bai giang sac ky long hieu nang cao hplc

Lựa chọn công nghệ nào?
2


MỞ ĐẦU
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân tích đồng thời
các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ
điển không đáp ứng được
• Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện đại khác như
sắc ký khí, điện di, điện. Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích
hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống: Công nghiệp, môi
trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, sinh học, hình sự,..đặc biệt là trong Y –
Dược học.
• Cơ sở của sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa trên sự tương tác của các thành
phần chất phân tích, pha tĩnh và pha động


Nội dung
1
2
3

Nguyên tắc – Phân loại
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
4

Các thông số đặc trưng

4

Kỹ thuật sắc ký HPLC

5

Tối ưu hóa quá trình sắc ký

6

Ứng dụng sắc ký HPLC


Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

Nguyên tắc – phân loại

5


1. Nguyên tắc – Phân loại
1.1. Nguyên tắc
* HPLC là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình
vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng
động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển
và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng
lớp qua chất nhồi cột ( pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách.
* Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Vì thế
trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lưu
giữ ít. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột
sắc ký.

Flow of Mobile Phase

I njector

Detector

T=0

T=10’

T=20’

Most

I nteraction with Stationary Phase

Least

Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng


CHẤT PHÂN
TÍCH

F1

F2

CỘT TÁCH

PHA TĨNH

PHA ĐỘNG
F3
Ft = F1 + F2 + F3



1.2. Phân loại
* Phân loại HPLC dựa vào kỹ thuật sắc ký
 Sắc ký phân bố
 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn
Phân bố

 Sắc ký trao đổi ion
 Sắc ký loại trừ kích thước

Trao đổi ion

Sàng lọc


* Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi
Pha tĩnh được nhồi trong cột
Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước
 Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản
 Trao đổi ion: silica biến tính (modified silica)
 Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính

Silica Backbone
Quaternary Amine anion exchanger
Acetate counter ion
(Standard anion exchanger carries Cl- )

Silica biên tính C18


Sử dụng pha đảo trong tách các vitamin tan trong dầu


Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

Cấu tạo máy HPLC

13


Cấu tạo máy HPLC
1 Pha động
2. Bơm
3. Hệ tiêm mẫu
4. Cột
5. Detecter

6. Máy tính

2.1. Pha động (Dung môi)
• Nhiệm vụ: Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký,
đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký
2.1.1. YÊU CẦU VỚI DUNG MÔI

 Có một hoặc nhiều bình chứa dung môi ( Thể tích 500 ml)
 Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng
của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector
 Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger)
 Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi
 Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa
dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục


2.1.2. Lựa chọn dung môi
 Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh
 Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha động là
tương đương còn pha tĩnh có độ phân cực khác biệt → thời gian phân tích ngắn
 Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: tương tác mạnh giữa
cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài
Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC
Polar Solvents
Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile
Non-polar Solvents
N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane


2.1.3. Chế độ chạy - Quá trình tách rửa (Elution)

 Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi:

isocratic
 Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực
(polarity) khác nhau nhiều: gradient elution


Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc

theo từng bậc


Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve

seperation efficiency)


Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC

Giới hạn dưới đo
UV (nm)

Chỉ số khúc
xạ

Điểm sôi
(oC)

Độ nhớt CP,
25oC

Độ phân cực

(Theo Snyder)

n-hexan

190

1,372

69

0,3

0,1

Benzen

280

1,498

80

0,6

2,7

Metylen clorit

233

1,421

40

0,4

3,1

n-propanol

240

1,385

97

1,9

4,0

Tetrahydrofuran

212

1,405

66

0,46

4,0

Etyl axetat

256

1,370

77

0,43

4,4

Clorofom

245

1,443

61

0,53

4,1

Axeton

330

1,456

56

0,30

5,1

Etanol

210

1,359

78

1,08

4,3

Axit axetic

-

1,370

188

1,1

6,0

Axetonitril

190

1,341

82

0,34

5,8

Metanol

205

1,326

65

0,54

5,1

Nước

190

1,333

100

0,89

10,2

Tên dung môi


• Ảnh hưởng của dung môi khác nhau


Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi thay đổi

• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi


Chế độ chạy: Đẳng dòng
Gradien

Tách một số các hợp chất hữu cơ


2.1.4. Chương trình trộn dung môi
* Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp
DUNG MÔI 1

DUNG MÔI 2

BỘ PHẬN
HÒA TRỘN

BƠM

VAN MẪU

DUNG MÔI 3

Ưu điểm: Chỉ dùng một bơm
Nhược điểm: Hệ thống 3 van lấy 3 dung môi phức tạp, chi phí ko
cao


* Chương trình dung môi ở áp suất cao

DUNG MÔI 1

BƠM 1

DUNG MÔI 2

BƠM 2

DUNG MÔI 3

BƠM 3

BỘ PHẬN

HÒA TRỘN

Ưu điểm: Độ đúng và độ lặp lại cao hơn
Nhược điểm: Tốn kém và cồng kềnh

VAN MẪU


2.2. Hệ thống bơm
* Nhiệm vụ: Để bơm pha động (dung môi rửa giả chất) qua cột tách
thực hiện quá trình sắc ký của các chất mẫu đã được nạp vào cột sắc
ký
* Yêu cầu hệ thống bơm
 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào 5000psi trở lên
 Bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5ml/phút
 Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi

BƠM ĐẨY MỘT PITTONG

BƠM ĐẦY NHANH

BƠM ĐẨY KÉO


• Ảnh hưởng của tốc độ dòng