh hƣởng của cơ chất lên men đến khả năng hoạt
Bảng 3.6

tính enzyme của chủng VK-1 tuyển chọn

49

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme phytase
Bảng 3.7

Bảng 3.8

Bảng 3.9

.

của chủng VK-1 tuyển chọn
Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme phytase
và sinh trƣởng của VSV trên môi trƣờng bán rắn.
Ảnh hƣởng của điều kiện pH đến khả năng sinh hoạt tính
enzyme phytase

51

52

55


1

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao chất lƣợng, hiệu
quả sản phẩm và chất lƣợng môi trƣờng trong nuôi trồng đang là hƣớng đi chủ đạo,
mang tính khoa học và có ý nghĩa rất lớn đến việc phát triển bền vững. Công nghệ
enzyme đƣợc xem nhƣ là phƣơng án thích hợp, tham gia vào việc giải quyết, nâng
cao hiệu quả thức ăn và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng từ hoạt động chăn nuôi
[17]. Nhiều nghiên cứu về vai trò của enzyme tiêu hóa nhƣ lipase, protease, amylase
và phytase bổ sung vào thức ăn vật nuôi. Đặc biệt trong các enzyme trên thì phytase
là một trong những enzyme có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Sử dụng phytase
vào thức ăn chăn nuôi, giúp vật nuôi tăng trọng lƣợng rất hiệu quả. Do enzyme có
tác dụng thủy phân chất kháng dinh dƣỡng axit phytic (chiếm 50-80% phospho
trong các loại hạt ngũ cốc), giúp vật nuôi tăng cƣờng hấp thu hiệu quả các protein
và khoáng chất nhƣ: Ca, Zn, Fe… trong thức ăn chăn nuôi[15]. Mặt khác sử dụng
enzyme còn giúp làm giảm lƣợng phospho dƣ thừa thải qua phân của vật nuôi, hạn

chế tình trạng ô nhiễm phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền
vững. Ngoài ra, phytase bắt đầu đƣợc sử dụng trong thực phẩm của ngƣời, điều chế
các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dƣợc phẩm, sử dụng trong công
nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [26].
Chính vì những lợi ích của enzyme phytase mang lại, mà trên thế giới đã có
nhiều công trình nghiên cứu về enzyme phytase và các nhà khoa học vẫn không
ngừng nghiên cứu, tìm tòi enzyme phytase từ những chủng vi sinh vật sinh phytase
chƣa ai nghiên cứu tới. Để tìm ra các ƣu thế vƣợt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay
thế, vƣớng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty.
Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về enzyme phytase vẫn còn nhiều hạn chế,
việc sản xuất các chế phẩm phytase cũng chƣa đƣợc quan tâm. Vì vậy, phần lớn chế
phẩm enzyme phytase trên thị trƣờng hiện nay, chủ yếu là đƣợc nhập khẩu từ các
nƣớc Trung Quốc, Hoa kì, Nhật Bản…với giá thành rất cao[17].
Trong tự nhiên, enzyme phytase phân bố rất rộng rãi, có thể đƣợc tìm thấy
trong mô thực vật, một số mô động vật và vi sinh vật. Trong đó, phytase từ vi sinh


2

vật có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp . Một số loài vi
khuẩn sinh phytase đã đƣợc nghiên cứu nhƣ Bacillus sp, Escherichia.coli,
Enterobacter, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter… Và một số
chủng nấm mốc, đặc biệt là các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucor và
Rhizopus[7],[15],[24].
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình và hệ sinh thái
đã tạo nên sự đa dạng về các loài vi sinh vật, cũng nhƣ do nhu cầu và tầm quan
trọng của các sản phẩm phytase thƣơng mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên
cứu “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh
enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng”
nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và an toàn,

đáp ứng nhu cầu sử dụng chế phẩm enzyme trong nông nghiệp hiện nay.

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase
ngoại bào mạnh từ đất tại một số xã thuộc huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng,
khảo sát và lựa chọn các điều kiện môi trƣờng tối ƣu cho quá trình lên men xốp tạo
chế phẩm enzyme phytase thô.

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Tuyển chọn và lƣu trữ một số chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại
bào có hoạt tính mạnh tại địa bàn huyện Hòa Vang – TP Đà Nẵng.
- Xác định một số điều kiện và môi trƣờng tối ƣu cho quy trình lên men xốp
tạo chế phẩm enzyme thô. Góp phần tạo chế phẩm sinh học ứng dụng vào các lĩnh
vực khác nhau của nghành nông nghiệp, đặc biệt là chăn nuôi.


3

CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Axit Phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là myoinositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) là thành phần chính của phopho ( P )
trong thực vật đƣợc dự trữ chủ yếu ở các cây ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt
chứa dầu và đƣợc phát hiện năm 1903.

Hình 1.1. Cấu trúc của inositol
Axit phytic trong thực vật không tồn tại tự do mà thƣờng tạo muối phytate
với một số nguyên tố khoáng nhƣ Mg, K, Ca, cũng nhƣ tham gia liên kết với các
protein. Và tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay phytate. Axit
phytic đƣợc coi là một hợp chất kháng dinh dƣỡng (an anti-nutritional compound)
do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác nhƣ tinh

bột, protein làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này.

Hình 1.2. Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein


4

Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông thƣờng chiếm khoảng 1 đến vài
phần trăm trọng lƣợng khô của nhiều hạt và trong vài trƣờng hợp nó chiếm khoảng
50-80% lƣợng photpho tổng của hạt . Không có hạt trƣởng thành nào mà không có
phytate mặc dù nó có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó nhƣ nội nhũ
chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc. Phytate cũng có ở hạt phấn , bào tử túi và mô
sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống và lá. Phytate hầu nhƣ không có mặt trong nội nhũ của
lúa mỳ và lúa nƣớc mà tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Alơron của tế bào hạt.
Ở đậu Hà Lan, 99% phytate của hạt tìm đƣợc trong lá mầm và 1% trong phôi mầm.
Ngô là loại ngũ cốc có hàm lƣợng phytate cao nhất (chiếm 0.83 – 2.22% khối lƣợng
hạt). Trong số các cây họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lƣợng phytate
cao nhất (5.92 – 9.15% khối lƣợng hạt)[15].
Bảng 1.1. Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng

Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh đối với động vật. Do cấu
trúc phân tử đặc biệt (hình 1.1), axit phytic có thể liên kết chặt chẽ với protein, các
nguyên tố khoáng và tạo thành phức hợp không tan trong đƣờng tiêu hóa. Hiệu ứng
này dẫn đến ức chế quá trình tiêu hoá protein và hạn chế khả năng hấp thụ các ion
khoáng nhƣ Ca, Mg, Zn…Kẽm là một nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của
nó bị ảnh hƣởng lớn nhất bởi axit phytic. Thử nghiệm trên chuột cho thấy axit
phytic bổ sung vào thức ăn làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và trọng
lƣợng của chuột [17].

1.2. ENZYME PHYTASE

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme
đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy
phân từng bƣớc acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các


5

myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [25]. Trong một vài
trƣờng hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (hình 1.3).

Hình 1.3. Phản ứng xúc tác của enzyme phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại
phytase thành hai dạng là:
Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)
Tên đề xuất: 3-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-3-phosphatase
Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)
Tên đề xuất: 6-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase
Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphat đầu tiên bị phytase tấn
công. Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphat ở vị trí thứ 3;
đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26)
tấn công đầu tiên vào nhóm phốt phát số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ
thực vật [26].
Dựa trên pH hoạt động tối ƣu, phytase đƣợc chia thành 3 loại: phytase ƣa acid,

6

ƣa kiềm và trung tính.
Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase
đƣợc phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ßpropeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [21].
Phytase đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và
các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn,
nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [11]. Từ các nguồn thu enzyme khiến điều
kiện hoạt động của phytase không giống nhau. Các enzyme phytase từ thực vật
thƣờng hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt
động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [19].
Khối lƣợng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase
từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng). Phytase từ eukaryote nhƣ
nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thƣờng đƣợc glycosyl hóa và có khối lƣợng
phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500
kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và
động vật [22].
1.2.1. Nguốc gốc enzyme phytase
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ mô thực vật,
động vật và rất nhiều loài vi sinh vật.
a. Phytase từ vi sinh vật
Phytase đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogenes,
Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, B. subtilis, Escherichia coli,
Enterobacter sp. và B. amyloliquefaciens. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào
là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter. Còn phytase từ E. coli lại là
enzyme nội bào (periplasmic enzyme). Ngoài ra, phytase còn có trong các chủng
nấm mốc đặc biệt ở các loài A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và
A.fumigatus thuộc chi Aspergillus và một số nấm men nhƣ Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii,

7

Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii,
cũng có khả năng sản sinh phytase [7], [18], [31].
Phytase đƣợc thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng nhƣ
một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng. Sự tăng trƣởng đáng kể về kích
thƣớc, chiều dài rễ cũng nhƣ chiều cao cây của các cây gieo trồng khi đƣợc bổ sung
chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to
lớn [7].
Trong một số loài khác của chi Aspergillus nhƣ A.rugulosus cho thấy việc sử
dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lƣợng chất chất khô và sản
lƣợng các các loại ngũ cốc. Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã đƣợc bổ
sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ đƣợc
phosphoric. Việc bổ sung phytase từ nấm mốc trong chế độ ăn của heo đã giúp việc
hấp thụ phospho tăng từ 52% đến 64% [43]. Một nghiên cứu khác lại cho thấy,
phytase từ nấm mốc bổ sung vào thức ăn của gà giúp chúng hấp thụ phospho tăng
từ 50 đến 60% [15].
Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển càng giúp cho chất lƣợng
enzyme phytase thu từ nguồn này cải thiện đáng kể. Việc bổ sung các đoạn gen giúp
cho enzyme phytase tăng khả năng chống chịu với các điều kiện từ môi trƣờng bên
ngoài và chống lại sự phân hủy enzyme tiêu hóa trong dạ dày [34].
b. Phytase từ động vật
Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động vật
dạ dày đơn Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai
trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate từ thức ăn. Một enzyme giống nhƣ
phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong động vật nguyên sinh Paramecium [15].
1.2.2. Đặc điểm enzyme phytase
a. Cấu tạo phân tử của enzyme phytase
Hầu hết các loại phytase đƣợc biết đều là enzyme monome, điển hình nhƣ

phytase từ nấm, từ E. coli và K. terrigena và từ B. subtilis .Tuy vậy, một số phytase


8

từ thực vật và động vật đƣợc tạo thành từ nhiều tiểu đơn vị. Một loại phytase đƣợc
tổng hợp ở hạt ngô trong giai đoạn nảy mầm là enzyme dime bao gồm hai tiểu đơn
vị kích cỡ 38 kDa. Trong khi đó, phytase tinh sạch từ ruột non của chuột thể hiện
hai băng (band) protein trên SDS-PAGE với trọng lƣợng phân tử ƣớc tính là 70 và
90 kDa. Tuy vậy, chỉ có tiểu đơn vị 90 kDa có hoạt tính thuỷ phân axit phytic, có
thể hai băng protein là đại diện cho hai enzyme khác nhau (phosphatase kiềm và
phytase). Đặc biệt enzyme từ động vật nguyên sinh Paramecium có cấu trúc
hexame[15].
Phytase vi khuẩn thƣờng nhỏ hơn phytase từ nấm. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, phytase nấm có khối lƣợng khoảng 65 và 70 kDa và đã đƣợc glycosyl hóa
(glycosylation). Phytase từ A. niger NRRL 3135 đƣợc glycosyl hóa 27%. Nó có đầu
N liên kết với chuỗi manose và galactose nghiên cứu chỉ ra rằng mức độ glycosyl
của phytase tái tổ hợp là không ổn định. Ở Hansenula polymorpha và S. cerevisiae
quá trình glycosyl hóa rất hay thay đổi. Ngƣợc lại, quá trình này của enzyme trong
A. niger khá ổn định. Điểm đáng chú ý là, sự glycosyl hóa không chỉ khác nhau
giữa các loài mà còn khác nhau giữa những lần lên men khác nhau của cùng một
chủng. Nhìn chung, mức độ glycosyl hóa có thể có vài tác động lên đặc tính của
enzyme. Đầu tiên, nó có thể ảnh hƣởng đến đặc tính xúc tác hoặc tác động đến sự
ổn định của enzyme. Thứ hai, nó có thể ảnh hƣởng đến điểm đẳng điện của protein
(pI). Thứ ba, nó có thể làm giảm mức độ biểu hiện của protein thông qua sự chi
phối năng lƣợng trao đổi[15].
b. Đặc tính nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến enzyme phytase
pH tối ƣu của phytase dao động từ 2.2 đến 8. Hầu hết các phytase từ vi sinh
vật, điển hình phytase có nguồn gốc từ nấm có pH tối ƣu ở khoảng 4.5 – 5.6. Đặc
biệt, khác với hầu hết phytase từ nấm, phytase từ A. fumigatus có dải pH tối thích từ

4.0 – 7.3 (còn giữ đƣợc ít nhất 80% hoạt tính). Một vài phytase từ vi khuẩn, đặc biệt
từ các loài Bacillus có pH tối ƣu từ 6.5 – 7.5. pH tối thích của enzyme tách ra từ hạt
thực vật dao động từ 4.0 – 7.0, còn hầu hết có pH tối thích ở 4.0 – 5.6. Hai phytase


9

kiềm từ thực vật có pH tối ƣu vào khoảng 8.0 đã đƣợc nghiên cứu từ hạt ngũ cốc và
ở hạt phấn hoa huệ tây [15]
Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của các phytase dao động từ 45 đến 75°C.
Nghiên cứu sự ổn định nhiệt độ của ba phosphatase có nguồn gốc từ nấm và đã kết
luận rằng phytase từ A. niger không bền với nhiệt độ hoặc không có khả năng hồi
lại hoạt tính sau khi đun nóng gây biến tính. Tại nhiệt độ 50 và 55 °C nó mất
khoảng 70-80% hoạt tính. Phytase từ A. fumigatus cũng không bền với nhiệt độ
nhƣng có một đặc tính đáng quý là có khả năng hồi lại hoạt tính ban đầu sau 20 phút
làm biến tính ở 90°C. So với hai phytase trên thì axit phosphatase từ A. niger pH 2.5
có khả năng ổn định với nhiệt độ rất cao; ở nhiệt độ tới 80°C enzyme chƣa bị biến
tính. Tuy nhiên khi ở 90°C, nó mất hoàn toàn hoạt tính. Phytase từ chủng Bacillus
sp. DS11 có nhiệt độ tối ƣu ở 70°C, cao hơn nhiệt độ tối ƣu của những phytase
thông thƣờng. Phytase này cũng rất bền với nhiệt: 100% hoạt tính còn lại sau 10
phút ủ tại 70°C (với sự có mặt của CaCl2). Khi không có CaCl2 khả năng bền với
nhiệt của phytase từ Bacillus sp. DS11 giảm mạnh, hoạt tính bị mất khi nhiệt độ
trên 60°C. Ngƣợc lại khi có mặt của CaCl2 nó có thể bền với nhiệt độ lên tới 90°C,
sau 10 phút lƣợng enzyme mất đi khoảng 50% hoạt tính. Nghiên cứu này chỉ ra rằng
ion Ca2+ có khả năng giúp phytase ổn định chống chịu với nhiệt độ cao [15].
1.2.3. Ứng dụng của enzyme phytase
a. Ứng dụng trong chăn nuôi
Động vật nhai lại tiêu hóa đƣợc muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật
sống trong dạ cỏ tiết ra. Phốt phát vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ đƣợc khu hệ vi
sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn

nhƣ lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa axit phytic vì chúng không có
hoặc có rất ít phytase trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phốt pho
cho cơ thể vật nuôi, ngƣời ta đã bổ sung phốt pho vô cơ vào thức ăn. Điều này sẽ
làm tăng chi phí thức ăn và gây ra môi trƣờng bị ô nhiễm phốt phát, đặc biệt đối với
ngành nuôi trồng thủy sản. Phospho dƣ thừa trong thức ăn dành cho tôm cá sẽ
nhanh chóng hòa tan vào môi trƣờng nƣớc, cộng với muối phytate không đƣợc tiêu


10

hoá thải qua phân động vật sẽ bị vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phốt phát
vô cơ. Đây là điều kiện hết sức thuận lợi cho các loài tảo vì phốt pho là nhân tố rất
phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của sinh vật này. Tảo phát triển quá mức
sẽ gây hiện tƣợng "nƣớc nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nƣớc
khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [15]. Khi bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng đồng hóa phốt phát ngay trong
chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lƣợng phốt phát thải qua phân từ
đó sẽ có những đóng góp tích cực cho môi trƣờng sinh thái. Đáng chú ý, ở Việt
Nam đã bắt đầu có những công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của phytase đến sinh
trƣởng của vật nuôi. Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi) đã nghiên
cứu sử dụng chế phẩm phytase thƣơng mại (Natuphos, BASF) đến năng suất và
hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt. Theo các tác giả, sử
dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16.4% và giúp giảm chi phí thức ăn đƣợc 8% so
với lô đối chứng. Tƣơng tự nhƣ vậy, năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS
(Viện Công nghiệp Thực phẩm) đã khảo sát khả năng ứng dụng enzyme phytase
thƣơng phẩm trong chăn nuôi gà và cho thấy việc sử dụng phytase làm tăng 2% tỷ
lệ đẻ trứng, làm giảm 8.4 -11.6% chi phí thức ăn cho gà con [17].
Ngƣời ta dự tính, nếu phytase đƣợc sử dụng cho chăn nuôi động vật dạ dày
đơn ở Mỹ thì enzyme này sẽ giải phóng lƣợng phốt phát có trong thức ăn với giá trị
tƣơng đƣơng 168 triệu USD và tránh đƣợc 8.23×104 tấn phốt phát dƣ thừa thải ra

môi trƣờng hàng năm. Việc ứng dụng phytase trong chăn nuôi đã đƣợc 22 quốc gia
thực hiện. Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã coi phytase là
enzyme an toàn GRAS (Generally Regarded As Safe). Enzyme Finase® phytase đã
đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn có thành phần là ngô và đậu tƣơng đã giúp
cải thiện 1/3 lƣợng phốt phát khó tiêu trong thức ăn thành lƣợng phốt phát dễ tiêu.
Thí nghiệm tƣơng tự với Allzyme Phytase® và Natuphos® phytase bổ sung vào
khẩu phẩn ăn cho lợn và gà, kết quả thu đƣợc cũng chỉ ra rằng phytase cải thiện
đƣợc giá trị sinh học của muối phytate đối với lợn và gà thịt Một vài thí nghiệm


11

khác cũng khẳng định rằng có thể thay thế phốt phát vô cơ bằng cách bổ sung
phytase từ vi sinh vật vào thành phần của thức ăn cho động vật dạ dày đơn. Ở Hà
Lan, phytase từ A. niger đã đƣợc thử nghiệm thành công vào thức ăn chăn nuôi và
làm giảm từ 30 - 40% lƣợng phốt phát thải qua phân ra môi trƣờng. Thị trƣờng
phytase vào những năm cuối thế kỷ 20 ƣớc tính đạt 500 triệu USD [17].
b. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Khẩu phần ăn hàng ngày của ngƣời chứa nhiều thành phần có nguồn gốc từ
các cây ngũ cốc và cây họ đậu. Những ngƣời ăn chay thƣờng gặp phải vấn đề mất
cân bằng dinh dƣỡng do ăn quá nhiều ngũ cốc. Những cƣ dân ở các quốc gia kém
phát triển thƣờng ăn bánh mỳ chay (loại bánh mỳ không đƣợc bổ sung nấm men) và
trẻ em thƣờng hay sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu nành. Những thức phẩm này đều
có chứa một lƣợng lớn muối phytate. Muối phytate không những không thể tiêu hóa
đƣợc trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời mà còn gây cản trở sự hấp thụ các nguyên tố
khoáng nhƣ: kẽm, caxi, magiê và sắt. Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa protein
trong khẩu phần cũng nhƣ ức chế các enzyme tiêu hóa khác.
Anno và CS. (1985) đã loại bỏ muối phytate trong sữa đậu nành bằng cách sử
dụng phytase từ lúa mỳ. Bổ sung phytase từ nấm mốc A. niger vào bột mỳ có chứa
cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở ngƣời[15]. Nhƣ vậy, vai trò quan

trọng của phytase với thực phẩm dành cho con ngƣời đã khá rõ ràng. Phytase không
những làm tăng khả năng tiêu hóa protein mà còn tăng hấp thụ khoáng. Có lẽ trong
tƣơng lai không xa enzyme này sẽ đƣợc dùng phổ biến nhƣ một chất phụ gia cho
thực phẩm [15].
c. Ứng dụng trong cải tạo đất
Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lƣợng
phốt pho hữu cơ trong đất. Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho thấy
khả năng sinh trƣởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi bổ
sung phytase vào đất trồng. Nghiên cứu này cũng mở ra một hƣớng trong tƣơng lai


12

có thể chuyển và biểu hiện gene phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng giá trị
phốt pho dễ tan trong đất.

1.3. LÊN MEN XỐP
1.3.1. Khái niệm lên men xốp
Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật
trên cơ chất không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ
trợ cơ học (giá thể) và vừa là nguồn dinh dƣỡng cho vi sinh vật. Với đặc điểm độ
ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp với một lƣợng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ
yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn [1].
Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng
trong quá trình xử lý sinh học môi trƣờng nhƣ phân hủy sinh học các hợp chất nguy
hại, các hợp chất độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức
ăn động vật từ các chất thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản
xuất các hợp chất làm phụ gia rất có giá trị nhƣ enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ
sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt động bề mặt sinh học, hƣơng liệu, chất
tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt tính sinh học, và các loại cơ chất

khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm.
1.3.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật lên men xốp
Các ƣu điểm chính của kỹ thuật lên men xốp:
- Môi trƣờng nuôi cấy đơn giản. Một số cơ chất có thể đƣợc sử dụng trực tiếp
làm môi trƣờng xốp hoặc đƣợc cho thêm một số dƣỡng chất trƣớc khi sử dụng.
- Sản phẩm enzyme thu đƣợc ở dạng đậm đặc.
- Độ ẩm tối ƣu thấp và phần lớn giống cấy đƣợc sử dụng trong lên men xốp
giảm đƣợc tối đa nguy cơ nhiễm độc vi sinh vật.
- Lƣợng chất thải sinh ra trong lên men xốp ít hơn so với lên men dịch thể
- Enzyme tạo ra ít nhạy cảm với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi chất.
Mặc dù có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣng kỹ thuật lên men xốp cũng vẫn tồn
tại một số nhƣợc điểm nhƣ sau:


13

- Vi sinh vật đƣợc dùng trong nghiên cứu bị giới hạn khả năng sinh trƣởng vì
độ ẩm của môi trƣờng hạn chế.
- Việc xác định các thông số nhƣ độ ẩm, pH, hàm lƣợng oxy và CO2 tự do là
một vấn đề khó khăn vì thiếu dụng cụ tiến hành.
- Phạm vi ứng dụng kỹ thuật lên men xốp còn chƣa đƣợc nghiên cứu rộng
rãi.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ
GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, một số chủng nấm mốc sinh thuộc các chi Aspergillus,
Penicillium, Mucor và Rhizopus có khả năng sinh enzyme phytase mạnh đã đƣợc
nghiên cứu. Đối với các chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus sp, Escherichia coli,
Enterobacte, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter đều có khả năng

tổng hợp enzyme phytase ngoại bào [26], [31], [43].
Trong những giai đoạn đầu nghiên cứu, hầu hết kết quả của các tác giả tập
trung vào việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase.
Vào năm 2000, J Kerovuo đã tiến hành nghiên cứu 21 chủng Bacillus về khả
năng sinh enzyme phytase trên môi trƣờng LB và môi trƣờng có bột bắp. Kết quả
cho thấy không có chủng nào tổng hợp phytase trên môi trƣờng LB, tuy nhiên trong
môi trƣờng bột bắp thì có 2 chủng B.amyloliquefaciens và B. subtilis VTT E68013
sản xuất phytase số lƣợng lớn [17].
Năm 2003, Yadav và Tarafdar đã sử dụng chế phẩm vi sinh đƣợc tổng hợp từ
nấm cho thấy hiệu quả trong việc phân giải phytate trong đất. Sự tăng trƣởng đáng
kể về sinh khối, chiều dài rễ, cây của các cây khi bổ sung chế phẩm giúp mở ra
hƣớng ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực nông nghiệp [22].
Năm 2006, Tarafdar và Gharu tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh phân giải
phytate từ các chủng nấm mốc cho cây lúa mì. Chiều dài cây và sản lƣợng lúa mì có
sự thay đổi đáng kể sau khi bổ sung chế phẩm [22].


14

Các nghiên cứu những năm tiếp theo bổ sung cho việc tìm ra thành phần dinh
dƣỡng phù hợp nhằm tăng hiệu quả tổng hợp enzyme phytase [27].
Năm 2007, nghiên cứu của Baharak đã chỉ ra hàm lƣợng cacbon và nitơ tốt
nhất để sản xuất phytase tối đa là 1,5% glucose và 0,5% dịch chiết malt, pH ổn định
của các enzyme từ 4-10 nhƣng pH tối ƣu đƣợc tìm thấy là 6 [21].
Cùng với các nghiên cứu về thành phần dinh dƣỡng, nuôi cấy thích hợp thì
việc đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng từ môi trƣờng bên ngoài đến hoạt động của
enzyme cũng dần đƣợc quan tâm.
Năm 2012, nghiên cứu của B. Sasirekha đã bổ sung khoảng nhiệt độ hoạt
động từ 30ºC đến 50ºC, trong đó 37ºC là nhiệt độ enzyme hoạt động mạnh nhất
[24].

Năm 2013, Nabil et al đã tiến hành thu enzyme phytase sau 4 ngày nuôi cấy
từ 3 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase cao, lƣợng phytase
tổng hợp thu đƣợc đánh giá cao với 720 U/ml tại pH = 7 [27].
Vào những năm gần đây, các nghiên cứu enzyme phytase có xu hƣớng tinh
sạch, nâng cao phẩm chất enzyme tái tổ hợp và mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng.
Năm 2014, Moushree Pal Roy đã tinh sạch và đánh giá khả năng hoạt động
của phytase từ 2 loài vi khuẩn đƣợc phân lập từ phân bò, kết quả đã chỉ ra enzyme
thu đƣợc có thể giữ đƣợc 80% hoạt tính tại nhiệt độ lên đến 75ºC [41]
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu bƣớc đầu về nghiên cứu tổng hợp
enzyme phytase từ các chủng nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn thuộc chi Bacillus.
Các nghiên cứu đầu tiên thƣờng tập trung vào việc tuyển chọn những chủng nấm
mốc và vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phytase cao.
Năm 2013, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Giang đã phân lập 6 chủng
vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis có khả năng sinh phytase ngoại bào với hoạt độ
phytase mạnh nhất là 19U/ml [6].


15

Vào năm 2014, nghiên cứu của Mạch Trần Phƣơng Thảo đã tiến hành khảo
sát các yếu tố về nhiệt độ, độ ẩm, tỉ lệ nƣớc và tỉ lệ bổ sung đậu nành để tăng hiệu
suất quá trình thủy phân phytate [16].
Đến năm 2015, nghiên cứu của Võ Đức Tuấn đã bổ sung thêm các dữ liệu
khoa học về ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt tính phytase [19].
Năm 2015, chủng nấm mốc Aspergillus fumigatus có khả năng tổng hợp
phytase cao đã đƣợc Nguyễn Thị Hà phân lập và tiến hành nghiên cứu khảo sát môi
trƣờng thích hợp để đạt hiệu suất cao nhất [7].
Các kĩ thuật sinh học hiện đại đã đƣợc áp dụng trong các nghiên cứu ở những
năm gần đây.

Năm 2015, nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Huyền về việc tinh sạch và xác định
tính chất của phytase tái tổ hợp đã cho thấy gen mã hóa cho phytase từ vi khuẩn
Bacillus subtilis đã đƣợc biểu hiện thành công trong E.coli BL21[17].
Hiện nay việc khai thác tiềm năng của enzyme phytase trong lĩnh vực nông
nghiệp và nuôi trồng thủy hải sản là một trong những hƣớng mở rộng nghiên cứu
enzyme phytase.

1.5. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ
Mã vạch ADN là công cụ đánh giá sự đa dạng di truyền, lập cây chủng loại
phát sinh dựa trên việc phân tích và so sánh các một số trình tự gen bảo thủ nên có
thể cho phép nhận diện, phân loại các mẫu vi sinh vật, dƣới loài địa lý và loài dễ
gây nhầm lẫn ở cấp độ gen với mức độ chính xác rất cao. Gần đây, việc áp dụng kỹ
thuật này đã đạt đƣợc nhiều tiến bộ, đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế
giới trong đó có Việt Nam.
Nhóm các gen bảo thủ thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di
truyền ở vi nấm bao gồm trình tự 18S, 28S rADN, gen mã hóa calmodulin (CaM)
và các gen phiên mã nội (Internal transcribed spacer, ITS) [46]. Ví dụ, nhóm nghiên