ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC XUẤT LỚN NHẤT (MPN)

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC XUẤT
LỚN NHẤT (MPN)
GVHD:NGUYỄN THỊ MỸ LỆ


NỘI DUNG
I.

ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH: COLIFORMS

II.

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG : MPN

III.

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

IV.

VÍ DỤ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VSV TRONG NƯỚC


I.

COLIFORMS



Coliforms là những trực khuẩn gram (-)



Không sinh bào tử



Hiếu khí hoặc kị khí tùy ý



0
Có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 c trong 24- 48h



Coliforms được xem là nhóm vsv chỉ thị


Coliforms gồm 4 nhóm :

echerichia

enterobacter

coliforms

klebsiella

citrobacter

Echerichia Coli

Citrobacter Freundii Bacteria


Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase

Enterobacter aerobacter


Là coliforms chịu nhiệt có khả
năng sinh indole khi ủ ở 44.5
0

Coliforms phân + IMViC

c /24h trong tryptone


II. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER





Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vsv trong các
độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần ( 3- 10 lần).
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương

tính và có một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đoán
số lượng vsv trong mẫu.




Hai hệ thống MPN:
Hệ thống 9 ống
Hệ thống 15 ống
 Đặc điểm:
Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi
cấy như :
Sự tạo hơi : Coliforms
Sự đổi màu : S. aurius
Cho phép định lượng được mật độ vsv thấp trong thể tích mẫu lớn


HỆ THỐNG MPN /g (ml)


sử dụng test

Dựa

Phương pháp
phân tích dựa
trên quy trình
MPN bằng
cách sử dụng

Broth ( LSB )

lên men

ống sinh hơi

Tryptone

khả năng

kiểm tra các

sinh hóa :

chừng : để

trên cơ sở

đoán

( các ống
dương tính )
– qua các
ống Duharm
được hơi
sinh ra đẩy
lên trên

sinh hơi ở

môi

canh Lauryl
Sulfate

vào test đoán
chừng
( presumptive

trường
nuôi cấy ủ

test ), sau đó
dùng canh
Brilliant

Lactose Salt (

48 giờ .

Green

ở 37oC –

BGLB) và ủ
ấm ở 37o C ,
từ 24 – 48
giờ.

III.

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

- Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng
của đối tượng VSV cần định lượng một thể tích chính xác ở dung dịch mẫu ở
3 nồng độ bậc 10 liên tiếp, mỗi mức 3 hoặc 5 ống nghiệm ; ủ ở nhiệt độ và
thời gian thích hợp.
- Kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm
định ( sinh hơi, đổi màu, đục, …)


- Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha
loãng. Tra bảng Mac Crady rồi suy ra mật độ vi sinh vật
MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu .
Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số ống nghiệm
lặp lại trong mỗi độ pha loãng .


-

Pha loãng mẫu thành 1 dãy thập phân ( nồng độ bậc 10 liên tiếp ); mỗi nồng độ pha loãng

Nguyên tắc thực hành

được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại có ống Duharm.

-

Theo dõi sự đục môi trường và sinh hơi để tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm – đây là

các ống dương tính.

-

Ghi nhận số ống cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để

suy ra số lượng nhóm VSV tương ứng hiện diện trong 1ml ( 1g ) mẫu ban đầu .


MÔI TRƯỜNG


HÓA CHẤT
CỒN 90 ĐỘ VÀ 70 ĐỘ

HCL 10%

NAOH 10%


QUY TRÌNH THỰC HIỆN


- Bước 1 : Chuẩn bị mẫu
Cân 10g mẫu cho vào túi
dập mẫu ( nếu là mẫu rắn) hoặc
10ml mẫu ( mẫu lỏng ) cho vào
bình tam giác chứa 90ml dd SPW
đã vô trùng , và đồng nhất mẫu

trong 1 phút .


Bước 2 : Chuyển 1ml dung
dịch mẫu pha loãng ở mỗi
nồng độ 10-1 , 10-2, 10-3 vào
ống nghiệm có chứa 10ml
canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, mỗi ống nghiệm
cho 1 ống Durham


Bước 3 :
+ Sau 48 giờ - các ống nghiệm được ủ ở
37o C - Ghi nhận các ống LSB sinh hơi và
canh trường đục
+ Kết luận các ống LSB dương tính (+)


Bước 4 : Chuyển 1ml từ các
ống nghiệm LSB ( + ) ở mỗi
nồng độ vào các ống nghiệm
có chứa 10ml canh BGLB rồi
cũng ủ 37

O

C , 48 giờ

10 ML BGLB

Bước 5 :
+ Ghi nhận số ống sinh hơi và
canh trường đục ở mỗi độ pha
loãng
+ Kết luận các ống BGLB ( + ).


Bước 6 : Tính kết quả

- Từ kết quả thí nghiệm ta có:

•
•
•

Nồng độ 10-1: có 3 ống BGLB(+)
Nồng độ 10-2: có 1 ống BGLB(+)
Nồng độ 10-3 : không có ống nào
BGLB(+)

- Tra bảng Mac Crady :

Tra bảng MPN/100ml ta có kết quả : 43 coliform tổng /
100 ml mẫu


IV.Phân tích coliforms trong mẫu nước

 giới thiệu về vsv trong mẫu nước





Nước, dung môi phổ biến, là điều cần thiết cho cuộc sống: nước sạch để tắm, uống và nấu
ăn. Thật không may, nhiều tác nhân gây bệnh lây truyền qua nguồn nước. Một số các loài gây
bệnh như bại liệt, thương hàn, tả, viêm gan, Bệnh vi khuẩn Shigella, Salmonella...
Coliforms có đầy đủ các tiêu chuẩn và là những sinh vật chỉ thị chuẩn được sử dụng để kiểm
tra tình trạng ô nhiễm sinh học của nước.
Theo tiêu chuẩn của EPA thì nước uống và nước trong hồ bơi phải có độ tinh khiết cao nhất.
Không thể có nhiều hơn một mẫu dương tính (> 1 coliform/100 ml) trong 40 mẫu được kiểm tra
trong một tháng và nồng độ coliform phân phải bằng không.


 THỦ TỤC PHÂN TÍCH NƯỚC
Giai đoạn 1:
Chuẩn bị:
•

1 mẫu nước

•

8 đĩa petri vô trùng

•

2 chai thạch Agar tan chảy (PCA, 100 ml / chai) - trong nước tắm 50 ° C

•

15 ống Lactose Lauryl Tryptose Broth(LLTB, với ống Durham)

•

Pipett vô trùng