Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ tới khả năng tạo màng Biocellulose, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

KIỀU THỊ MAI

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG
CỦA NGUỒN CACBON, NITƠ VÀ NHIỆT ĐỘ
TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE,
ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
======

KIỀU THỊ MAI

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG
CỦA NGUỒN CACBON, NITƠ VÀ NHIỆT ĐỘ
TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE,
ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2019


LỜI CẢM ƠN

Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất, chân thành nhất bằng tất
cả tấm lòng của mình đến PGS TS inh Thị Kim Nhung trong suốt thời
gian vừa qua đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thiện khóa luận này
Em xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô
trong tổ vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, trƣờng ại học Sƣ phạm
Hà Nội 2 đã hƣớng dẫn và khuyến khích em trong suốt khoảng thời gian
học tập vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn và cảm ơn đến Ban giám hiệu của
trƣờng ại học Sự phạm Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN
đã giúp đỡ và tạo điều kiện để cho em có thể hoàn thành tốt nhất đề tài
nghiên cứu của mình
Lời cảm ơn cuối cùng em xin đƣợc gửi tới gia đình, bạn bè và
ngƣời thân đã luôn quan tâm giúp đỡ em trong khoảng thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
N

n

t

n 05 n m 2019

Sinh viên

Kiều Thị Mai


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan toàn bộ những nội dung trong khóa luận này là
cả quá trình tìm hiểu lâu dài và toàn bộ đều là sự thật ây cũng là thành
quả nghiên cứu nỗ lực của riêng bản thân em trong thời gian qua. Tất cả
các số liệu trong khóa luận đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm đã qua xử
lý thống kê, không có số liệu nào là sao chép hay bịa đặt và không trùng
với kết quả đã đƣợc công bố.
Nếu có sai sót em xin hoàn toàn nhận trách nhiệm.

N

n

t

n 05 n m 2019

Sinh viên

Kiều Thị Mai


MỤC LỤC
MỞ ẦU1
1 Lý do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..................................................................... 2
5

óng góp của đề tài..................................................................................... 3

Chƣơng 1 ......................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
1.1. Nhu cầu dinh dƣỡng và nhiệt độ của vi sinh vật có khả năng lên men
tạo màng Biocellulose ............................................................................. 4
1.1.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.............................................................. 4
1.1.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ.................................................................... 5
1.1.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................ 5
1.2. Cấu trúc và tính chất của màng Biocellulose .......................................... 5
1.2.1.Cấu trúc của màng Biocellulose ............................................................. 5
1.2.2. Một số tính chất của màng Biocellulose ............................................... 6
1 2 3 Qúa trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter ........ 6
1.2.4. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter .................. 8
1 2 5 Túi bảo quản thực phẩm........................................................................ 9
1.3. Lịch sử nghiên cứu vấn đề ....................................................................... 9
1 3 1 Trên thế giới .......................................................................................... 9
1.3.2. Ở Việt Nam ......................................................................................... 10
Chƣơng 2. ỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ...................................................................................................... 12
2.1. ối tƣợng nghiên cứu và hóa chất ......................................................... 12


211

ối tƣợng nghiên cứu.......................................................................... 12

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................. 12
2.1.3. Hóa chất............................................................................................... 12
2 1 4 Các loại môi trƣờng............................................................................. 13
2 1 4 1 Môi trƣờng giữ giống (MT1) ........................................................... 13
2 1 4 2 Môi trƣờng nhân giống (MT2) ......................................................... 13
2 1 4 3 Môi trƣờng lên men (MT3) .............................................................. 13
2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian............................................ 14
2 3 Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................ 14
2 3 1 Phƣơng pháp vi sinh ............................................................................ 14
2 3 1 1 Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phƣơng
pháp truyền thống (Phƣơng pháp Vinogradski và Beijerinck) ............. 14
2 3 1 2 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép ................................................................. 15
2 3 1 3 Phƣơng pháp bảo quản chủng giống trên môi trƣờng thạch
nghiêng .................................................................................................. 15
2 3 2 Phƣơng pháp hóa sinh ......................................................................... 16
2 3 2 1 Phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính catalase ......................................... 16
2 3 2 2 Xác định khả năng oxy hóa acid acetic ............................................ 16
2 3 2 3 Xác định khả năng tổng hợp cellulose ............................................. 17
2 3 3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon, nitơ và
nhiệt độ đến khả năng tạo màng Biocellulose....................................... 17
2 3 3 1 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon ................. 17
2 3 3 2 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ ..................... 17
2 3 3 3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................... 18
2 3 4 Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng tƣơi của màng Biocellulose ........ 18


2 3 5 Phƣơng pháp sấy khô và đóng thành bao bì đựng thực phẩm ............ 18
2 3 6 Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả .............................................. 18

Chƣơng 3 . KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 20
3 1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo
màng Biocellulose ................................................................................. 20
3 1 1 Phân lập Gluconacetobacter có khả năng sinh màng Biocellulose .... 20
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
dai, mỏng ............................................................................................... 21
3 1 3 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của các chủng G.xylinus T1. ........ 24
3.2. Ảnh hƣởng của cacbon tới khả năng tạo màng Biocellulose của
chủng G.xylinus T1 ............................................................................... 25
3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ tới khả năng lên men tạo màng
Biocellulose của chủng G.xylinus T1 .................................................... 30
3.3.1. Ảnh hƣởng của nitơ hữu cơ................................................................. 30
3.3.2. Ảnh huởng của nitơ vô cơ ................................................................... 32
3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose
của chủng G.xylinus T1 ......................................................................... 34
3 5 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose và ứng dụng trong bảo
quản thực phẩm ..................................................................................... 36
3.5.1. Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose......................................... 36
3.5.2. Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.................................................. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 43
PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn
Gluconacetobacter .................................................................. 7
Hình 2 2 Con đƣờng chuyển hoác cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter .................................................................. 8

Hình 3 1 Khuẩn lạc vi khuẩn mẫu phân lập ........................................... 20
Hình 3 2 Vòng phân giải CaCO3 ............................................................ 21
Hình 3 3 Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter .... 23
Hình 3 4 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng
cacbon ................................................................................ 28
Hình 3 5 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lƣợng glucose là 10g/l 29
Hình 3 6 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lƣợng pepton là 5g/l .... 31
Hình 3 7 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lƣợng
(NH4)2SO4 ............................................................................. 32
Hình 3 8 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lƣợng (NH4)2SO4) là 3g/l
............................................................................................... 33
Hình 3 9 Màng nuôi cấy ở nhiệt độ 30C .............................................. 35
Hình 3 10 Màng Biocellulose sau 5 ngày lên men................................. 37
Hình 3 11 Cà chua đƣợc bọc bằng màng Biocellulose ......................... 39
Hình 3 12 Cà chua bị hỏng sau 7 ngày ............................................... 39
Hình 3 13 Cà chua bọc túi nilông bị hỏng sau 12 ngày ......................... 39
Hình 3 14 Cà chua bọc màng Biocellulose hỏng sau 23 ngày ............... 39
Hình 3 15 Bảo quản dƣa chuột.............................................................. 39
Hình 3 16 Dƣa chuột bị hỏng sau 5 ngày .............................................. 39


Hình 3 17 Mận đƣợc bảo quản thƣờng, túi nilông và băng màng
Biocellulose ........................................................................... 40
Hình 3 18 Mận đƣợc bảo quản sau 10 ngày........................................... 40
Hình 3 19 Thịt đƣợc bảo quản thƣờng, túi nilông và băng màng
Biocellulose ........................................................................... 40
Hình 3 20 Thịt bọc nilon hỏng sau 2 ngày ............................................. 40
Hình 3 21 Thịt đƣợc bọc trong màng Biocellulose hỏng sau 7 ngày .... 40

DANH MỤC VIẾT TẮT

1. ATP

Adenozin triphotphat

2. FAD

Flavin adenine dinucleotide

3. G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

4. MT

Môi trƣờng

5. NADP

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

6. STT

Số thứ tự


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng Biocellulose ...................................... 23

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến độ dày màng Biocellulose
của chủng G. xylinus T1.................................................................. 26
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khối lƣợng tƣơi của màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T1............................................. 26
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khối lƣợng khô của màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T1............................................. 27
Bảng 3 5 So sánh bảo quản một số loại thực phẩm bằng màng
Biocellulose, túi nilông và không bảo quản ................................ 46
Bảng 3.6. Số lƣợng tế bào tại các thời điểm của chủng vi khuẩn
G. xylinus T1 (×

tế bào/ml) ................................................... 46

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T1 ......................................... 46
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Pepton đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T1......................................... 45
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T1......................................... 47
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành màng
Biocellulose ................................................................................. 47


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Biểu đồ quá trình sinh trƣởng của chủng G. xylinus T1......... 24
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến
khả năng tạo màng Biocellulose ............................................ 28
Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của hàm lƣợng pepton đến khả
năng tạo màng Biocellulose .................................................... 31

Biểu đồ 3.4. Biểu diễn ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ ((NH4)2SO4) tới
khả năng hình thành màng Biocellulose của chủng
G.xylinus T1 ............................................................................ 33
Biểu đồ 3.5. Mối tƣơng quan giữ nhiệt độ với sự hình thành màng
Biocellulose ............................................................................... 35


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Khoa học công nghệ ngày một phát triển, con ngƣời luôn luôn
muốn khám phá và tìm ra các nguồn nguyên liệu mới với mong muốn
đáp ứng nhu cầu thiết yếu của mình Trong quá trình nghiên cứu để tìm
ra nguồn nguyên liệu mới các nhà khoa học đã phát hiện ra rất nhiều
nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng trong thực tiễn cuộc sống
hàng ngày Một trong những nguồn nguyên liệu đang đƣợc thu hút sự
chú ý hiện nay đó là cellulose vi khuẩn có khả năng hình thành nên màng
sinh học Biocellulose.
Màng sinh học Biocellulose với những đặc tính rất ƣu việt đƣợc
xem nhƣ là một nguồn polymer sinh học mới lạ, đƣợc tạo ra do vi khuẩn
Gluconacetobacter Chúng có đặc tính và cấu trúc tƣơng tự nhƣ
cellulose của thực vật. Cellulose của vi khuẩn chúng có những đặc tính
đặc biệt ƣu việt hơn sơ với cellulose của thực vật nhƣ về độ dẻo dai, độ
chắc, bền, đàn hồi. Với những đặc điểm nổi trội nhƣ vậy chúng đã đƣợc
ứng dụng vào nhiều các lĩnh vực nhƣ: Màng phân tách để xử lý nƣớc
(Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998), công nghiệp sản xuất giấy, mặt nạ
dƣỡng da, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. ặc biệt trong lĩnh vực y
học, màng Biocellulose đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các
bệnh tim mạch. Vậy nên màng sinh học Biocellulose có nhiều tiềm năng
để có thể thay thế túi nilông trong tƣơng lai và khả năng đánh giá độ

nhiễm khuẩn của thực phẩm.
Trong nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cacbon, nitơ và nhiệt độ có
ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật
trong quá trình tạo màng sinh học Biocellulose ể hiểu rõ hơn về bản
chất của quá trình tạo màng Biocellulose và ảnh hƣởng của nguồn
cacbon, nitơ và nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh học Biocellulose
mỏng dai, và có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đã lựa chọn đề tài:

1


“N ên cứu ản ưởng của nguồn cacbon, n tơ v n ệt đ tới khả
n n tạo m n B ocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định đƣợc hàm lƣợng cacbon, nitơ và nhiệt độ thích hợp cho
quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng dịch nƣớc dừa hoặc dịch
nƣớc mía ịnh hƣớng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
3. Nội dung nghiên cứu
3 1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo
màng Biocellulose.
3.2. Ảnh hƣởng của cacbon tới khả năng tạo màng Biocellulose của
chủng Gluconacetobacter xylinus T1.
3.3. Ảnh hƣởng của nitơ tới khả năng tạo màng Biocellulose của
chủng Gluconacetobacter xylinus T1.
3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng tạo màng Biocellulose của
chủng Gluconacetobacter xylinus T1.
3.5 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose và ứng dụng bảo quản
thực phẩm.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý n

ĩa k oa ọc

Trong quá trình sống của vi sinh vật đều cần nguồn dinh dƣỡng là
nitơ, cacbon và điều kiện môi trƣờng thuận lợi để phát triển Nitơ là
thành phần quan trọng trong đời sống của sinh vật vì chúng có nhiệm vụ
là xây dựng khung xƣơng tế bào Cacbon có trong tế bào chất, thành tế
bào, trong tất cả các enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất.
Nhiệt độ thuận lợi giúp cho sinh vật sinh trƣởng và phát triển tốt nhất.
4.2. Ý n

ĩa t ực tiễn

Tạo màng Biocellulose trong thời gian ngắn nhất (khoảng 4 ngày)
và tốt nhất với chi phí thấp, bƣớc đầu sản xuất túi bảo quản thực phẩm
có khả năng phân hủy ngoài tự nhiên để thay thế túi nilông.
2


5. Đóng góp của đề tài
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn G.xylinus T1 có khả năng tạo
màng mỏng, dai và bền. Tìm đƣợc nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ thích
hợp cho quá trình lên men tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn
G.xylinus T1 bao gồm: đƣờng glucose với hàm lƣợng 10 - 12 (g/l); nitơ
vô cơ là (NH4)2SO4 với hàm lƣợng là từ 3 (g/l), nguồn nitơ hữu cơ là
pepton với hàm lƣợng là 5 (g/l) và ở nhiệt độ là 30C.

3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhu cầu dinh dƣỡng và nhiệt độ của vi sinh vật có khả năng lên
men tạo màng Biocellulose
1.1.1. Ản

ưởng của nguồn cacbon

ể vi sinh vật có thể sinh trƣởng và phát triển tốt cần cung cấp
nguồn cacbon phù hợp, tùy thuộc vào nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon
đƣợc cung cấp là vô cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp
thụ cacbon của vi sinh vật phụ thuộc vào các yếu tố: Thành phần hóa học
và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lí của từng loại vi
sinh vật.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng đƣờng để làm thức ăn cacbon khi nuôi
cấy phần lớn các vi sinh vật dị dƣỡng. Cần chú ý rằng đƣờng đơn ở nhiệt
độ cao có thể chuyển hóa thành các loại hợp chất có màu tối gọi là
đƣờng cháy rất khó hấp thụ Trong môi trƣờng kiềm sau khi khử trùng
đƣờng còn rễ bị axit hóa và làm biến đổi pH môi trƣờng ể tránh các
hiện tƣợng này khi khử trùng môi trƣờng chứa đƣờng ngƣời ta thƣờng sử
dụng nồi hấp ở áp lực 0,5atm (112,5C) và duy trì trong vòng 30 phút
ối với các loại đƣờng đơn tốt nhất là sử dụng phƣơng pháp hấp gián
đoạn (phƣơng pháp Tyndal) hoặc lọc riêng dung dịch đƣờng (thƣờng
dùng ở nồng độ 20%) bằng nến lọc hoặc bằng màng lọc vi khuẩn sau đó
dùng thao tác vô trùng để bổ sung vào môi trƣờng đã khử trùng [3].
ể nuôi cấy các loại vi khuẩn khác nhau ngƣời ta thƣờng dùng
nồng độ đƣờng không giống nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn ngƣời ta
thƣờng dùng 0,2 - 0,5% đƣờng. Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hóa đƣợc
các loại đƣờng ở dạng đồng phân D Các hợp chất chứa cả C và N
(pepton, nƣớc thịt, nƣớc chiết ngô, nƣớc chiết nấm men, nƣớc chiết đại

mạch, nƣớc chiết giá đậu) có thể sử dụng vừa làm nguồn cacbon vừa làm
nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2].

4


1.1.2. Ản

ưởng của nguồn n tơ

Môi trƣờng để nghiên cứu về cellulose của vi khuẩn là môi trƣờng
do Hestrin và Schramm thiết lập, có chứa cao nấm men và pepton là
nguồn hữu cơ, (NH4)2SO4 là nguồn nitơ vô cơ Nguồn nitơ vô cơ mà vi
sinh vật dễ hấp thụ nhất là NH3 và
Sau khi đồng hóa

[2].

trong môi trƣờng sẽ tích lũy anion vô cơ

và vì thế mà làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng. Muối amon
của các axit hữu cơ ít làm chua môi trƣờng hơn do đó có lúc đƣợc sử
dụng nhiều hơn Ure là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lí
Nhiều khi để nuôi cấy vi sinh vật bằng nguồn nitơ là ure ngƣời ta phải bổ
sung thêm muối amon. Sở dĩ nhƣ vậy là bởi vì phải có thức ăn nitơ để
hấp thụ cho vi sinh vật phát triển đã thì mới có thể sản sinh ra đƣợc
ureaza để thủy phân ure [3].
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo,
nấm sợi và xạ khuẩn nhƣng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi
khuẩn. Sau khi vi khuẩn sử dụng hết gốc

các ion kim loại còn lại

sẽ làm kiềm hóa môi trƣờng.
1.1.3. Ản

ưởng của nhiệt đ

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng đến sự hoạt động của các vi sinh
vật trong quá trình tạo màng Biocellulose. Trong quá trình sinh trƣởng
nếu nhƣ trong điều kiện nhiệt độ thấp vi sinh vật sẽ sinh trƣởng rất chậm,
thời gian nuối cấy kéo dài ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp cellulose.
1.2. Cấu trúc và tính chất của màng Biocellulose
1.2.1.Cấu trúc của m n B ocellulose
Biocellulose đƣờng kính bằng 1/100 đƣờng kính của cellulose thực
vật

Màng Biocellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme

-1,4

glucopynanose Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật,
nhƣng cấu trúc và đặc tính của chúng lại khác xa nhau [18].
Chuỗi polyme

-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với

nhau tạo thành sợi nhỏ có kích thƣớc 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
5

thành sợi lớn hơn – sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998) [23],
những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo thành dải
robbon (Yamanaka et.al 2000) [24]. Dải ribbon có chiều dài khoảng từ
1-9nm. Những dải ribbon đƣợc kéo dài ra từ tế bào này sẽ liên kết với
những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực
Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lƣới hay một lớp màng mỏng
trên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy.
1.2.2. M t số tín c ất của m n B ocellulose
Brown A J (1886), đã nghiên cứu lớp màng do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi trƣờng nuôi cấy và thấy có bản chất là
hemicellulose Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong
nƣớc nhƣng tan trong dung dịch kiềm tính [17].
Ngoài ra màng Biocellulose có độ tinh sạch rất tốt, tốt hơn nhiều
so với các cellulose khác không những vậy chúng còn có khả năng tự
phân hủy sinh học, tái chế hay hồi phục hoàn toàn Chúng còn có độ bền
cơ học cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp và ổn định về kich thƣớc.
Tính hút nƣớc của màng Biocellulose thì màng có khả năng giữ nƣớc
đáng kể (lên đến 90%), có tính xốp, độ ẩm cao.
1.2.3. Qu trìn tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter
Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter ở trong môi trƣờng có
nguồn dinh dƣỡng đầy đủ (chủ yếu là cacbohydrat, các vitamin

,

,
và các chất kích thích sinh trƣởng), ở đây chúng sẽ thực hiện quá
trình trao chất bằng cách hấp thụ chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng bên
ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trƣởng và phát triển, còn lại để
tổng hợp cellulose và thải ra môi trƣờng. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát

triển ngày càng dài hƣớng từ đáy lên bề mặt trong môi trƣờng nuôi cấy
[19]. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose nhƣ sau: các
tế bào Gx khi sống trong môi trƣờng lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi
chất của mình bằng cách hấp thụ đƣờng glucose, kết hợp đƣờng với acid
béo để tạp thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này đƣợc tiết ra

6


ngòai nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có
thể polymer hóa glucose thành cellulose

ìn 1.1. Qu trìn

ìn t

n cellulose tron tế b o v k uẩn

Gluconacetobacter
Quá trình sinh tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm
nhiều bƣớc đƣợc điều hòa một cách chuyên biệt và chính sác bằng một
hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều
hòa
Theo Alaban C A và cộng sự (1967) [16] các enzyme tham gia vào
quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:
1PFK: Fructose-1-phosphate kinase
PGI: Photphoglucoisomerase
PGM : Photphoglucomutase
UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase
Fru-6-P : Frutose-6-phosphate

Glc-1-P : Glucose-1-phosphate
UDPGlc : Uridine diphosphoglucose
GK : Glucokinase
FBP : fructose-1,6-bi-phosphate phosphatase
G6PDH : Glucose-6-phosphate dehydrogenase

7

PTS : Hệ thống photphotransferrase
Fru-bi-P : Frutose-1,6-bi-phosphate
Glc-6-P : Glucose-6- phosphate
PGA : Phosphogluconic acid acid
CS : Cellulose synthase
FK : fructokinase


ìn 2.2. Con đường chuyển o cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter
1.2.4. Chức n n của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trƣờng nuôi cấy có
tác dụng nhƣ một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter
trƣớc các nhân tố có hại của môi trƣờng Có những ghi nhận cho rằng
cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím
Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter đƣợc bao bọc bởi
Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia cực tím. Khi tách
Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ
còn 3% [20].
Không những vậy màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho
các tế bào vi khuẩn, đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dƣỡng từ
môi trƣờng một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trƣờng lỏng

không có mạng lƣới cellulose.

8


1.2.5. Tú bảo quản thực phẩm
Nhƣ chúng ta đã biết, túi nilông là một loại túi nhựa rất bền, dẻo,
mỏng, nhẹ và tiện dụng Túi nilông dƣờng nhƣ đã rất gần gũi trong cuộc
sống hằng ngày của mỗi chúng ta và trở thành vật dụng không thể thiếu
Tuy nhiên, theo nghiên cứu thì phải mất từ 500 - 1000 năm thì túi nilông
mới bị phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên Và nếu với cứ đà sản xuất và
sử dụng túi nilông nhƣ hiện nay thì sẽ đến một ngày trái đất của chúng ta
sẽ ngập trong túi nilông. ể giải quyết vấn đề này đã có rất nhiều những
giải pháp đƣợc đƣa ra nhƣ: túi nhựa thay thế, túi giấy thay thế… Tuy
nhiên những loại túi này vẫn còn rất nhiều hạn chế nhƣ túi nhựa có thể
tái sử dụng nhƣng khó phân hủy, túi giấy thì chỉ sử dụng đƣợc một vài
lần và chi phí khá cao Vậy nên có một giải pháp đƣợc đƣa ra đó là sử
dụng túi bảo quản thực phẩm đƣợc làm từ màng Biocellulose.
Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) [16]
màng Biocellulose sau khi đã đƣợc xử lý có độ dẻo dai cao, khả năng hút
ẩm tốt và ngăn cản đƣợc sự xâm nhập của vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc
do đó có thể ứng dụng làm màng bao chống vi sinh vật, đồng thời giảm
lƣợng hóa chất bảo quản trong thực phẩm. Ứng dụng làm màng bảo quản
thực phẩm là một trong ứng dụng quan trọng của cellulose vi khuẩn
trong ngành công nghệ tế bào bao bì trong những năm gần đây
(Yoshinaga 1997) [21].
1.3. Lịch sử nghiên cứu vấn đề
1.3.1. Trên t ế giới
Nghiên cứu về màng Biocellulose và ứng dụng của nó đã đƣợc tiến
hành ở nhiều nƣớc trên thế giới Tác giả Brown (1999) dùng màng

Biocellulose làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng tế bào Brown, Jonas
và Farad dùng màng nhƣ một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi
tuyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm ặc biệt là Jay shah, Brown M,R (2005) đã dùng
màng Biocellulose làm vải đặc biệt, Jonas và Farad (2008) dùng màng

9


Biocellulose để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ chất để cố định
pritein thay cho sắc kí Barbana Surma và các cộng sự (2008) đã đƣa ra
phƣơng pháp chế tạo màng, ảnh hƣởng của nguồn cacbon, đƣờng
glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose
của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. ặc biệt trong y học ngƣời ta
đã chế tạo ra các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa
cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này
đƣợc sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng,
loét da, làm sạch máu điều trị các bệnh tim mạch. a số các tác giả nƣớc
ngoài đều nghiên cứu theo hƣớng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn và
ứng dụng trong chế biến thực phẩm, công nghiệp giấy và đặc biệt là y
học.
Ngoài ra, màng Biocellulose còn đƣợc sử dụng trong công nghệ
làm đẹp để tạo ra những chiếc mặt nạ để đáp ứng cho nhu cầu làm đẹp,
công nghiệp giấy để tạo ra những loại giấy có chất lƣợng cao Năm 2006
Czajt và các cộng sự đã sử dụng màng Biocellulose đã đƣợc sử lý để đáp
lên vết bỏng, vế thƣơng hở đã thu đƣợc kết quả khả quan, không những
vậy ông và các cộng sự cũng dùng màng để làm da nhân tạo.
1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng Biocellulose mới

chỉ ở những bƣớc đầu. Trần Thị Trƣờng An và Nguyễn Thúy Hƣơng tại
trƣờng ại Học Quốc Gia, ại học Bách Khoa-HCM đã bƣớc đầu sử
dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt
tƣơi qua sơ chế tối thiểu [8] Năm 1997, Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn
Thị Mùi cũng đã nghiên cứu môi trƣờng nƣớc giá đỗ thay thế nƣớc dừa
trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Gluconacetobacter Năm 2006,
nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan đã
nghiên cứu về màng từ Gluconacetobacter tẩm dầu mù u dùng trong
điều trị bỏng [10].
Hiện nay những nghiên cứu và ứng dụng màng từ chủng
Gluconacetobacter ngày càng đƣợc quan tâm Ngày càng có nhiều
nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter sự hình
10


thành màng và ứng dụng của màng Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Tƣởng bộ môn Vi Sinh – Kí Sinh, Trƣờng đại học Y Dƣợc học
Tp HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu tù mù bằng
phƣơng pháp lên men Màng có khả năng thấm nƣớc cao, kết dính chặt
và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò nhƣ màng sinh học, có thể thay
thế da tạm thời [10]. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn
đều có nguồn gốc từ thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các
yếu tố gây kích ứng da nên có thể dùng màng sinh học để ngăn ngừa
biến chứng nhiễm trùng vết thƣơng bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết
thƣơng, qua đó rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên
vùng bỏng sâu [1].
Tuy nhiên các nghiên cứu khoa học bƣớc đầu chỉ quan tâm tới
quá trình tạo màng, đặc điểm và cấu trúc và tính chất của màng Còn các
ứng dụng của màng Biocellulose vào thực tiễn mới chỉ đƣợc sử dụng
trong công nghệ chế tạo màng sinh học dùng trị bỏng và đƣợc ứng dụng

trong sản xuất thạch dừa. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm
Vi sinh Trƣờng ại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã phân lập và tuyển chọn
đƣợc chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng Biocellulose là
một bƣớc tiến mới quan trọng góp phần mở đƣờng cho sản xuất các loại
túi đựng thực phẩm thay thế cho túi nilông

11


Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đố tượn n

ên cứu

ối tƣợng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn sinh vật có khả năng tạo
màng Biocellulose tuyển chọn từ môi trƣờng lên màng Biocellulose nhân
tạo.
2.1.2. Dụng cụ v t ết bị
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng một số thiết bị
sau:
- Tủ ấm, tủ sấy Binder ( ức).
- Box cấy vô trùng (Haraeus)
- Nồi hấp Tommy (Nhật).
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
- Tủ sấy (Haraeus, ức).
- Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ).
- Micropipep (Gilson, Pháp)
- Tủ lạnh (Tawasi, Nhật).

- Kính hiển vi quang học (olympus CX41, Nhật).
- Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác,
lam kính, la men, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng
khác
Tất cả các dụng cụ các thiết bị và hóa chất đều do phòng Vi sinh,
Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng ại học Sƣ Phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.3.

óa c ất

- Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Saccarose, Acid acetic, Agar.

12


- Nguồn Nitơ : Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 ; nguồn nitơ hữu cơ là
pepton, cao thịt.
- Các muối khoáng: KH2PO4, MgSO4.7H2O.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fushsin, Lugol
- Nƣớc dừa nguyên chất.
2.1.4. C c loạ mô trường
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose

20 g

(NH4)2SO4

3g

MgSO4. 7H2O

2g

Thạch agar

20 g

Pepton

5g

KH2PO4

2g

Nƣớc máy

1000 ml

2g

CaC

2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2)
Glucose
MgSO4. 7H2O

20 g

(NH4)2SO4

3g

2g

Axit acetic

2%

KH2PO4

2g

pH

5,0 – 6,0

Nƣớc máy

1000 ml

2.1.4.3. Môi trường lên men
STT

Thành phần

MT3

MT4

MT5

MT6

1

KH2PO4

2g

2g

2g

2g

2

(NH4)2SO4

3g

3g

3g

3g

3

MgSO4.7H2O

2g

2g

2g

2g

4

Glucose

20g

5

Fructose

20g

13