kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp vi sinh

Bài 9
KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
MỤC TIÊU
1. Giải thích được nguyên tắc của một số phương pháp sinh học dùng trong kiểm
nghiệm thuốc.
2. Viết được 1 dự thảo qui trình kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học:
thử độc tính bất thường, thử chất gây sốt, thử vô khuẩn, thử giới hạn nhiễm khuẩn,
định lượng kháng sinh.
3. Áp dụng được các qui trình kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học của
Dược điển Việt Nam 4 trong kiểm tra chất lượng thuốc.
NỘI DUNG
1. ĐẠI CƯƠNG
Trong ngành Dược sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra chất
lượng thuốc: phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp hoá lý…
Các phương pháp phân tích hoá học, hoá lý, vật lý…tiến hành nhanh, chính
xác nhưng chỉ áp dụng được với các thuốc có thành phần hoá học đã biết. Một số
thuốc có yêu cầu về kiểm tra hiệu lực tác dụng hoặc những đặc tính riêng biệt như:
hiệu lực và độ an toàn của vaccin, độc tính bất thường của thuốc từ dược liệu, yếu
tố gây sốt của một số loại thuốc… những tiêu chuẩn này không thể xác định được
bằng phương pháp hoá học hay hoá lý mà phải dùng phương pháp sinh học.
1.1. Nguyên tắc
Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc: So sánh
hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng
trong cùng một điều kiện và thời gian thí nghiệm.
Hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều trong kiểm nghiệm thuốc là:
- Kiểm nghiệm thuốc bằng các phương pháp thử trên động vật
- Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.
1.2. Chất chuẩn
Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giá
chất lượng mẫu thử. Chất chuẩn được chia làm 2 loại:
- Chất chuẩn gốc: Là những chất đồng nhất có độ tinh khiết cao. Chất chuẩn

gốc thường được sản xuất tại các Viện nghiên cứu quốc gia hoặc quốc tế riêng về
chất chuẩn sinh học.
- Chất chuẩn thứ cấp: Cũng là chất có độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học
được xác định theo chất chuẩn gốc quốc tế tương ứng.
Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở nhiệt độ thích hợp
tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ <50C) trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
1.3. Đánh giá kết quả
Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài và phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm ,
các điều kiện thử nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn định. Vì vậy, kết quả thử
154


nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống kê. Độ chính xác của phép thử
được thể hiện bằng giới hạn tin cậy.
2.KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG
VẬT
2.1. Đặc điểm chung
2.1.1. Nguyên tắc
Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động vật dựa trên sự đáp ứng của
động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm thử khi đưa vào cơ thể động vật một
lượng thuốc nhất định theo qui định của từng chuyên luận.
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống, không nhiễm
bệnh, không có thai và được nuôi dưỡng đầy đủ. Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khác
nhau về giống, trọng lượng, tuổi của động vật. Chất lượng của động vật quyết định
độ chính xác của phép thử.
2.1.3. Phương pháp thử nghiệm
- Phương pháp in-vivo: là phương pháp nghiên cứu trên động vật sống ở trạng
thái sinh lý bình thường của chúng. Đánh giá kết quả dựa trên sự thay đổi các thông

số: nhiệt độ cơ thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện não đồ, sự thay đổi huyết áp, phản
xạ hệ thần kinh hoặc tỷ lệ sống, chết… của động vật thí nghiệm để xác định tác
dụng và chất lượng của thuốc.
- Phương pháp in-vitro: thử tiến hành trên các cơ quan cô lập của động vật
như: tim, tử cung, ruột, máu…gọi là thử invitro.
- Phương pháp ex-vivo: là phương pháp nghiên cứu được tiến hành trên những
bộ phận hay cơ quan được lấy ra khỏi sinh vật tuy vậy vẫn đảm bảo sự hoạt động
của cơ quan đó như lúc trong cơ thể sống.
2.1.4. Liều
Liều là lượng thuốc được đưa vào cơ thể động vật một lần cho tứng mục đích
thí nghiệm. Ví dụ: LD0, LD50, LD100, MLD
2.2. Một số thử nghiệm trên động vật áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc
2.2.1. Thử độc tính bất thường
Nguyên tắc
Độc tính bất thường của thuốc được xác định bằng cách theo dõi số chuột sống
và chết trong thời gian 48 giờ sau khi cho chuột một liều thuốc qua đường dùng
theo qui định
Phạm vi áp dụng
Thí nghiệm này thường được áp dụng để thử độc tính của các thuốc đông dược
có dược liệu độc như: ô đầu, phụ tử, mã tiền…hay các chế phẩm đông dược mới.
Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, cân nặng 18 - 22 g, chưa dùng vào thí nghiệm,
nếu là chuột cái phải không có thai hoặc đang cho con bú, được chăn nuôi trong
điều kiện bình thường
Chuẩn bị dung dịch thử:
155


Hoà tan mẫu thử trong dung dịch natri clorid 0,9% hoặc nước cất tiêm (nếu
thử theo đường tiêm) hoặc phân tán đều mẫu thử trong nước cất (nếu thử theo

đường uống) để thu được dung dịch hoặc hỗn dịch có chứa lượng chất cần thử phù
hợp với mức liều qui định trong chuyên luận riêng.
Tiến hành thử
Dùng 5 chuột, cho mỗi con 0,5 ml dung dịch thử bằng một trong những đường
dùng sau:
Tiêm tĩnh mạch : Tiêm vào tĩnh mạch đuôi của mỗi chuột với tốc độ hằng định
trong 15 - 30 giây.
Tiêm trong màng bụng: Tiêm qua lớp da bụng vào thẳng hốc bụng chuột.
Tiêm dưới da: Tiêm dưới da vào một chỗ ở lưng hoặc bụng.
Uống: Cho uống bằng một kim cong đầu tù hoặc một dụng cụ khác thích hợp,
phải đảm bảo đưa thuốc vào trong thực quản hoặc dạ dày.
Đánh giá kết quả
Nếu không có hướng dẫn gì khác thì quan sát chuột 48 giờ sau khi dùng thuốc.
Nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu.
Nếu có chuột chết, làm lại thử nghiệm với 10 chuột khác, dùng chuột có thể trọng
19  1 g. Sau 48 giờ, nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu.
2.2.2. Thử chất gây sốt
 Nguyên tắc
Thử chất gây sốt là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng thuốc
tiêm, thuốc tiêm truyền tĩnh mạch bằng cách đánh giá sự tăng thân nhiệt thỏ sau khi
tiêm tĩnh mạch dung dịch vô khuẩn của chất cần kiểm tra.
Các thuốc tiêm truyền, thuốc tiêm có thể tích từ 15ml trở lên thì yêu cầu bắt
buộc phải thử chất gây sốt.
 Lựa chọn động vật thí nghiệm
Dùng thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng không dưới 1,5kg,
nuôi dưỡng bằng thức ăn không có chứa kháng sinh và thỏ không có dấu hiệu giảm
cân trong quá trình thử nghiệm. Không dùng để thử nghiệm nếu:
(a) Thỏ mới được dùng thử chất gây sốt có kết quả âm tính trong vòng 3 ngày
trước đó, hoặc
(b) Thỏ đã được dùng thử chất gây sốt có kết quả dương tính trong vòng 3

tuần.
 Khu vực lưu giữ động vật
Thỏ được nuôi giữ riêng từng con trong khu vực yên tĩnh, có nhiệt độ ổn định.
Cho thỏ nhịn ăn từ đêm trước khi thử, không cho uống nước trong quá trình thử.
Tiến hành phép thử trong phòng yên tĩnh, không có tiềng ồn, nhiệt độ phòng chênh
lệch không quá 3oC so với khu vực nuôi giữ, hoặc thỏ phải được lưu giữ ở điều kiện
phòng thí nghiệm trong khoảng ít nhất 18 giờ trước khi thử nghiệm.
 Dụng cụ thí nghiệm

156


- Dụng cụ, bơm và kim tiêm: Tất cả các dụng cụ, bơm và kim tiêm phải được
rửa sạch và tráng nước cất, sấy ở nhiệt độ 250 oC trong 30 phút hoặc 200oC trong 1
giờ.
- Hộp/ giá giữ thỏ: Các hộp/ giá giữ thỏ cho trường hợp đo nhiệt độ bằng thiết
bị điện được thiết kế để giữ ở cổ con vật nhưng không được chật quá, phần cơ thể
còn lại được thoải mái để thỏ có thể ngồi ở tư thế bình thường. Không giữ thỏ bằng
các loại kẹp hoặc giá có thể gây đau hoặc khó chịu cho con vật. Thỏ phải được cho
vào hộp hoặc giá ít nhất 1 giờ trước khi thử và giữ ở đó trong suốt quá trình thử
nghiệm.
- Nhiệt kế: Nhiệt kế hoặc thiết bị điện dùng để ghi nhiệt độ có độ chính xác
o
0,1 C và được đưa vào trực tràng của thỏ với độ sâu 5cm. Độ sâu của nhiệt kế trong
trực tràng phải giống nhau giữa các thỏ. Nếu dùng thiết bị điện, đầu đo nhiệt độ
phải được đặt trong trực tràng trong suốt quá trình thử.
Thử nghiệm sơ bộ
Chỉ nên tiến hành thử sơ bộ với những thỏ lần đầu tiên được dùng thử chất gây
sốt.
Trong vòng một đến 3 ngày trước khi kiểm tra mẫu thử, tiêm tĩnh mạch tai

10ml/ kg thỏ dung dịch natri clorid 0,9% không có chất gây sốt, đã làm ấm đến
khoảng 38o5 trước khi tiêm. Ghi nhiệt độ thỏ, bắt đầu ít nhất 90 phút trước khi tiêm
và tiếp tục trong 3 giờ sau khi tiêm. Không dùng những thỏ có nhiệt độ thay đổi quá
0,6oC vào thử nghiệm chính thức.
Thử nghiệm chính thức
Mỗi mẫu được thử trên một nhóm 3 thỏ.
Chuẩn bị và tiêm mẫu thử: Mẫu thử có thể được hòa tan trong một dung môi
không có chất gây sốt, dung dịch natri clorid 0,9% hoặc một chất lỏng được qui
định trong chuyên luận riêng. Làm ấm dung dịch thử lên khoảng 38 o5 trước khi
tiêm. Tiêm chậm dung dịch thử vào tĩnh mạch tai thỏ trong khoảng thời gian không
quá 4 phút, trừ khi có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận riêng. Lượng mẫu thử được
tiêm sẽ thay đổi tùy theo chế phẩm cần kiểm tra và được qui định trong chuyên luận
riêng. Thể tích tiêm trong khoảng 0,5 – 10ml/ kg thể trọng thỏ.
Theo dõi nhiệt độ và xác định đáp ứng
Ghi nhiệt độ thỏ 30 phút một lần, ít nhất 90 phút trước khi tiêm và tiếp tục 3
giờ sau khi tiêm. Theo dõi nhiệt độ trước khi tiêm, không dùng vào thử nghiệm nếu:
- Thỏ có chênh lệch nhiệt độ ≥ 0,2oC giữa 2 lần ghi liên tiếp, hoặc
- Thỏ có nhiệt độ ban đầu cao hơn 39o8 hoặc thấp hơn 38oC, hoặc
- Nhiệt độ của 3 thỏ trong cùng nhóm khác nhau quá 1oC.
“Nhiệt độ ban đầu” của mỗi thỏ là trung bình của 2 giá trị nhiệt độ ghi được
cách nhau 30 phút, xác định trong khoảng 40 phút ngay trước khi tiêm dung dịch
thử. “Nhiệt độ tối đa” của mỗi thỏ là nhiệt độ cao nhất ghi được cho thỏ đó trong
vòng 3 giờ sau khi tiêm. Chênh lệch giữa “nhiệt độ ban đầu” và “nhiệt độ cao nhất”
được gọi là đáp ứng. Khi chênh lệch là âm, kết quả được coi là đáp ứng bằng 0.
157


Đánh giá kết quả:
Đầu tiên thử trên một nhóm 3 thỏ, tùy thuộc vào kết quả thu được, thử thêm
lần lượt từng nhóm 3 thỏ khác cho đến khi tổng cộng 4 nhóm, nếu cần. Nếu tổng

đáp ứng của nhóm đầu tiên không vượt quá số ghi trong cột 2 của bảng dưới đây, thì
mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu tổng đáp ứng vượt quá số ghi trong cột 2 nhưng không
vượt quá số ghi trong cột 3 thì lặp lại phép thử trên nhóm khác như đã nêu ở trên.
Nếu tổng các đáp ứng lớn hơn số ghi trong cột 3 thì mẫu thử không đạt yêu cầu.
Số thỏ
Mẫu thử đạt nếu tổng đáp ứng
Mẫu thử không đạt nếu tổng
không vượt quá
đáp ứng vượt quá
3
1,15
2,65
6
2,80
4,30
9
4,45
5,95
12
6,60
6,60
Những thỏ có nhiệt độ tăng cao quá 1,2 oC thì loại và không bao giờ dùng lại
cho phép thử chất gây sốt.
2.2.3. Một số ứng dụng khác của phép thử tác dụng của thuốc trên động vật
Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loại
dược phẩm có tính chất đặc biệt như: Phép thử histamine, phép thử chất hạ áp, phép
thử xác định độc tố thần kinh tồn dư trong vaccin bại liệt sống, xác định hiệu lực
vaccine dại theo phương pháp Habel, xác định hiệu lực vaccine dại theo phương
pháp NIH…
3.KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN VI SINH

VẬT
3.1. Đặc điểm chung
Nguyên tắc: Đánh giá tác dụng ức chế của chế phẩm mang thử trên các chủng
VSV gây bệnh.
Vi sinh vật
- Các chủng vi sinh vật :
- Các chủng vi nấm:
Cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm
- Thiết kế đồng bộ
- Kiểm soát giới hạn tiểu phân trong không khí
- Kiểm soát số vi sinh vật trong không khí
- Trang bị đầy đủ dụng cụ thí nghiệm, trang thiết bị nuôi cấy vi sinh vật, thiết
bị hỗ trợ kiểm tra đánh giá kết quả thử nghiệm
An toàn phòng thí nghiệm sinh học
- Cần xây dựng qui tắc an toàn sinh học cho phòng thí nghiệm
- Đảm bảo tất cả qui tắc an toàn sinh phọc phải được tuân thủ nghiêm ngặt
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằm
đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.
158


Môi trường cần có 3 điều kiện như sau: Đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầu
thí nghiệm, có pH trong khoảng qui định và phải vô trùng.
3.2.1. Phân loại môi trường
Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thành
phần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng.
+ Theo bản chất
- Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn
gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác định.

- Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với
hàm lượng xác định
- Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của
môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.
+ Theo trạng thái vật lý
- Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường
lỏng dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.
- Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng
để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng
mật độ vi sinh vật.
- Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp
+ Theo mục đích
- Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn
lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.
- Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối
tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng sinh
chọn lọc Salmonella
- Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn
lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:
 Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin,
oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide)
 Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium
tellurite, sodium lauryl sulfate;
3.2.2. Phương pháp pha chế môi trường
Khi pha chế môi trường cần tiến hành qua 6 bước sau:
3.2.2.1. Chuẩn bị dụng cụ hoá chất:
Dụng cụ pha chế môi trường tốt nhất là bằng men hoặc thuỷ tinh. Các dụng cụ
phải rửa sạch, hoặc tiệt trùng nóng trước khi dùng.
Nguyên liệu pha chế môi trường phải đảm bảo chất lượng, hoá chất phải tinh
khiết. Nếu là dạng bột hoặc tinh thể phả khô, không đổi màu, không chảy nước.

3.2.2.2. Cân đong nguyên liệu:
Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hoá chất hoặc
nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt…) phải được cân
bằng cân phân tích.
159


3.2.2.3. Hoà tan nguyên liệu:
Thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường. Các hoá
chất được hoà tan nóng hoặc lạnh tuỳ theo tính chất của chúng. Môi trường không
có thạch nên hoà tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun cho thạch
tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào.
3.2.2.4. Điều chỉnh pH:
Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45-50 0C để pH ít
bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử
dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ xung nước cho đủ thể tích
ban đầu.
3.2.2.5. L àm trong môi trường:
Các môi trường (bao gồm các chất hoà tan) phải trong để dễ quan sát sự phát
triển của vi sinh vật. Sau khi hoà tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc qua
vải gạc hoặc giấy.
3.2.2.6. Đóng ống, khử trùng:
Môi trường được cho vào ống nghiệm, bình nón hoặc bình cầu, tuỳ theo yêu
cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặc
bình.
Môi trường cần phải được khử trùng ngay sau khi đóng gói. Nếu để lâu, tạp
khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường.
Các môi trường thông thường được khử trùng 110 0C/ 30 phút hoặc 1200C/ 20
phút.
Môi trường có các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt, cần khử trùng ở nhiệt độ thấp

bằng phương pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn. Môi trường được lấy
ra khỏi nồi hấp ngay sau khi khử trùng xong. Nếu để lâu trong nồi hấp môi trường
bị chuyển mầu và giảm chất lượng.
3.2.3. Pha chế môi trường từ hỗn hợp bột môi trường chế sẵn:
Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trường
đông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGHMEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi trường ở
các lần kiểm nghiệm khác nhau. Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ các môi
trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan, chỉnh pH và hấp
khử trùng.
Phương pháp pha chế môi trường này được thực hiện như sau:
- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn
- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần
thiết. Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại. Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cần
phải gia nhiệt để làm tan môi trường.
- Điều chỉnh pH môi trường. Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N
- Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho các
dụng cụ chứa.
- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp.
160


- Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy
3.2.4. Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường:
- Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bị
hỏng
- Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác
- Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn
- Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường,
giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọn lọc bị
mất, tạo thành các chất ức chế mới.

- Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid
- Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ở
phòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm)
3.2.5. Bảo quản môi trường
- Môi trường bột khô được giữ ở 10-120C trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
- Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4-10 0C trong 1-2 tháng tuỳ theo
thành phần môi trường .
3.3. Các phương pháp khử trùng
Khử trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn vi
sinh vật sống được. Khử trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý, hoá học.
Chọn phương pháp khử trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá và độ bền vững
của môi trường .
3.3.1. Khử trùng bằng nhiệt khô:
Phương pháp này dùng để khử trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt độ
như bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…
Điều kiện để tiệt trùng là: 180 0C/ 30 phút hoặc 1700C / 1 giờ, hoặc 1600C/ 2
giờ.
Các dụng cụ thuỷ tinh để đóng môi trường phải được tiệt trùng khô trước khi
dùng.
3.3.2. Khử trùng bằng hơi nước:
Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để khử trùng môi trường nuôi
cấy và các dụng cụ phẫu thuật.
- Môi trường thường được khử trùng bằng nồi hấp ở 1200C/ 20 phút.
Các môi trường thường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa,
bia, máu, albumin… cần khử trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau:
+ Khử trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall):
Môi trường được hấp 3-4 lần ở nhiệt độ không quá 100 0C trong 30-40 phút,
cách nhau 24 giờ. Giữa hai lần hấp cho môi trường vào ủ ở 28-32 0C/ 24 giờ cho bào
tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo.
+ Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur):

Đun cánh thuỷ môi trường 600C/ 30 phút, hoặc 800C/ 15 phút sau đó làm lạnh
đột ngột ở 100C. phương pháp này không diệt được bào tử.
161


 Phương pháp lọc:
Phương pháp lọc được dùng để khử trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt.
Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc  0,22ỡm. Phần chảy qua
phễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được khử
trùng trước khi dùng.
3.3.3. Khử trùng bằng các tia bức xạ:
Tia tử ngoại (UV) được dùng nhiều nhất để khử trùng các buồng pha chế, tủ
cấy vi sinh vật.
Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp,thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và
liều lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng.
Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối
hợp thêm phương pháp dùng hoá chất để khử nấm.
3.4. Một số thử nghiệm trên vi sinh vật được áp dụng trong kiểm nghiệm
3.4.1. Thử vô khuẩn
3.4.1.1. Phạm vi và điều kiện áp dụng
Kỹ thuật này áp dụng để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm mốc và nấm
men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải
vô khuẩn.
Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong buồng
thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm. Trong quá
trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh hưởng đến vi khuẩn,
nấm mốc, nấm men (như: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ...).
Các dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khi
dùng.
3.4.1.2. Nguyên tắc

Cấy mẫu thử vào môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nước và giữ ở điều
kiện nhiệt độ thích hợp. Sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu thử làm cho môi
trường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy môi trường,
hoặc thay đổi màu sắc môi trường.
3.4.1.3. Lựa chọn phương pháp
- Phương pháp màng lọc: chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môi
thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào
môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui
định
- Phương pháp cấy trực tiếp: lấy một lượng chế phẩm đủ dùng theo qui định,
cấy trực tiếp vào môi trường.
Trước khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc chai, lọ, bình ...)
đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp.
3.4.1.4. Chuẩn bị môi trường và dung môi
+ Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng
và trong).
162


Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế
phẩm đặc hoặc đặc sền sệt dạng cao).
Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc: Soybean - casein
Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúng
qui định.
Dung môi dùng để hoà loãng
Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử
nghiệm. Chỉ được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có
tính kháng khuẩn và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thường dùng các
dung môi sau đây:

Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm)
cho trong. Điều chỉnh pH bằng 7,1  0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng
100 ml. Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút.
Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung
môi, dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin.
Dung môi C: isopropyl myristat
Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu.
3.4.1.5. Tiến hành thử theo phương pháp màng lọc
Dụng cụ
Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm:
- Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để
ghép nối; hệ thống hút chân không.
- Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m.
Loại màng Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu và
các dung dịch có lượng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat được dùng
cho các chế phẩm dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng
sinh cần phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng kháng
sinh trên màng sau khi lọc.
- Kéo cắt màng lọc.
Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng
13.7.1. DĐVN 4
Kỹ thuật thử
Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng
mẫu cần thử như qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian
lọc. Rửa màng lọc ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn.
Lấy màng lọc ra khỏi giá đỡ trong phễu lọc. Cấy màng lọc vào môi trường bằng nhúng
chìm vào loại môi trường để phát hiện nấm hoặc vi khuẩn.
Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc

qua màng dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm
tra để biết chắc chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên
163


màng. Chuyển toàn bộ màng lọc vào môi trường nuôi cấy thích hợp để phát hiện vi
khuẩn, nấm mốc.
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trường thyoglycolat ở 30 0C
đến 350C và ủ môi trường soybean - casein ở 200C đến 250C ít nhất 14 ngày.
Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu...) thì dùng 100 ml dung
môi B cho chảy qua dụng cụ. Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã được thấm
ướt bằng dung môi A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử.
3.4.1.6. Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp
+ Dụng cụ:
Dụng cụ dùng cho phương pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm, pipet, các ống
nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm đều phải đảm bảo vô khuẩn mới được sử
dụng vào thử nghiệm.
+ Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ở
bảng 13.7.1. DĐVN 4
+ Lựa chọn môi trường
- Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí:
Môi trường thioglycolat: Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và
trong.
Môi trường thioglycolat không có thạch Dùng cho thử nghiệm những chế
phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao
- Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trường Soybean – casein:
+ Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường

Thành phần
Môi trường
Môi trường
thioglycolat có thạch
thioglycolat không có
thạch
L-Cystin
0,50g
0,50g
Natriclorid
2,50g
2,50g
Dextrose (C6H12O6.H2O
5,50g
5,50g
Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%)
0,75g
0,0
Cao men bia (có khả năng tan trong
5,0g
5,0g
nước)
Casein pancreatic
15,0g
15,0g
Natri thioglycolat
0,50g
0,50g
(hoặc acid thioglycolic 0,3 g )
Resazurin (dung dịch 0,1% mới

1,0ml
1,0ml
pha
Nước cất
1000ml
1000ml
pH sau khi tiệt khuẩn
7,1 ±0,2
7,1 ±0,2
164


Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và
thioglycolat) trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang
dụng cụ thích hợp. Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo
thành dung dịch trong. Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N
điều chỉnh sao cho môi trường sau khi tiệt khuẩn có pH7,1  0,2. Đun nóng lại dung
dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch
resazurin trộn đều. Đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn ở
1210C trong 18 - 20 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 25 0C, tiếp tục bảo quản ở
nhiệt độ 20 - 300C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc bình)
môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục
hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh đột ngột.
Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môi trường
phục hồi lần 2. Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3 tuần.
Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy
đều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh để cho
pH sau khi tiệt khuẩn đạt 7,1  0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào các ống
nghiệm (hoặc bình) thích hợp. Hấp tiệt khuẩn 1210C trong khoảng 18 - 20 phút. Sau
khi tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 25 0C, môi trường không được đun nóng trở

lại.
Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trường Soybean - casein
Casein pancreatic
17,0
Bột papaic soybean
g
Natri clorid
3,0 g
Dikali
hydrophosphat
5,0 g
(K2HPO4)
2,5 g
Dextrose (C6H12O6.H2O)
2,5 g
Nước cất
1000
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3
ml
 0,2
Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để
nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếu
cần) cho pH sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường
trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 121 0C trong khoảng
20 phút.
Kiểm tra chất lượng môi trường
Độ vô khuẩn:
Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở
nhiệt độ 30 - 350C trong 4 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi

khuẩn hiếu khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20 - 25 0C trong ít nhất 7 ngày đối với những
loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc. Các loại môi trường phải không
được có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
165


Khả năng dinh dưỡng:
Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những
loại vi khuẩn sau:
Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.
Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404.
Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231.
Aspergillus niger ATCC 16404
Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở
nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày
đối với nấm mốc. Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn
mọc tốt.
Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử:
Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới người
ta đã cho thêm chất bảo quản. Loại chế phẩm này có ảnh hưởng đến sự phát triển
của vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vi
khuẩn nấm mốc.
Đối với vi khuẩn kỵ khí
Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng
chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium
sporogenes ATCC 9404 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp).
Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi
cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào Clostridium sporogenes ATCC 9404. Đem ủ tất
cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày.

Đối với vi khuẩn hiếu khí
Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng
chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus
ATCC 6538 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn
lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào
mỗi ống 100 tế bào Staphylococcus aureus ATCC 6538. Đem ủ tất cả các ống ở 30
- 350C ít nhất 7 ngày.
Đối với nấm mốc
Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm, mốc. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy
vào mỗi ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231. Hai ống
dùng kiểm tra, cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và
một lượng chế phẩm bằng nhau. Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 250C ít nhất 7 ngày.
Đánh giá kết quả:
Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú),
đối với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không
có tác dụng ức chế.

166


Nếu trên các ống môi trường có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọc
yếu, chậm phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt: Mẫu
thử có tác dụng ức chế. Phải loại bỏ tác dụng ức chế.
Tác dụng ức chế của mẫu thử có thể loại bỏ được một cách có kết quả bằng
cách cấy truyền nhắc lại trên một loạt môi trường mới hoặc lọc qua màng lọc vi
khuẩn.
Kỹ thuật thử
Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trường theo số
liệu ở bảng 2. Nếu mẫu thử là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trường và chú ý lắc
để mẫu thử phân tán đều trong môi trường. Nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận

riêng thì ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 30 0C - 350C ; ủ môi trường phát hiện
nấm mốc ở 200C - 250C, thời gian ít nhất 14 ngày; thường xuyên theo dõi các môi
trường đã cấy. Nếu chế phẩm làm đục môi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự
mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trường 3 - 7 ngày nên chuyển một phần nhỏ môi
trường này sang một loạt môi trường mới cùng loại. Tiếp tục ủ các ống môi trường
đã cấy lại ít nhất 7 ngày.
Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thước và
hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng. Khi
mẫu thử là dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ...) thì dùng dung môi A hoặc B (mục
chuẩn bị môi trường và dung môi) cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa,
cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trường nuôi cấy. ủ và đọc kết quả như đã ghi ở
trên.
3.4.1.7 Theo dõi và đánh giá kết quả
Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trường đã cấy màng
lọc hoặc mẫu thử . Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gian
qui định, mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm
mốc mọc, cần phải:
Rà soát lại qui trình thử.
Thử lại các mẫu thử nghi ngờ (lần thứ 2).
Giữ lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường, cấy lại với vi
khuẩn hoặc nấm đã mọc ở môi trường cũ.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm
lần đầu, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí
nghiệm đầu tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi.
Ở lần thử thứ ba: nếu không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử
được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần
lặp lại này, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.

167


3.4.2. Thử giới hạn nhiễm khuẩn
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm,
mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong
thuốc.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí
nghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.
Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và
thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất.
Thử nghiệm sơ bộ
Tìm chất ức chế có trong thuốc:
Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong
thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm
tra trước bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào
môi trường chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus,
Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng
với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới 10 -3 các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi
khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách:
1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường.
2. Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp.
3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được.
Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để
trung hoà chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %.
Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra
đã được trung hoà.
Môi trường
Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi

trường khô do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường
tự pha chế phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115 oc trong 30 phút trừ khi
có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt.
Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước và các chất
dùng trong các công thức phải tinh khiết.
Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat
Môi trường thạch casein đậu tương
Môi trường lỏng casein đậu tương
Môi trường thạch muối - manitol
Môi trường thạch Baird - Parker
Môi trường thạch Vogel – Johnson
Môi trường thạch cetrimid
Môi trường thạch pseudomonas - fluorescin
Môi trường thạch pseudomonas - pyocyanin
Môi trường lỏng lactose
Môi trường lỏng Selenit - Cystin
168


Môi trường lỏng tetrathionat
Môi trường thạch xanh brilliant
Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat
Môi trường thạch bismuth sulfit
Môi trường thạch - sắt - ba đường
Môi trường mac - conkey
Môi trường thạch levine - eosin - xanh methylen
Môi trường thạch Sabouraud
Môi trường thạch - khoai tây - glucose
Dung dịch đệm natri clorid – pepton ph 7,0
Môi trường nước thịt

Môi trường thạch thường
Môi trường pepton - natri clorid
Môi trường tăng sinh cho clostridia
Môi trường thạch columbia
Môi trường sulfit - lactose
Môi trường lỏng enterobacteria - mossel
Môi trường muối mật violet - red
Chuẩn bị thí nghiệm
Lấy mẫu:
Lượng mẫu cần lấy: 10ml hoặc 10g chế phẩm.
Cách thử nghiệm:
Để xác định giới hạn vi khuẩn của mỗi chế phẩm phải thực hiện đầy đủ các
thử nghiệm sau:
Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn có
trong 1g hoặc 1ml chế phẩm.
Đếm tổng số nấm mốc sống lại được, tính ra số lượng nấm mốc có trong 1g
hoặc 1ml chế phẩm.
Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau:
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella
Escherichia coli
Chuẩn bị mẫu
Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hoà tan hoặc nhũ hoá phải đảm
bảo không làm thay đổi chủng loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thuốc. để có một
dung dịch hoặc nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành như sau:
- Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong
bình với dung môi hoặc chất nhũ hoá thích hợp.
- Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất
rắn hòa tan dễ dàng và hoàn toàn trong nước..., dùng dung dịch đệm phosphat ph

7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9% để hoà loãng.
169


Những chế phẩm lỏng không thể hoà lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp:
chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thích
hợp như các loại polysorbat. Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời
làm ấm bằng nhiệt nhưng không được vượt quá 45oc để có nhũ dịch chế phẩm đồng
nhất.
Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: làm lạnh bình để các khí hoá lỏng rồi
mở nắp để lấy một lượng thích hợp mang thử.
Tiến hành
Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí:
Nếu chế phẩm hoà tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương
pháp đĩa thạch. Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hoà loãng trong ống
nghiệm.
Hoà tan hoặc làm nhũ hoá 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml
dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loại
chế phẩm, để được dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10.
Đối với những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ
1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ
lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v...
Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vi
khuẩn hiếu khí. Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy mà
không được để quá 1 giờ.
Dung dịch đệm pH 7,2: hoà 34g kali dihydrophosphat (kh 2po4) vào khoảng
500 ml nước cất trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 bằng
cách thêm dung dịch natri hydroxyd 2%. Thêm nước cất tới vạch. Trộn đều, phân
chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi dùng, hoà loãng với nước cất
theo tỷ lệ 1: 800 và tiệt khuẩn.

a) Phương pháp đĩa thạch
Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường
trong một hộp petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch
có độ pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15
- 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun
chảy và để nguội đến 45oC. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó
để yên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 35 oC từ 24
- 48 h. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy
giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn
hơn 300 và tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml chế phẩm. Nếu thấy không
có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10
khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml.
b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm
Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏng
casein đậu tương. Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. dùng một lô 3
ống để kiểm tra.
170


khuẩn mọc
vi có ốngsốsốống có vi khuẩn mọc

Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống a) 1 g (hoặc1 ml) chế phẩm
và trộn đều.
Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống b) 1 ml dung dịch lấy từ ống
a và trộn đều.
Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống b và trộn đều.
bỏ không sử dụng ống a và ống b.
Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tương ứng với lượng chế phẩm là: 100;
10; và 1 mg hoặc l trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 32 - 35 oC trong 24

giờ, quan sát vi khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng 1 để
biết số lượng vi khuẩn có trong 1 g hoặc 1ml chế phẩm.
Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm.
số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống
100
10
1
số lượng vi khuẩn lớn nhất
có thể có trong 1 g hoặc 1
ml
3
3
3
>1100
3
3
2
1100
3
3
1
500
3
3
0
200
3
2
3
290

3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
0
90
3
1
3
160
3
1
2
120
3
1
1
70
3
1
0
40
3
0

3
95
3
0
2
60
3
0
1
40
3
0
0
23
c) Phương pháp màng lọc:
Dùng các màng lọc có kích thước lỗ lọc không lớn hơn 0,45 µm, có khả năng
giữ lại các vi khuẩn cần kiểm tra. Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại
vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến mẫu thử. Thí dụ có thể dùng màng Cellulose
nitrat để lọc các dung dịch nước, dầu và cồn thấp độ. Dùng màng cellulose acetat để
lọc dung dịch cồn cao độ. Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển được
màng lọc vào môi trường nuôi cấy.
Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đã pha theo mục “Chuẩn bị
mẫu”, (Tốt nhất là lấy một lượng dung dịch mẫu đã chuẩn bị tương đương với 1g
hoặc 1ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng
171


dung dịch mẫu ít hơn). Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị
phải lọc ngay qua màng. Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100ml dung dịch
thích hợp như dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0. Khi cần có thể thêm

chất hoạt động bề mặt như polysorbat 80 hoặc các chất khử hoạt tính của các chất
kháng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa. Cũng có thể rửa màng với số lần ít hơn,
nếu thấy đủ loại hết thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm khỏi
màng. Chuyển một màng lọc lên môi trường thạch dùng phát hiện vi khuẩn. Ủ ở 30°
to 35°C, theo dõi, đếm số vi khuẩn mọc trên màng. Chuyển màng lọc còn lại lên
mặt môi trường phát hiện nấm. Ủ ở 20° to 25°C, theo dõi trong khoảng 5 ngày, đếm
số nấm mọc trên màng. Nếu chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát hiện thì
có thể theo dõi, đếm trong khoảng thời gian ngắn hơn. Chọn đếm các đĩa có số
khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng. Tính số khuẩn lạc có trong 1
gam hoặc 1ml mẫu thử.
Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán
vào bình đã có sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc đều
trong 30 phút. Lọc qua 2 màng lọc để tìm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50ml dung
dịch. Tiếp tục ủ, theo dõi, đếm vi khuẩn và nấm mốc như ở trên.
Thử nghiệm tìm các vi khuẩn
a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 35 - 37 0C,
kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường,
cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol muối) và môi trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ. Sau khi
ủ kiểm tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong bảng 2 và
bảng 3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có
Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi
ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hoá của Staphylococcus aureus hoặc
Pseudomonas aeruginosa như sau:
*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch VogelJohnson (hoặc thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống
nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37 oC, kiểm tra các ống
sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24h. Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ
nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn

Môi
Thạch
Thạch
Thạch
trường
Vogel - Johnson
manitol - muối
Baird - Parker
Đặc điểm Màu đen được Khuẩn lạc màu vàng Khuẩn lạc màu đen bóng,
hình thái bao bọc bằng cùng với một vùng viền quanh bằng một
khuẩn lạc một vùng vàng
vàng xung quanh
vùng sáng rõ 2 - 5 mm
*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa):
172


Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy
ria trên mặt môi trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường
Pseudomonas phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được
cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc
lựa chọn. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC ít nhất 3
ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa để xác định
có khuẩn lạc đặc trưng theo bảng 3 hay không. Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ
nào mọc trên một hoặc nhiều môi trường. Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng
phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một mẩu
(hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước N - dimethyl - phenylen diamin dihydroclorid.
Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas
aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các phép thử sinh hoá

và nuôi cấy thích hợp khác.
Bảng 3. Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa
chọn
Thạch
Thạch
Môi trường
Thạch
Pseudomonas để
Pseudomonas để
cetrimid
phát hiện Fluorescin phát hiện Pyocyanin
Đặc điểm hình thái Màu lục nhạt Không màu đến Màu vàng nhạt
khuẩn lạc
thông thường màu vàng nhạt
Huỳnh quang ở ánh
Màu lục
Màu hơi vàng
Màu xanh nước
sáng tia cực tím
biển
Phản ứng oxydase
Dương tính
Dương tính
Dương tính
Nhuộm Gram
Trực khuẩn
Trực khuẩn
Trực khuẩn
Gram âm
Gram âm

Gram âm
b) Tìm Salmonella và Escherichia coli
Cho chế phẩm vào khoảng 100 ml môi trường lỏng lactose, ủ. Kiểm tra nếu có
vi khuẩn mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1ml cho vào một ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp
môi trường lỏng selenit - cystin và môi trường lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong 18
- 24 h. Phần còn lại của môi trường lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli.
Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ canh thang selenit cystin và tetrathionat
ria lên mặt môi trường thạch xanh brilliant, môi trường thạch bismuth sulfit trong
các đĩa Petri. Đậy đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra, nếu không thấy có khuẩn lạc dạng
như mô tả ở bảng 4, chế phẩm không chứa các nòi Salmonella.
Bảng 4. Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa chọn

Môi trường
Thạch xanh brilliant

Mô tả khuẩn lạc
Khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng đục,
nhỏ, rõ nét (thường bao quanh bằng một vùng màu hồng tới
đỏ)
Thạch xylose - lysin Khuẩn lạc màu đỏ, có thể chấm đen ở trung tâm
- desoxycholat
173


Thạch bismuth sulfit Khuẩn lạc màu đen hoặc màu xanh
Nếu thấy khuẩn lạc, đem nhuộm soi thấy gồm những trực khuẩn hình gậy,
Gram âm phù hợp với mô tả ở bảng 4, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc
nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước
tiên cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ.
Kiểm tra không thấy môi trường bị kiềm hoá (màu đỏ) ở phần nghiêng và acid hoá

(màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc không có kèm theo màu đen ở phần dựng
đứng do sinh H2S. Chế phẩm không chứa các nòi Salmonella.
Tìm Escherichia coli:
Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đã có vi khuẩn mọc ở trên bề mặt
môi trường thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ. Kiểm tra nếu không có
khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chế phẩm không có Escherichia coli.
Nếu có khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên
mặt thạch Levine - eosin - xanh methylen trong các đĩa Petri . Nếu có nhiều khuẩn
lạc nghi ngờ, chia đĩa thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc đã lựa chọn.
Đậy đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra nếu không có những khuẩn lạc thể hiện cả hai đặc
tính ánh kim dưới ánh sáng phản chiếu, và màu đen xuất hiện ở ánh sáng truyền
qua, mẫu chế phẩm không có Escherichia coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm
sinh hoá và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có mặt của Escherichia coli trong chế
phẩm.
Bảng 5: Đặc điểm hình thái của Escherichia coli trên thạch Mac - Conkey

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Khuẩn lạc màu đỏ gạch, có thể có vùng mật kết
tủa bao quanh
Nhuộm Gram
Trực khuẩn Gram âm
c) Phát hiện Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác
Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp như
đã mô tả ở phần chế tạo mẫu thử nghiệm và ủ ở 35 - 37 oC một thời gian thích hợp (thường từ 2 - 5 h) trong môi trường canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không
làm tăng vi khuẩn. Lắc bình chứa và chuyển một lượng đã đồng nhất của chế phẩm tương đương khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng
Enterobacteria - Mossel và ủ ở 35 - 37 oC trong 18 - 24 h. Cấy lên đĩa thạch muối mật
violet-red có chứa lactose và glucose ủ ở 35 -37 oC trong 18 - 48 h. Chế phẩm không có
Enterobacteria nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn Gram âm trên đĩa.
Đánh giá số lượng: ủ một lượng thích hợp môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel

với những lượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g và 10
mg hoặc 1,0 ml; 0,1 ml và 10 l. Nếu cần có thể pha loãng chế phẩm, ủ ở 35 -37 oC trong
24 - 48 h. Các khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc đĩa đỏ, nhuộm vi khuẩn bắt
màu Gram âm, chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó
cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính.
Xác định số lượng Bacteria theo bảng 6.
Bảng 6. Tính lượng Bacteria trong chế phẩm

174


Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm
1,0 g hoặc 0,1 g hoặc 0,01 g hoặc 0,01
1 ml
0,1 ml
ml
+
+
+
+
+
+
-

Số Bacteria
có trong 1 gam sản phẩm
Lớn hơn 102
ít hơn 102 nhưng lớn hơn 10
ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1
ít hơn 1

Đếm tổng số nấm, mốc, và men
Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí,
nhưng sử dụng môi trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tâyglucose, ủ các đĩa ở nhiệt độ ở 20 - 25oC, theo dõi trong 5 ngày.
Tìm Clostridia
Thử nghiệm thứ nhất dùng cho những sản phẩm qui định không có Clostridia.
Thử nghiệm thứ hai là bán định lượng đối với Clostridium perfringens ỏp dụng với
những sản phẩm có tiêu chuẩn về số lượng Clostridium perfringens.
Thử nghiệm tìm Clostridia
Chuẩn bị mẫu thử như trong mục “ chuẩn bị thí nghiệm”. Lấy hai mẫu để kiểm
tra khoảng 1 g (ml) mỗi mẫu, cho vào hai bình đã chứa sẵn 100 ml môi trường tăng
sinh cho Clostridia. Một mẫu đem đun nóng tới 80 oC trong 10 phút rồi làm lạnh
ngay. ủ cả hai mẫu ở điều kiện kỵ khí, ở 35 - 37 oC trong 48h. Sau khi ủ từ mỗi
bình cấy chuyển sang một ống môi trường thạch Columbia đã thêm gentamycin và
tiếp tục ủ ở 35 - 37oC trong 48h. Nếu không thấy có vi khuẩn mọc, mẫu thử đạt yêu
cầu.
Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi
trường thạch Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu
khí. Khi chỉ thấy mọc ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dương (có hoặc không
có nội bào tử); phản ứng catalase âm tính tức là có Clostridium spp. Nếu cần so
sánh sự phát triển của khuẩn lạc trên hai đĩa và dùng thử nghiệm catalase để loại trừ
những nòi Bacillus spp. kỵ khí và hiếu khí có phản ứng catalase dương tính. Thử
nghiệm này cũng được dùng để phân biệt những khuẩn lạc cùng dạng trên thạch
hoặc bằng cách chuyển vi khuẩn lên trên phiến kính và nhỏ dung dịch nước oxy già
loãng, nếu thấy có sủi bọt nghĩa là phản ứng catalase dương tính.
Đếm Clostridium perfringens
Tạo mẫu thử như mô tả ở mục “chuẩn bị thí nghiệm”. Pha loãng bằng dung
dịch đệm pepton-natri clorid có pH 7,0 đến các dung dịch chế phẩm có nồng độ 10 2
, 10-3 . Tiến hành xác định tổng số vi khuẩn giống như xác định tổng số vi khuẩn
hiếu khí sống lại được mục “Tiến hành”. Mỗi lần chuyển 1ml đã làm đồng đều sang

một ống chứa sẵn 9 ml môi trường sulfit - lactose và một ống nhỏ Durham. Lắc nhẹ
nhàng và đem ủ ở 46 + 0,5oC trong khoảng 24 đến 48 h.

175


Các ống có màu đen (sắt sulfid) và sinh hơi trong ống Durham (ít nhất 1/10
thể tích) là có Clostridium perfringens. Tính lượng Clostridium perfringens theo
bảng 1. mục 13.6
Những nòi vi khuẩn dùng để kiểm tra:
Thử nghiệm thứ 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 và NCTC 532
Thử nghiệm thứ 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 và NCTC 6125
Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium perfringens để kiểm tra điều kiện
nhạy cảm và điều kiện kỵ khí.
Lặp lại thí nghiệm
Khi nghi ngờ, cần được thử nghiệm lại như hướng dẫn ở trên với một lượng
chế phẩm tăng gấp đôi.
Đánh giá kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho
các loại thuốc có quá trình sản xuất không tiệt khuẩn như sau:
Bảng 7. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn

Mức
1
2

3

Loại chế phẩm
Các chế phẩm dùng cho

bỏng và các vết loét sâu
Các chế phẩm dùng tại
chỗ như chữa xưng tấy,
tổn thương, và các màng
nhầy (mũi, họng, tai, âm
đạo ...)
Các chế phẩm dùng tại
chỗ cho da như kem bôi,
nước thơm, dầu, dung
dịch, bột...

4

Các chế phẩm dùng
uống; qua trực tràng;
thấm qua da.

5

Các chế phẩm có chứa
các nguyên liệu có
nguồn gốc thực vật,
động vật không thể xử lí
theo qui trình làm giảm

Yêu cầu
Không có các vi khuẩn có thể sống lại trong 1 g
(ml) mẫu thử
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc không
quá 100 trong 1 g (ml)

Mẫu thử phải không có Enterobacteria,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không
quá 500 trong 1 g (ml)
Mẫu thử phải không có Enterobacteria,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không
quá 104 trong 1 g (ml)
Tống số Enterobacteria không quá 500 trong 1
g (ml)
Nấm và mốc không quá 100 trong1 g (ml)
Không được có Salmonella trong 10 g(ml)
Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus. trong
1g(ml)
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được 5.10 4
trong 1 g (ml)
Nấm và mốc không quá 500 trong 1 g (ml)
Tổng số Enterobacteria không quá 500 trong1
g (ml)
176


lượng vi khuẩn.

Không được có Salmonella trong 10 g(ml)
Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus trong

1g(ml)

3.4.3. Xác định hoạt lực kháng sinh bằng các phép thử vi sinh vật
3.4.3.1. Mục đích
Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng ức chế một loại chủng chỉ
thị nào đó, ở điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh được
thể hiện trên chủng chỉ thị, rất khó phát hiện bằng phương pháp phân tích hoá học,
vì vậy phương pháp vi sinh vật thường giữ một vai trò quan trọng trong việc đánh
giá khả năng mất hoạt lực của kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có cấu trúc
phức tạp, hoặc thành phần gồm một hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức độ hoạt
lực chênh lệch nhau không lớn lắm
Nguyên tắc
Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so
sánh tác động ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ
thị) bởi những độ pha loãng đã biết của kháng sinh mang thử (chưa biết rõ hoạt lực)
với tác động ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã
biết rõ hoạt lực).
Thử nghiệm phải dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá những số
liệu thu được. Nếu áp dụng mô hình đường thẳng song song, hai đường log liều đáp ứng của chất chuẩn và chế phẩm thử phải song song với nhau và phải tuyến tính
trong khoảng liều đã dùng.
Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm là phương pháp
khuếch tán dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường
lỏng.
Phương pháp thứ nhất dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ chỗ chứa qua
lớp thạch đặc ở hộp Petri hoặc khay vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra một
vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng
sinh.
Phương pháp ống nghiệm dựa vào độ đục của canh khuẩn, biết được sự ức chế
phát triển của vi khuẩn gây ra bởi một loạt dung dịch kháng sinh trong môi trường
lỏng là môi trường thích hợp đối với sự phát triển của vi sinh vật khi không có

kháng sinh.
Phương tiện và dụng cụ
Tất cả các dụng cụ phải được làm sạch hoàn toàn trước và sau mỗi lần thí
nghiệm. Những dụng cụ thuỷ tinh và những đồ đựng khác dùng trong thí nghiệm
phải được loại hết vi khuẩn và chất ảnh hưởng. Các dụng cụ dùng để giữ và chuyển
chủng chỉ thị cần làm sạch cẩn thận và tiệt khuẩn bằng sức nóng khô hoặc hơi nước
ở điều kiện thích hợp.
177


Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng chỉ thị và chế tạo nhũ dịch cấy truyền,
cần thực hiện trong môi trường đảm bảo nhiệt độ qui định. Đối với phương pháp đo
độ đục, cần kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ sao cho nhiệt độ quanh các
ống nghiệm phải đồng đều và phải đạt được nhiệt độ cần thiết trong ống nghiệm.
Nên dùng điều nhiệt bằng nước luân chuyển sẽ tốt hơn điều nhiệt bằng không khí.
Máy đo quang phổ: Được dùng để đo sự truyền qua hoặc hấp thụ trong khoảng
sóng khá hẹp, do đó cần có máy đo quang thích hợp có thể thay đổi được bước
sóng hoặc dùng dùng kính lọc 650 nm hoặc 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy đã pha
chế và dùng kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng ở phương pháp đo độ đục.
Dùng canh thang đã tiến hành như mẫu nhưng thêm ngay dung dịch formaldehyd để
chỉnh máy cho độ hấp thụ về điểm “ 0 ”
Dụng cụ thí nghiệm:
- Phương pháp khuếch tán: Dùng các khay hoặc đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc
plastic, đạt tiêu chuẩn bằng phẳng. Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đường kính 100
mm, cỡ lớn đường kính lớn hơn 160 mm. Các khay thí nghiệm đã được tiêu chuẩn
hoá, bằng kính hoặc plastic với kích thước 25 x 25 cm (loại vuông) hoặc 28,8 x 19,8
cm (loại chữ nhật). Có thể sử dụng những chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn bằng
phẳng.
ống trụ bằng thép không rỉ, bằng thuỷ tinh, hoặc bằng sứ, có kích thước như
sau: Đường kính ngoài 8,0 mm; đường kính trong 6,0 mm; cao 10,0 mm.

Vật liệu dùng làm ống trụ phải là loại trơ, riêng đối với kháng sinh nhạy cảm
với ánh sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu. Khi dùng phải làm sạch cẩn thận,
loại hết cặn, khử khuẩn. Đôi khi phải rửa bằng acid như dung dịch acid nitric 2M,
hoặc acid sulfocromic.
Dụng cụ dùng cho phương pháp đo độ đục: Dùng các ống nghiệm loại 16 x
125 mm hoặc 18 x 150 mm bằng thuỷ tinh có cùng chiều dài, đường kính và độ dày,
bề mặt phải không có vết xước, không dây bẩn. Khi dùng, ống nghiệm phải sạch
hoàn toàn, đảm bảo không còn vết kháng sinh hoặc vết các chất tẩy rửa và phải tiệt
khuẩn trước khi dùng.
Môi trường, dung môi và chất pha loãng
Phải dùng các chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế.
Môi trường
Công thức môi trường cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh được đánh
số từ 1 đến 7 và được trình bày trong phần Phụ lục. Các loại môi trường này có thể
được thay thế bằng môi trường khô tương ứng hoặc bằng một loại môi trường thúc
đẩy vi sinh vật phát triển tốt hơn mà cùng cho một đường đáp ứng tương tự. Pha
môi trường bằng cách hoà tan thành phần trong công thức vào một phần nước, sau
đó thêm nước vừa đủ một lít. Dùng dung dịch acid HCl 1N hoặc dung dịch natri
hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trường sao cho sau khi tiệt khuẩn ở 121 oC trong 15
phút có pH như ghi trong công thức. Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn có thể kéo
dài tới 30 phút đối với những môi trường có thể tích lớn hơn 500 ml.
178