ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

MÔN HỌC:
PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
MPN

GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ
Nhóm 03


NỘI DUNG

GiỚI THIỆU SƠ LƯỢC E.COLI

 PHƯƠNG PHÁP MPN & QUI TRÌNH THỰC HIỆN

www.themegallery.com

LOGO


GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

 E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm; trong những
điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất
dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động.

 Escherichia coli do Theodore Escherich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Đức,
phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Trong các
loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

 Tính chất hóa sinh
 E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên men
lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) không hoặc lên men rất chậm.

 E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H2S. Không sử dụng được nguồn carbon của
citrate trong môi trường Simmons. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm
tính, sau 48 giờ có thể dương tính.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

 Tính chất nuôi cấy
 E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát
triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu, kỵ khí tùy ý. Có thể phát
0
0
triển ở nhiệt độ từ 5-50 C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37 C.

 Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát
được khuẩn lạc. Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc
màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey)

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

THẠCH MACONKEY

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

 Khả năng gây bệnh
 E.coli là 1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy,
viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm
khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh.
E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


PHƯƠNG PHÁP MPN
&
QUY TRÌNH THỰC HIỆN

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


PHƯƠNG PHÁP MPN

 Nguyên tắc
 Phương pháp MPN ( Most Probable Number) dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một
dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên
tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham.

 Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện là các ống dương tính (+). Ghi nhận số
ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm
vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


QUY TRÌNH THỰC HIỆN

Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng
nhất hoặc pha loãng để có các
nồng độ pha loãng là 10-1 ,
10-2 , 10-3 ...

Bước 2: Chuyển 1ml dung dịch pha
loãng ở 3 nồng độ liên tiếp vào ống
nghiệm có 10ml canh LSB, mỗi
0
nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 ± 1 C,
48 giờ. Mỗi ống nghiệm cho 1 ống
Durham.

www.themegallery.com

LOGO


QUY TRÌNH THỰC HIỆN
Bước 3: Ghi nhận các ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống LSB (+).

Bước 4: Chuyển 1ml LSB (+) sang canh EC ủ

0
44,5 ± 0,2 C, 24 giờ

Bước 5: Ghi nhận các ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống EC (+).

www.themegallery.com

LOGO


QUY TRÌNH THỰC HIỆN

 Bước 6: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa
EMB/ Endo. ủ các đĩa 370C, 24 giờ.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


QUY TRÌNH THỰC HIỆN

 Bước 7: Chọn khuẩn lạc E. Coli giả định trên EMB/ Endo cấy vào TSA/ BHI. Ủ qua đêm.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO

QUY TRÌNH THỰC HIỆN



Bước 8: Cấy chuyền từ môi trường TSA/ BHI vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa Trypton Broth, MR-VP ,
0
SC. ủ 44,5 ± 0,2 C, 24 giờ.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

 Phản ứng INDOL
Nguyên tắc:

-

Dùng để phân biệt những vi sinh vật có khả năng phân hủy Tryptophane tạo Indole do có enzyme
Tryptophanase.

-

0
Thực hiện: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5ml Trypton broth, ủ 37 C trong 24h

- Thuốc thử: Kovaes hoặc Erlich.( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống nghiệm sau khi ủ)

-

Kết quả:
+ dương tính nếu dung dịch môi trường xuất hiện vòng màu đỏ  có sự hiện diện của indole
+ âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu

 không có sự hiện diện của indole

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ
Phản ứng INDOLE

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

 Phản ứng MR (metyl red)
- Dùng để phân biệt những vi sinh vật có khả năng sản sinh và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid, bền với môi
+
trường, chỉ thị Methyl Red dùng để chỉ thị nồng độ H trong môi trường .
- Môi trường MRVP.
- Thuốc thử : Methyl Red ( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống nghiệm sau khi ủ)
pH < 4,4 ( môi trường có màu đỏ)
4,5 < pH < 5,8 ( môi trường có màu cam.)
pH > 5,8 ( môi trường có màu vàng.)

-

Kết quả:
+ dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ  vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính acid.
+ âm tính nếu dung dịch chuyển sang màu vàng  vi sinh vật không có khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính

acid.
*LƯU Ý: nếu môi trường xuất hiện màu cam chúng ta cần ủ thêm thời gian, nếu từ màu cam chuyển sang màu đỏ ta
kết luận kết quả dương tính, còn nếu vẫn màu cam thì kết luận kết quả âm tính.

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ
Phản ứng MR ( metyl red )

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO

THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

Thử nghiệm không sinh Acetoin

( thử nghiệm Voges –

Proskauer) (VP)

 Nguyên tắc:
- Phản ứng thử VP dùng để phân biệt các vi sinh vật có khả năng sinh Acetoin ( môi trường trung tính).
- Cho vào ống nghiệm chứa môi trường MRVP khoảng 0,6ml dung dịch α-napthol và 0,2ml dung dịch
kalihydroxyt 40%, lắc đều, để yên trong 2h.
- Thuốc thử: -Naphtho (6 giọt), NaOH 40% hoặc KOH 40% (2 giọt)
- Kết quả:
+ dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ  vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.
+ âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu đỏ  không có vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ
Phản ứng VP (Voges Proskauer)

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO

THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

Phản ứng Citrat

 Nguyên tắc: Những vi sinh vật có khả năng sử dụng muối Citrate và Amonium sẽ tạo ra

các sản phẩm biến dưỡng CO2, NH2, Na2CO3 làm kiềm hóa môi trường  chuyển chỉ thị
Bromothymol Blue từ màu xanh lá cây sang xanh dương.

- Chất chỉ thị: Bromothymol Blue có trong môi trường simmon citrate

-

Kết quả:
+ dương tính nếu môi trường trong ống chứa mẫu chuyển từ xanh lá cây sang xanh
dương.
+ âm tính nếu môi trường trong ống chứa mẫu không đổi màu

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO


THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ
Phản ứng Citrat

LOGO

KẾT LUẬN

Sau 4 thử nghiệm kiểm tra E.coli:

•
•
•

Thử nghiệm khả năng sinh Indole : dương tính(+).
Thử nghiệm khả năng sinh Acid : dương tính(+).
Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP) : âm tính
(-).

•

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate: âm tính (-).

-> Kết luận vi sinh vật kiểm tra là E.coli
(IMViC + + - -)

www.themegallery.com

LOGO