Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ QUỐC VIỆT

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH
STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN

Ngành:
Mã số:

Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
9.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. ĐINH THỊ BÍCH LÂN
2. PGS.TS. BÙI TRẦN ANH ĐÀO

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên
Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Phản biện 2: TS. Trần Thị Lan Hương
Hội Thú y

Phản biện 3: PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ, ngày

tháng

năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp
Việt Nam

1


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt heo có thể gây nguy hiểm cho
con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn. Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên
cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) gây ra. Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các
loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu.
Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, người ta
đã xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh. Trong đó, S. suis type
2 thường gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999).
Vi khuẩn gây hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm khuẩn

huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc...
Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời thì người bệnh có thể tử
vong. Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng
nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992).
Các phương pháp chẩn đoán bệnh do liên cầu khuẩn lợn gây ra thường
dùng là phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi
trường chuyên dụng, phương pháp PCR. Trong những năm gần đây, trên thế
giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa trên phương pháp sắc kí miễn
dịch có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, không cần phòng thí nghiệm, không cần
thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp
thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người bệnh. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có
tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn
type 2 ở người và động vật.
Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 mang
tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn. KIT chẩn đoán nhanh sẽ
đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như kiểm soát tình trạng mang
mầm bệnh ở gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng
cao hiệu quả chăn nuôi.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis
type 2 ở lợn.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis
type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017.
Địa điểm nghiên cứu:
+ Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế;
+ Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;
1

+ Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công
nghệ Sinh học, Đại học Huế.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S. suis type
2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế. Mẫu vi khuẩn S. suis type 2 phân
lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử. KIT chẩn đoán S. suis
type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương tự
với KIT chẩn đoán S. suis type 2 do Ju et al. (2010) đã công bố.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu
về bệnh do vi khuẩn S. suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện nghiên cứu
chuyên ngành thú y.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S. suis type 2 trên lợn
khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh
giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type
2 gây ra ở người và động vật. Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S. suis type 2
có độ nhạy và độ mẫn cảm cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sản trên
thực địa, từ đoán cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra
chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type
2 từ lợn và các sản phẩm của lợn.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên
thế giới
2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới
S. suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi lợn
như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al., 1985;

Touil et al., 1988; Yu et al., 2006).
Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus được
phân lập. Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số type
nhất định, từ 1 – 8.
Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình
nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi
khuẩn S. suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004), phương pháp chẩn đoán
bệnh liên cầu lợn type 2 (Yang et al., 2007; Tan et al., 2008a; Lomthaisong et
al., 2010; Mandanici et al., 2010). Nghiên cứu các protein kháng nguyên bề mặt
nhằm tạo vắc xin (Li et al., 2006; Li et al., 2011).
2


2.1.1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), Nguyễn Như Thanh và cs. (2001), vi
khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà. Cả lợn rừng,
ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn. Hiện có 2 type
liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn
dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau. Cả 2 type này đều
cư trú ở amidal. Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn
Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
S. suis type 2 có thể tồn tại kéo dài hơn 1 năm tại amiđan của lợn mang
mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng penicilline. Ngo Thi Hoa et al. (2011)
cho biết rằng, ở miền nam Việt Nam, lợn giết mổ mang vi khuẩn S. suis lên đến
41%, trong đó 8% là S. suis type 2.
2.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN LIÊN CẦU LỢN
2.2.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn S. suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có khi đến 1 μm,
chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau, có
thể từ hai vi khuẩn tạo thành song cầu khuẩn cho đến chuỗi có 6 - 10 vi khuẩn

hay dài hơn. Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông
thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt màu Gram (+) (Mahon et al., 2000;
Tan et al., 2008a).

Hình 2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis

Nguồn: Hughes et al. (2009)

2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
Vi khuẩn S. suis có khả năng lên men các loại đường glucoza, lactoza,
saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men các loại đường: sorbit,
dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin. Tính chất không lên men đường
innulin là đặc tính để phân biệt tính chất độc của chủng gây bệnh (Smith et al.,
1999).
S. suis có thể tăng trưởng ở kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng không thể tăng
trưởng ở 6,5% dung dịch NaCl. S. suis không chứa men catalaza và oxidaza vì
vậy phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-). Vi khuẩn không di
động. Vi khuẩn có kháng nguyên giáp mô và sinh ra hai loại men streptokinaza
(diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn
Minh, 2003).
3


2.2.3. Sức đề kháng
Những nghiên cứu của các tác giả khẳng định rằng nhóm vi khuẩn không
hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác
định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường
nuôi cấy có chứa huyết thanh(Enright et al., 1987).
Vi khuẩn dễ bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như cồng, phenol,
iod, formol, tím genetian (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999).

Vi khuẩn S. suis rất mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh: penicillin,
oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987).
2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên
• Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định tính
độc lực của vi khuẩn S. suis và nó nằm ở thành vi khuẩn;
• Kháng nguyên giáp mô;
• Kháng nguyên bám dính.
Theo Jacques et al. (1990) Vi khuẩn S. suis là một trong số ít các loại vi
khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì
kháng nguyên bám dính của vi khuẩn S. suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường
kính khoảng 2 nm và dài lên đến 250 nm.
2.2.5. Khả năng gây bệnh
2.2.5.1. Nguồn bệnh
Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở lợn
nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như
viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi. Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn
là ở đường hô hấp trên đặc biệt là ở mũi, đường tiêu hoá và sinh dục.
Vi khuẩn S. suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô
hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi (Almeida et al., 2006).
2.2.5.2. Đường lây truyền
Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do lợn khoẻ hít thở không khí có mầm
bệnh, do tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khoẻ, do lợn ăn phải thức ăn và nước uống
có mầm bệnh. Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua các vết thương, các vết trầy
xước để gây bệnh. Điều cần đặc biệt quan tâm là bệnh liên cầu khuẩn có thể lây
truyền từ lợn ốm sang người và ngược lại. Vi khuẩn xâm nhập cơ thể người nếu
có sự tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm bệnh chưa nấu chín kỹ. Vi khuẩn liên cầu
lợn đi vào người qua các vết thương hở trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng. Hiện
nay chưa có bằng chứng nào về việc bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ
người sang người (Tan et al., 2008a).
2.3. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DO VI KHUẨN S.

SUIS GÂY RA
2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn
Lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các
màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị
4


sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não
tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ,
viêm phế quản, viêm phổi, sốt cao.
2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người
Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy hiểm
đến tính mạng bệnh nhân. S. suis không chỉ là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu,
viêm màng não, viêm khớp ở lợn mà còn gây viêm nội tâm mạc ở người, một số
trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa
phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì. Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến
3 ngày. Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể là thể tối cấp: nhiễm trùng
huyết, sốt cao, nhanh chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da); và
thể viêm màng não: sốt cao, đau đầu, nôn (Arends and Zanen, 1988).
2.4. CHẨN ĐOÁN
Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm Gram, phát hiện cầu khuẩn Gram
dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi. Sau khi chẩn đoán xác định vi khuẩn, có
thể cần tiến hành thử nghiệm PCR (TCVN 8400-2:2010), ELISA.
2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR đã được Silva et al. (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2 đặc
hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn
Streptococcus suistype 2 trong mẫu bệnh phẩm.
2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA
Hiện nay, trên thị trường thế giới đã có một số công ty cung KIT ELISA
chẩn đoán bệnh S. suis type 2 như Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; Công ty

antibodies-online.
2.5. ĐIỀU TRỊ
2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh
Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại kết quả tốt.
Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, chỉ có hiệu quả tốt khi con
vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng. Nếu điều trị muộn thì hiệu quả
sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả (Phạm Sĩ Lăng và cs., 2002; Hoàng Văn
Năm, 2009).
2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh
Ngoài việc dùng kháng sinh và các hóa dược để điều trị bệnh do
Streptococcus suis gây ra, thì việc dùng huyết thanh đặc hiệu để điều trị đã được
các nhà khoa học trên thế giới đề cập đến từ lâu và nhiều nước đã dùng huyết
thanh đặc hiệu điều trị bệnh do S. suis gây ra có hiệu quả tốt (Khương Bích
Ngọc, 1996).
2.6. GIỚI THIỆU VỀ HẠT NANO VÀNG VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng
Khi vàng khối thông thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano
mét,chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng.
5


2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch
2.6.2.1. Giới thiệu
Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa trên
nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này
được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức
hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng
kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện. Đây là công
nghệ được mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển

vào năm 1956 bởi Singer and Plotz (1956).
2.6.2.2. Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh
Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu
(sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút (adsorbent pad).
Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2 đường song song là
đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C) (hình 2.2)

Hình 2.2. Cấu trúc que thử nhanh
Nguồn: O’Farrell (2008)

2.6.2.3. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả
Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu
(sample pad). Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua
tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3), có 2
trường hợp xảy ra:
a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên thì sẽ xuất hiện màu ở vạch T
và vạch C.
b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên thì chỉ xuất hiện màu ở
vạch C.

Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh
Nguồn: Lee et al. (2013)

6


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, có khối lượng 30-32g/con
được nuôi trong chuồng nhựa có lớp trấu đã hấp khử trùng, nhiệt độ phòng nuôi

duy trì ở 25oC. Chuột được cho uống nước vô trùng và ăn thức ăn tổng hợp
AniFood (Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế).
Các chất bổ trợ khác nhau dùng trong sản xuất vắc xin: Freund's adjuvant
(Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2
(Seppic, Pháp).
Các hóa chất và vật dụng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh: Gold colloid 40nm
(DCN, Mỹ), Đệm mẫu và đệm hút (whatman, Anh), sợi thủy tinh (whatman,
Anh), màng nitrocellulose (whatman, Anh)
Vật liệu, dụng cụ, máy móc phòng thí nghiệm: Tăm bông vô trùng lấy mẫu,
ống falcon 15 ml, máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D), máy PCR (PTC100) của MJ. Research Inc (Mỹ), máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), tủ
ấm CO2, tủ cấy vô trùng, Máy ELISA tự động BIO-RAD Coda Automated EIA,
Bộ tinh sạch kháng thể IgG Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad, Mỹ) máy phun
Biodot XYZ3060D0003, máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000.
Môi trường, hóa chất thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion (BHI, Eiken
chemical), thạch máu, môi trường bile esculin agar, môi trường Todd Hewitt
Broth (THB), thuốc thử Kovac (Biomerieux, Pháp), môi trường Kligler iron
agar (KIA – Biomerieux, Pháp), dung dịch 3% H2O2, môi trường kiểm tra tính
di động của vi khuẩn (Pepton: 10g, cao thịt: 3g, NaCl: 5g, agar: 4g, genlatin:
80g, nước cất: 1000ml).
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2
+ Xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ;
+ Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2;
+ Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2.
3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2
+ Xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên;
+ Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho
chuột nhắt trắng thí nghiệm;
+ Xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng

thí nghiệm;
+ Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2.
3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2
+ Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với
hạt nano vàng;
+ Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp
để phản ứng với dung dịch gold colloid;
+ Chế tạo kháng thể cộng hợp.
7


3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh
Streptococcus suis type 2
+ Xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng NC;
+ Xác định độ nhạy của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2;
+ Xác định độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2
3.3.1.1. Phương pháp xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở
lợn giết mổ
Mẫu dịch mũi lợn tại các lò mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu và Xuân Phú) được
thu thập bằng cách lấy tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi và cho mẫu vào 5
ml môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 16 giờ rồi tiến hành
tách ADN.
a. Chuẩn bị dung dịch lysis mẫu
- Dung dịch 1: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM KCl, 2,5 mM MgCl2;
- Dung dịch 2: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 2,5 mM MgCl2, 1% Tween 20,
1% Triton X-100, 0,01% Nonidet P-10 (Marois et al., 2004).
b. Tiến hành tách ADN
Ly tâm ống nuôi 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn, sau đó giết vi khuẩn

bằng cách cho ống fancol 15 chứa dịch vi khuẩn vào 100oC ủ trong 10 phút. Mẫu
được hút cho vào ống eppendorf để tiến hành tách ADN.
c. Trình tự primers
Primer CPS2F:
5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’;
Primer CPS2R:
5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’.
Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài
khoảng 498 bp (Silva et al., 2006).
d. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho PCR
ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng
nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt
mồi là 58oC.
3.3.1.2. Phương pháp phân lập, và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi
khuẩn S. suis type 2
a. Phương pháp phân lập vi khuẩn S. suis type 2
Dịch nuôi của mẫu được xác định dương tính với S. suis type 2 bằng
phương pháp PCR được cấy ria trên môi trường thạch máu cừu 5%, nuôi 16 giờ
trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC. Sau khi nuôi, chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc tròn
lồi, khô, màu xám, nhỏ đặc trưng của Streptococcus spp để kiểm tra bằng phản
ứng catalase và thử nghiệm bile esculin và các phản ứng sinh hóa khác. Bảo
quản mẫu vi khuẩn để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
b. Phương pháp PCR xác định đặc tính sinh học phân tử
+ Trình tự primers 6PGD
Primers 6PGD được thiết kế dựa vào trình tự ADN trên ngân hàng gene
(gb/CP000407) (Tan et al., 2008b).
8


Primer 6PGD F: 5- GCG GAT CCA TGA CTA AAG CAA ATT TTG-3;

Primer 6PGD R: 5- CCG TCG ACC TAT TTT GAT TCG CTA TAC-3.
+ Phản ứng PCR với Gotaq Green Mastermix Kit (promega, Mỹ)
Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài
khoảng 1428 bp. ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho
phản ứng nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt
độ bắt mồi là 55oC.
c. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, một số lượng lớn các phân tử ADN của
vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch có thể được dùng để
giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp
nhận cao hơn. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng KITWizard®SV Gel and
PCR CleanUp System của hãng Promega (Mỹ) (xem Phụ lục 1).
d. Phương pháp tạo dòng và phân tích trình tự gene
+. Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System
theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning), có enzyme T4 ADN ligase làm
enzyme nối. Phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR được thực hiện ở
16ºC trong 16 giờ.
+. Biến nạp vào tế bào
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.
+. Tách ADN plasmid tái tổ hợp
Sử dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Invitrogene
(Mỹ) (PureLink® Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) được sử dụng hiện nay
(xem Phụ lục 2).
+. Kiểm tra ADN tái tổ hợp
Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi M13 và cặp mồi 6PGD được sử
dụng để kiểm tra sự có mặt của ADN ngoại lai trong plasmid.
+ Phương pháp kiểm phân tích trình tự của gene 6PGD
Trình tự nucleotide của gene 6PGD được gửi phân tích ở Công ty 1st
BASE, Malaysia thông qua Công ty TNHH phát triển Công nghệ ứng dụng Việt

Nam VNDAT bằng phương pháp dideoxy terminator trên máy 3031 Analysis. Kết
quả giải trình tự gene được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ
tương đồng với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI.
3.3.1.3. Phương pháp chế tạo kháng nguyên từ vi khuẩn S. suis type 2
Chủng vi khuẩn S. suis 2 thuần được nuôi trong môi trường Todd Hewitt
Broth trong 7 giờ, sau đó được thu và tái huyền phù với nước cất vô trùng; cấy
lên đĩa thạch máu để đếm khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong
1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày (Ju et al., 2010). Vi khuẩn đã bất hoạt
được thu và rửa 3 lần với PBS để loại bỏ formaldehyde.
9


3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2
3.3.2.1. Thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên S. suis 2 bất
hoạt
Để kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên S. suis 2, thí nghiệm
được thực hiện trên 2 nhóm chuột chuột, mỗi lô 5 con;
Nhóm được tiêm kháng nguyên: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp vi khuẩn
(1x108CFU) và montanide ISA 50V2 (200µl);
Nhóm đối chứng: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp PBS và montanide ISA 50V2;
Chuột được tiêm 2 lần cách nhau 14 ngày, và tiến hành lấy máu kiểm tra
vào ngày thứ 19 tính từ mũi tiêm lần 1.
3.3.2.2. Thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch
Xác định lượng kháng nguyên thích hợp gây tối miễn dịch được thực hiện
trên 3 nhóm chuột SA (4 con/nhóm) được tiêm phúc mạc 400 µl hỗn hợp kháng
nguyên với liều khác nhau (2x108 CFU/chuột, 1,5x108 CFU/chuột và 1x108
CFU/chuột)và chất bổ trợ montanide ISA 50V2 (200µl). Chuột được tiêm 3 lần,
cách nhau 14 ngày/lần.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp
để gây tối miễn dịch

Nội dung
Số chuột thí nghiệm (con)
Lượng kháng nguyên
(tế bào vi khuẩn/chuột)
Chất bổ trợ

Nhóm 1
4

Nhóm 2
4

Nhóm 3
4

2x108

1,5x108

1x108

Montanide
ISA 50V2

Montanide ISA
50V2

Montanide ISA
50V2

3.3.2.3. Thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch
Xác định chất bổ trợ thích hợp (Freund's, Montanide ISA 201 VG và
Montanide ISA 50V2) được thực hiện trên ba nhóm chuột SA (4 con/nhóm) với
liều kháng nguyên được xác định căn cứ vào kết quả của thí nghiệm xác định
lượng. Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần.
3.3.2.4. Phương pháp tách chiết và định lượng kháng thể kháng S. suis type 2
a. Phương pháp chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2
Kháng thể kháng S. suis type 2 được chế tạo bằng cách tiêm vào phúc mạc
chuột 15 con chuột SA 400 µl huyễn dịch gồm 200 µl kháng nguyên và 200 µl
chất bổ trợ. Lượng vi khuẩn bất hoạt và chất bổ trợ thích hợp được xác định
theo các thí nghiệm trên (mục 3.3.2.2 và mục 3.3.2.3). Nhóm đối chứng gồm 3
con chuột được tiêm tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp gồm 200 PBS và 200 chất bổ
trợ tương tự. Chuột được tiêm 3 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày.
b. Tách chiết kháng thể kháng S. suis type 2
Để tinh chế kháng thể IgG kháng S. suis type trong huyết thanh chuột,
nghiên cứu này sử dụng KIT Econo-Pac protein A (Biorad) (xem phụ lục 3).
c. Phương pháp định lượng kháng thể kháng S. suis type 2 sau tinh sạch
+ Phương pháp định lượng kháng thể BCA
Sau khi tách chiết, hàm lượng kháng thể được xác định bằng Pierce BCA
Protein Assay Kit của hãng Thermo.
10


+ Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể
Hiệu giá kháng thể kháng S. suis type 2 được xác định bằng phương pháp
ELISA gián tiếp. Mẫu kháng thể được pha loãng dẫn theo cấp số 2. Hiệu giá
kháng thể được xác định bằng độ pha độ pha loãng cao nhất của mẫu mà ở đó
vẫn xuất hiện phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể.
c. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể
Độ tinh sạch của kháng thể sau lọc được kiểm tra bằng điện di

polyacrylamide gel 15% có SDS ở 80 V. Sau đó, gel được nhuộm với dung dịch
Coomassie Blue R250. Phân tích kết quả điện di dựa theo sự xuất hiện và kích
thước của các băng protein được nhuộm so mới thang protein chuẩn (marker).
d. Phương pháp ELISA gián tiếp
Phủ đĩa với kháng nguyên vi khuẩn S. suis 2 bất hoạt đã được pha loãng
với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma) với nồng độ 2,5x107 vi
khuẩn/ml. Cơ chất được sử dụng là OPD. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở
bước sóng 492 nm theo đề nghị của nhà sản xuất cơ chất OPD.
Mẫu dương tính khi giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off). Giá trị giới hạn =
trung bình OD của nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng)
(Classen et al., 1987).
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống
Streptococcus suis type 2
3.3.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể
với hạt nano vàng
pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano
được xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25
µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ trong 30 phút,
sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát. pH thích hợp để
gắn là pH mà ở đó hỗn hợp dung dịch trên vẫn giữ được màu hồng tươi. Màu hồng
tươi được phát hiện ở bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000).
3.3.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích
hợp để phản ứng với dung dịch colloidal gold
Nồng độ kháng thể kháng S. suis 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng
trong dung dịch đươc xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với
25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600
µg/ml) lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10
phút và quan sát ống có nồng độ thấp nhất không bị đổi từ màu hồng sang màu
xanh (đo ở bước sóng 520 nm). Nồng độ protein của ống đó chính là nồng độ
protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid.

3.3.3.3. Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp
Kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng cách ủ kháng thể kháng S. suis 2,
với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) ở nhiệt độ phòng
trong 30 phút. Sau đó thêm 10% albumin huyết thanh bò (BSA) để cố định các
phân tử đã gắn kết. Ly tâm 12.000 vòng trong 30 phút ở 40C, bỏ dịch nổi. Phần
cặn được rửa bằng hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5%
sucrose. Sau khi ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp được pha loãng trong
100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001). Cuối cùng kháng thể
11


cộng hợp được cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô ở nhiệt độ
phòng qua đêm.
3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán
nhanh Streptococcus suis type 2
3.3.4.1. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên
màng nitrocellulose
Nồng độ kháng thể chuột kháng S. suis type 2 (kháng thể bắt) thích hợp
được xác định bằng cách phun lên màng nitrocellulose (NC) ở đường kiểm tra
với các nồng độ khác nhau (1,5; 1,75; 2,0 mg/ml), đồng thời phun Anti-Mouse
IgG antibody produced in goat (Sigma-Aldrich, 1 µg/cm) lên màng NC ở đường
đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003.
3.3.4.2. Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh

a. Thí nghiệm xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết quả dương tính với KIT
chẩn đoán nhanh
Tiến hành cho vào đệm mẫu của KIT 100 µl dung dịch chứa vi khuẩn S.
suis type 2 với lượng khác nhau. Lượng vi khuẩn tối thiểu KIT chẩn đoán có thể
phát hiện được xác định ở mức vi khuẩn tối thiểu mà KIT vẫn xuất hiện 2 băng
có thể quan sát được (Ju et al., 2010).

b. Thí nghiệm xác định phản ứng chéo của KIT chẩn đoán nhanh
Phản ứng chéo của KIT được xác định bằng cách cho vào đệm mẫu của
KIT chẩn đoán 100 µl dung dịch chứa 5x107 các loại vi khuẩn khác như E. coli
ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 (Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế) và một số chủng vi
khuẩn S. suis không phải là type 2 (Bùi Thị Hiền và cs., 2016). Quan sát sự xuất
hiện của các băng màu trên KIT trong 5-10 phút.
c. Thí nghiệm xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh
Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT được xác định bằng các so sánh với kết
quả của phương pháp PCR trong việc xác định mẫu dương tính và âm tính.
Bảng 3.2. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh

Kit phát hiện nhanh
Dương tính
Âm tính

PCR
Dương tính
a
b

Âm tính
c
d

Ghi chú:
a: Kết quả dương tính khi được xác định bằng KIT và PCR
b: Kết quả dương tính khi được xác định bằng PCR nhưng âm tính khi xác định bằng KIT
c: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR nhưng dương tính khi xác định bằng KIT
d: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR và bằng KIT

3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu
Số liệu thu thập được trong thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch của
kháng nguyên; thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp và chất bổ
trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột được tính toán bằng phần mềm
Excel 2003. Sai khác có ý nghĩa (với α=0,05) được xác định bằng T-test;
Độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT được xác định bằng phần mềm MedCalc
15.4 dựa theo kết quả chuẩn được xác định bằng phương pháp PCR.
12


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN STREPTOCOCCUS
SUIS TYPE 2
4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ
Với kết quả PCR, nhận thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân
lập tại lò mổ Bạch Yến là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú
là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên
Huế là 9,00.
4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis
type 2
4.1.2.1. Phân lập vi khuẩn S. suis type 2
Từ 9 mẫu dương tính với S. suis type 2, chọn 1 mẫu và tiến hành ria cấy để
phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu cừu. Chọn một khuẩn lạc đơn có
hình dạng đặc trưng của vi khuẩn liên cầu lợn. Chủng vi khuẩn phân lập này
được đặt tên là TTHSS2.
Kết quả nhuộm gram cho thấy vi khuẩn có hình hơi giống trực khuẩn, liên
kết với nhau tạo thành chuỗi, trong tiêu bản có thể thấy vi khuẩn có những độ
dài khác nhau bắt màu gram (+).

Làn 1: Marker 1kb (Bioline), làn 2 đến 10: các mẫu dương tính, làn 11: chứng âm

Hình 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2
Để chế tạo KIT chẩn đoán nhanh, việc phân lập và chọn được chủng vi
khuẩn thích hợp, có đủ đặc tính sinh hóa và đặc tính sinh học đặc trưng của vi
khuẩn S. suis type 2 rất quan trọng.
Kết quả thực hiện phản ứng sinh hóa vi khuẩn liên cầu lợn thu được như sau:
13


Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa vi khuẩn S. suis
TT
1
2
3
4
5
6
7

Chỉ tiêu
Gram
Bile esculin
Catalase
Lên men đường glucose
Lên men đường lactose
Indol
Di động

Kết quả

+
+
+
+
-

Sau khi xác định hình thái vi khuẩn và xác định một số chỉ tiêu sinh hóa,
khuẩn lạc Streptococus suis tách ADN để làm khuôn cho phương pháp PCR xác
định S. suis type 2 với cặp mồi đặc hiệu.
4.1.2.2. Xác định đặc tính sinh học phân tử của chủng vi khuẩn TTHSS2
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR của S. suis type 2 có kích thước
khoảng 1428 bp (hình 4.2), tương ứng với chiều dài lý thuyết đoạn ADN của
gen 6PGDvới cặp mồi 6PGD.F và 6PGD.R.

Làn 1: marker 1kb (biobasic), làn 2 và 3: mẫu

Hình 4.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD
4.1.2.3. Kết quả giải trình tự gene của vi khuẩn chủng TTHSS2
Phân tích trình tự nucleoctit của gene 6GPD thuộc chủng S. suis type 2
phân lập tại Thừa Thiên Huế nhận thấy có sự sai khác tại 14 vị trí nucleoctit so
với gene 6GPD của chủng S. suis type 2 do Tan et al. (2008b) phân lập được tại
Trung Quốc đã được công bố trên ngân hàng gene (bảng 4.2). Sự sai khác này
có thể là do đặc tính sinh học, thích nghi của từng chủng S. suis type 2 tại mỗi
quốc gia khác nhau.
Bảng 4.2. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 phân lập
được với gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 trên ngân hàng gene
Vị trí
486
574
632

1034
1039

Sai khác
A-—
C-T
T-—
C-G
A-G

Vị trí
1074
1093
1095
1112
1115

Sai khác
C-T
C-G
G-T
— -G
C-—

14

Vị trí
1119
1123
1132

1134

Sai khác
C–G
T–C
A-G
C-T


4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2
Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn TTHSS2 thuần được nuôi trong môi
trường THB trong vòng 7 giờ, tiến hànhly tâm thu cặnvi khuẩn. Cặn vi khuẩn
được tái huyền phù với nước cất vô trùng và cấy trãi lên đĩa thạch máu để đếm
số khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở
37oC trong 7 ngày.
Kết quả trên vi khuẩn TTHSS2 sau khi được xử lý bằng dung dịch
formaldehyde 1% không mọc được trên môi trường thạch máu. Như vậy, chúng
tôi đã chế tạo thành công kháng nguyên thô vi khuẩn chủng TTHSS2 để phục vụ
cho quá trình chế tạo kháng thể kháng vi khuẩn liên cầu lợn type 2.
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG
KHÁNG S. SUIS TYPE 2
4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên
Nghiên cứu cho thấy giá trị OD492 ở nhóm được tiêm kháng nguyên cao
hơn rất nhiều lần so với giá trị tới hạn (Cut off = 0,180) (bảng 4.3), trong khi các
mẫu huyết thanh của nhóm đối chứng có giá trị OD492 rất thấp.
Bảng 4.3. Hiệu giá kháng thể của chuột sau tiêm vắc xin
Nhóm được tiêm
kháng nguyên

Nhóm đối chứng

Chuột thí nghiệm
Giá trị OD
1
2,321
2
2,333
3
2,256
4
2,455
5
2,232
6
0,135
7
0,159
8
0,143
9
0,122
10
0,132
Giá trị Cut off : 0,180

Mean±SD
2,391±0,087

0,138 ± 0,014

Trong quá trình nghiên cứu, chuột ở nhóm thí nghiệm được theo dõi đều an
toàn, không có biểu hiện bất thường. Do vậy có thể khẳng định tính an toàn và
khả năng sinh đáp ứng miễn dịch cao của kháng nguyên S. suis type 2 trong
nghiên cứu này.
4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp
ứng miễn dịch ở chuột SA
Kết quả ở thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch và tính an toàn của
kháng nguyên TTHSS2 cho thấy chất lượng kháng nguyên tốt, không gây bệnh,
an toàn cho động thí nghiệm nên có thể sử dụng cho thí nghiệm chế tạo kháng
thể kháng TTHSS2.
Kết quả trình bày tại bảng 4.4 cho thấy thấy hàm lượng kháng kháng thể
của nhóm 1 và 2 cao hơn nhiều so với hàm lượng kháng thể ở nhóm 3. Giá trị
15


OD492 trung bình qua 49 ngày theo dõi ở nhóm được tiêm kháng nguyên với
hàm lượng 2x108 CFU/ chuột là 2,113; ở nhóm 2 là 2,111 và nhóm 3 là 1,890.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch
của chuột SA
Ngày lấy mẫu
Nhóm

0

7

21

28

CFU/chuột

35

42

49

Trung
bình

Giá trịOD492

1

2x108

0,190 1,570

2,628

2,518

2,621

2,629

2,633

2,113a

2

1,5x108

0,192 1,552

2,634

2,514

2,622

2,630

2,632

2,111a

3

1x108

0,187 1,435

2,314

2,139

2,321

2,357

2,375

1,890b

a, b: các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa (P<0.05)

Kháng thể xuất hiện ngay trong lần tiêm đầu tiên, sau đó tăng cao vào lần
tiêm thứ 2. Sau tiêm 28 ngày, hàm lượng kháng thể giảm so với tuần đầu sau
tiêm lần 2, do vậy chuột được gây miễn dịch lần 3 là rất phù hợp. Vào các ngày
thứ 35; 42 và 49, hàm lượng kháng thể tăng cao lại và duy trì ổn định. Hàm
lượng kháng thể của nhóm 1 và của nhóm 2 cao hơn của nhóm 3 (|t|>tα/2). Tuy
nhiên, không có sự sai khác giữa hàm lượng kháng thể của nhóm 1 và nhóm 2
(|t|chuột nhắt trắng là 1,5x108CFU/chuột.
4.2.3. Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả năng sinh miễn dịch
của chuột SA
Trong nghiên cứu này, với lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn
dịch cho chuột SA là 1,5x108 CFU/chuột; để xác định chất bổ trợ thích hợp cho
quá trính gây tối miễn dịch, 3 chất bổ trợ được sử dụng cho 3 nhóm thí nghiệm
là Freund (hoàn toàn và không hoàn toàn), Montanide ISA 201 VG và
Montanide ISA 50V2.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của
chuột SA
Ngày lấy mẫu
Nhóm
1
2

3

0

7

21

28

35

42

49

Trung

Chất bổ trợ

Giá trịOD492

bình

Freund's adjuvant

0,166 1,545 2,665 2,530 2,705 2,723 2,722

2,151a

0,162 1,522 2,596 2,502 2,619 2,647 2,657

2,101b

0,162 1,550 2,652 2,517 2,662 2,697 2,713

2,136c

Montanide ISA
201 VG
Montanide ISA
50V2

a, b, c: các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa (P<0.05)

16


Hàm lượng kháng thể trong 7 ngày đầu sau khi gây đáp ứng miễn dịch lần 1
của các nhóm chuột không có sự sai khác. Tuy nhiên, sau lần tiêm thứ 2, hàm lượng
kháng thể của chuột ở các nhóm bắt đầu thay đổi. Vào ngày thứ 21, hàm lượng
kháng thể ở nhóm 1 đạt cao nhất (2,665), tiếp theo là nhóm 3 sử dụng chất bổ trợ
Montanide ISA 50V2 (2,652) và thấp nhất ở nhóm 2 (2,596).
So sánh hàm lượng kháng thể sau 3 lần gây đáp ứng miễn dịchcho thấy có
sự sai khác có ý nghĩa ở cả 3 lô (|t|>tα/2), trong đó nhóm 1 sử dụng chất bổ trợ
Freund's cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất, giá trị OD492 trung bình của cả giai
đoạn thí nghiệm là 2,151 và thấp nhất là chất bổ trợ Montanide ISA 201 VG. Do
vậy, trong thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp cho quá trình đáp ứng miễn
dịch của chuột nhắt trắng, Freund's được lựa chọn làm chất bổ trợ thích hợp, làm
tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên S. suis 2 bất hoạt.

4.2.4. Tinh chế và định lượng kháng thể
4.2.4.1. Kết quả chế tạo kháng thể
Với mục đích sản xuất kháng thể kháng vi khuẩn S. suis type 2 phục vụ cho
quá trình chế tạo KIT chẩn đoán nhanh; căn cứ vào kết quả nghiên cứu lượng
kháng nguyên và chất bổ trợ thích hợp để gây đáp ứng miễn dịch cho chuột SA.
Tiến hành tiêm vào phúc mạc 15 con chuột SA được huyễn dịch gồm 200 µl
kháng nguyên chứa 1,5x107 CFU vi khuẩn S. suis type 2 bất hoạt và 200 µl chất
bổ trợ Freund.
Bảng 4.6. Kết quả chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2
Chuột thí
nghiệm

Nhóm
được tiêm
kháng
nguyên

Nhóm đối
chứng

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18

Giá trị OD492
Ngày 0
0,145
0,153
0,144
0,148
0,159
0,146
0,162
0,153
0,161
0,147
0,139
0,152
0,155
0,165
0,148
0,154
0,159
0,151

Mean±SD

0,152±0,007

0,155±0,004

17

Ngày 49
2,812
2,716
2,746
2,753
2,810
2,787
2,699
2,756
2,715
2,821
2,735
2,751
2,743
2,805
2,801
0,156
0,161
0,147

Mean±SD

2,763±0,040

0,155±0,007


Kết quả từ bảng 4.6 cho thấy hàm lượng kháng thể kháng S. suis type 2
trong huyết thanh chuột rất cao, giá trị OD492 dao động từ 2,699 đến 2,821. Giá
trị OD492 trung bình là 2,763. Giá trị OD492 vào ngày thứ 49 của quá trình tiêm
trong thí nghiệm này cao hơn so với giá trị OD492 vào ngày thứ 49 của thí
nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp (2,633) và thí nghiệm xác định
chất bổ trợ thích hợp cho đáp ứng miễn dịch ở chuột với kháng nguyên S. suis
type 2 (2,722).
4.2.4.2. Kết quả tinh sạch kháng thể
Kết quả điện di được (hình 4.3) cho thấy nồng độ protein trong huyết thanh
khá cao. Mẫu 1 nồng độ IgG nhiều hơn so với các mẫu khác. Xuất hiện 2 băng
chính tương ứng với chuỗi nặng (~50 kDa) và chuỗi nhẹ (~25 kDa). Ở mẫu
huyết thanh thô, albumin có hàm lượng rất lớn, nhưng sau khi tinh chế thì thành
phần này hầu như không có. Như vậy, huyết thanh tinh chế có độ sạch cao đặc
biệt là thành phần albumin được loại bỏ gần như hoàn toàn.

Làn 1: Marker protein (Biobasic 10-200 kDa), làn 2: albumin, làn 3, 4
và 5: các mẫu kháng thể tinh sạch

Hình 4.3. Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng
thể đã tinh sạch
4.2.4.3. Định lượng kháng thể
Dựa trên phương trình hồi quy y = 831,46x - 161,62, với y là nồng độ
protein thu được, x là giá trị OD562 được xây dựng từ số liệu OD của các mẫu
chuẩn, suy ra được nồng độ kháng thể trong mẫu.
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT, cứ mỗi 3 ml huyết thanh sẽ thu

được 6 lô kháng thể tinh khiết, mỗi lô gồm 8 ml kháng thể có nồng độ khác nhau
gồm 4 ml có nồng độ cao (C>1000 mg/ml) và 4 ml nồng độ thấp (C<400
mg/ml). Hàm lượng kháng thể thu được cao nhất là 2000 mg/ml và thấp nhất là
100 mg/ml. Những ống chứa kháng thể cao sẽ được sử dụng vào cho việc sử
dụng làm KIT chẩn đoán bệnh.
18


A1-A9: dung dịch BSA chuẩn với nồng độ giảm dần từ 2000 µg/ml đến 0 µg/ml. B1-B8, C1-C8, D1- D8, E1E8, F1-F8, G1-G8: kháng thể qua cột lọc ở các lần khác nhau

Hình 4.4. Kết quả xác định nồng độ protein kháng thể bằng Pierce BCA
Protein Assay Kit
4.2.5. Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế
Để đánh giá độ đồng đều của hiệu giá kháng thể kháng TTHSS2, trong
nghiên cứu này, 8 ống chứa kháng thể với các nồng độ khác nhau được pha về
nồng độ 1000 µg/ml với dung dịch 1X PBS vô trùng, sau đó tiến phản ứng
ELISA gián tiếp với độ pha loãng ban đầu của kháng thể là 10 lần để xác định
hiệu giá kháng thể.

Hàng ngang từ 1-12: kháng thể được pha loãng theo cơ số 2. Hàng dọc: A –H: các mẫu kháng thể sau lọc

Hình 4.5. Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch
Kết quả ELISA cho thấy (hình 4.5), hiệu giá các mẫu kháng thể kháng vi
khuẩn S. suis type 2 (nồng độ 1000 µg/ml, pha loãng ban đầu 10 lần) tương đối
đồng đều, dao động từ 7log2 đến 8log2. Kết quả này tương đối cao, thích hợp
cho việc chế tạo kháng thể cộng hợp.
19


4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CONJUGATE – KHÁNG THỂ

KHÁNG S. SUIS TYPE 2
4.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể
với hạt vàng nano
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở pH 6.5 và 7.0, dung dịch kháng thể cộng
hợp có màu tím nhạt, kiểm tra ở bước sóng A520 thì thấy giá trị <0. Ở pH 7.5,
8.0 và 8.5, dung dịch kháng thể cộng hợp trong ống eppendoft có màu hồng
tươi, kiểm tra ở bước sóng A520 thì chỉ có ở pH 8.0 cho giá trị >0 (hình 4.6). Do
vậy, dung dịch gold colloid ở pH 8.0 được xác định là pH thích hợp nhất để gắn
kháng thể vào hạt nano vàng.
0.6
8
0.4

A520

0.2
0
8.5

-0.2
7.5
-0.4
6.5

7

-0.6
pH dung dịch

Hình 4.6. Kết quả xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp

4.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng S. suis type 2 tối ưu để gắn với hạt
vàng nano
Quan sát màu ở các ống thí nghiệm, nhận thấy ở nồng độ kháng thể là 100
và 200 µg/ml, dung dịch trong ống có màu tím hồng, đo ở bước sóng A520 nm
có giá trị <0 (hình 4.7). Vậy với thí nghiệm này, nồng độ tối thiểu thích hợp để
gắn kháng thể S. suis type 2 với hạt nano vàng trong dung dịch gold colloid
được xác định là 300 µg/ml.
0.6
300

400

500

600

0.4

A520

0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6

100

200

-0.8

Hình 4.7. Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn với dung
dịch gold colloid
20


Theo đề nghị của Ju et al. (2010), lượng kháng thể được sử dụng để gắn
với gold colloid nên chọn ở tỷ lệ 120% lượng kháng thể xác định được. Do vậy
trong các thí nghiệm tiếp theo, lượng kháng thể S. suis type 2 được sử dụng để
thực hiện phản ứng gắn là 360 µg/ml.
4.3.3. Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp
Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp theo các điều kiện về pH của dung
dịch gold colloid là 8.0 và nồng độ kháng thể thích hợp cho sự gắn kết là 360
µg/ml cho thấy, dung dịch kháng thể cộng hợp có màu tím đỏ, khi đo ở bước
sóng 520 nm cho giá trị >0,5. Kết quả này phù hợp hoàn toàn với kết quả đã
công bố trong 2 thí nghiệm trên (thí nghiệm xác định pH của dung dịch gold
colloid và nồng độ kháng thể thích hợp cho việc chế tạo kháng thể công hợp).

Hình 4.8. Kết quả sản xuất kháng thể cộng hợp

Hình 4.9. Đệm conjugate kháng thể (conjugate pad)
Kháng thể cộng hợp được cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô
ở nhiệt độ phòng qua đêm. Quan sát đệm conjugate kháng thể, nhận thấy đệm
gần như đồng nhất có màu tím đỏ, đệm conjugate Có chất lượng tốt, phù hợp
cho quá trình chế tạo KIT chẩn đoán.
4.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT CHẨN
ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2
4.4.1. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp
Để kiểm tra nồng độ kháng thể thích hợp bắt vi khuẩn,100 µl dung dịch

chứa 5x107 vi khuẩn S. suis type 2 được đưa vào đệm mẫu của các que thử được
phủ kháng thể kháng S. suis type 2 với các nồng độ khác nhau.
21


1: Nồng độ 2000 µg/ml; 2: nồng độ 1750 µg/ml; 3: nồng độ 1500 µg/ml; 4: blank; T1: đường đối chứng; T2:
đường kiểm tra

Hình 4.10. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp
Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp cho việc sản xuất KIT chẩn
đoán cho thấy (hình 4.10). Sau thời gian từ 5-10 phút, ở nồng độ 1500µg/ml,
đường kiểm tra được quan sát thấy xuất hiện rất mờ, trong khi ở nồng độ 1750
µg/ml, có thể quan sát được 2 đường rõ ràng, tuy nhiên đường kiểm tra xuất hiện
không rõ như ở nồng độ kháng thể bắt 2000 µg/ml. Do vậy, nồng độ thích hợp nhất
để bắt vi khuẩn S. suis type 2 đã được xác định là 2000 µg/ml.
4.4.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT
4.4.2.1. Kết quả xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết quả dương tính với
KIT chẩn đoán nhanh
Trong nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh (ICT), chỉ tiêu lượng
kháng nguyên, kháng thể tối thiểu mà KIT có thể phát hiện được luôn được các
nhà nghiên cứu quan tâm.

1: S. suis 2 5x108CFU/ml, 2: S. suis 2 5x107CFU/ml, 3: S. suis 2 5x106CFU/ml, 4: S. suis 2 5x105CFU/ml; T1:
đường đối chứng; T2: đường kiểm tra

Hình 4.11. Kết quả xác định độ nhạy của Kit
22


Kết quả cho thấy (hình 4.11) ở KIT số 1 và số 2 xuất hiện 2 đường rõ rệt,

trong khi ở KIT số 3, đường kiểm tra xuất hiện một mờ nhưng có thể quan sát
được. Ở KIT số 4, chỉ thấy xuất hiện màu ở đường đối chứng. Kết quả này xác
định nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu KIT có thể phát hiện là 5x 106
CFU/ml (5x 105 CFU trong 100 µl mẫu).

1: S. suis type 2; 2: E. coli ATCC 25922; 3: P. aeruginosa ATCC 27853; 4: S. aureus ATCC 25923; 5, 6, 7. S.
suis (không phải type 2); T1: đường đối chứng; T2: đường kiểm tra

Hình 4.12. Kết quả xác định độ đặc hiệu của Kit
Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa
ATCC 2783, S. aureus ATCC 25923 và các chủng S. suis không phải type 2
được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của KIT chẩn đoán. Vi khuẩn S. suis
type 2 và các chủng vi khuẩn thí nghiệm khác được nuôi trong môi trường THB
ở 37oC được thu thập để kiểm tra độ đặc hiệu của KIT.
Kết quả (hình 4.12) cho thấy, chỉ có vi khuẩn S. suis 2 cho kết quả dương
tính với KIT chẩn đoán, còn với các loại vi khuẩn khác đều cho kết quả âm tính.
4.4.2.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh
Trong 30 mẫu dương tính được phát hiện bằng phương pháp PCR, Kit phát
hiện nhanh vi khuẩn S. suis 2 chỉ phát hiện được 28 mẫu dương tính. Còn trong 30
mẫu âm tính với PCR, Kit phát hiện nhanh cũng cho kết quả là 30 mẫu âm tính.
Như vậy độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT lần lượt là 93,33% và 100% so với
phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 (Silva et al., 2006).
Bảng 4.7. Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT
Kit phát hiện nhanh

PCR
Dương tính

Âm tính

Dương tính

28

0

Âm tính

2

30

23