KIỄM TRA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM


KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: KIỄM TRA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS
GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

BUỔI:

Thứ 5 , tiết 9  10


ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH
ĐỘC TỐ
PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH VÀ ỨNG
DỤNG


I-Giới tiệu về Bacillus cereus:
• Trực khuẩn Gram dương
• Thuộc giới bacteria
• Ngành (phylum) firmicutes
• Lớp (class) bacilli
• Bộ (order) Bacillales
• Họ (family) Bacillaceaem
• Chi (genius) Bacillus
• Loài (species) Cereus

 Bacillus cereus trên kính hiển vi 

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Trong chi bacillus này ngoài loài cereus
còn có một số loài như:
• Bacillus subtilis
• Bacillus coagulans
•  Bacillus thuringiensis
•  Bacillus natto
•  Paenibacillus larvae 

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


• Được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc
thực phẩm vào năm 1955
• Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí
tùy ý, di động.
• Bào tử dạng hình ovan
• có khả năng sinh nha bào

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Bacillus cereus Infections Bacillus
cereus subsp. mycoides. Gram stain

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Khuẩn lạc Bacillus cereus
trên môi trường BA

Thứ 5, Tiết 9  10


1) Đặc điểm
• Kích thước 0.5–1.5 x 24µ
• Hiếu khí, kỵ khí tùy ý,
di động
• Tạo nội bào tử
• Lên men glucose sinh
hơi
• Phản ứng VP( +).
Mô hình cấu tạo B.cereus

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


2) Đặc điểm nuôi cấy

Nhiệt độ 5oC-50oC, tối ưu 35oC-40oC.

pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2
Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ
tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
Trên môi trường MYP : khóm hồng
chung quanh có vòng sáng.

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Trên môi trường Mossel (thạch
cereus selective agar): khóm to
hồng chung quanh có vòng
sáng.
Trên môi trường canh NB,
TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn
cợn


3) Tính chất sinh hóa
Trên môi
trường
đường: lên
men glucose
trong điều
kiện hiếu

khí và kị
khí, không
lên men
mannitol.

Khử
nitrat
thành
nitrit.

Phản
Phân Catalase Mọc trên
(+),
NB +
ứng VP
giải
Citrate
0,001%
(+)
Tyroxin
(+)
lyzozym

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


II.
TÍNH

CHẤT
GÂY
BỆNH
–
ĐỘC
TỐ
TRIỆU
CHỨNG
II. TÍNH CHẤT GÂY BỆNH – ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG
+ Độc tố gây tiêu chảy

(Type 1)

+ Độc tố gây nôn mửa
(Type 2):

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


SƯ HIỆN DIÊN CỦA VI KHUẨN NÀY:


Triệu chứng trúng độc:
Thức ăn chứa mật độ
vi khuẩn: 105 vi
khuẩn/g thực phẩm đủ
gây độc.
Biểu hiện đau bụng,

buồn nôn và nôn sau
1-5 giờ ăn phải thực
phẩm nhiễm vi khuẩn.
Bệnh có thể kéo dài 24
giờ.

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


2) Cơ chế gây bệnh
a) Triệu chứng nôn mửa
Tính chất / Hoạt động

Liều nhiễm độc

Liều nhiễm độc

Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm
Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg

Độc tố được sản sinh ra

Trong thực phẩm (25 oC - 30oC)

Thời kỳ ủ bệnh
Khoảng thời gian mang bệnh

30 phút - 5 giờ

6 giờ - 24 giờ

Triệu chứng

Buồn nôn, nôn mửa

Loại thực phẩm thường gặp nhất

Cơm nấu hoặc chiên, mì ống, phở…

Tên của độc tố

Cereulide

Sinh kháng thể

Không

Hoạt động sinh học trên người

Gây nôn

Khả năng chịu nhiệt

90 phút ở 121oC

Ảnh hưởng của sự phân giải protein

Không

Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B.


b) Triệu chứng tiêu chảy
Liều gây nhiễm
Độc tố được sản sinh ra

Đặc tính
Thông thưởng là 106/g hoặc 106/ml
Trong ruột non

Thời kỳ ủ bênh
8 giờ - 16 giờ
Khoảng thời gian mang
12 giờ - 24 giờ
bệnh
Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nư
Triệu chứng
ớc, thỉnh thoảng buồn nôn

Đặc điểm của bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B.
Cereus

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương
pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho kết quả,

người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp
chính là phương pháp truyền thống và phương pháp
phân tích nhanh.

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


III- Các phương pháp truyền thống
1) Đặc điểm và nguyên tắc
Ưu điểm
+ Thao tác đơn giản, dễ làm,
+ Không phải đầu tư dụng cụ,thiết bị đắt tiền
Hạn chế
+Độ nhạy không cao
+ Tốn nhiều nhân công
+Thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế
trong công tác phòng ngừa.


Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus
nhóm I như B.anthracis gây bệnh than cho người,
B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng,
B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa.
Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh
hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều
kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy
phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme,
Được trình bày trong bảng sau:

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Đặc tính
Gram
Catalase
Di động
Khử nitrat
Phân hủy tyrosine
Kháng lysozyme
Phản ứng với
lòng đỏ trứng
Lên men glucose
Phản ứng VP
Sinh acid từ
manitol
Tan máu (cừu)

B.cereus
+(a)
+
+/-(b)
+
+
+

Loài

B.thuringiens B.mycoid
is
es
+
+
+
+
+/-(c)
+
+
+
+/+
+

+
+
+
-(d)
+

B.megateriu
m
+
+
+/-(d)
+/-

B.anthracis

+

+

+

+

-

+
+

+
+

+
+

+
+

-

-

-

-

-

+

+

+

+

-(d)

-

Các đặc tính của Bacillus nhóm I

Chú thích :
•+(a) : 90 - 100% các chủng dương tính.
•+/-(b) : 50% các chủng dương tính.
•-(c) : 90 – 100% : cácchủng âm tính.
-(d) : Hầu hết các chủng âm tính


•Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc
như: Mannitol-Egg Yolk-polymycin (MYP), Cereus Selective
Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue
Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng
bằng môi trường này. Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng
bằng phương pháp MPN.

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


2) Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
a) Qui trình phân tích
Mẫu
Đồng nhất mẫu
Phân lập
Khẳng định
Đếm số khuẩn lạc điển hình
Nhuộm gram

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Test sinh hóa

Thứ 5, Tiết 9  10


b) Các bước tiến hành:
Bước 1: Pha loãng mẫu

Bước 2: Cấy mẫu lên môi
trường thạch (MPY hoặc
Mossel)
Bước 3: Khẳng định Bacillus
cereus bằng các phản ứng
sinh hoá

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


•Bước 1: Pha loãng mẫu
•10g mẫu + 90ml môi trường pepton đệm
(BPW)  đồng nhất bằng Stomacher/1phút để có
độ pha loãng 10-1  tiếp tục pha loãng thành dãy
thập phân đến 10-2 10-3 10-4… để có các độ pha
loãng thích hợp.

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường thạch (MPY hoặc
Mossel)
•Chọn hai nồng độ pha loãng thích hợp, hút 0.1ml dịch pha
loãng trải đều lên mỗi đĩa thạch (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dúng
que gạt trải chất nuôi càng nhanh càng tốt. Ủ trong vòng 24
giờ - 48 giờ ở 30oC.
• Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường phục hồi
TSA, ủ ở 30oC qua đêm trước khi thử nghiệm sinh hóa.
Các thử nghiệm sinh hóa:
+ Thử nghiệm khả năng lên men glucose
+ Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit
+ Thử nghiệm Voges – proskauer
+ Thử nghiệm Tyrosin

+ Thử nghiệm Lysozyme
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Thứ 5, Tiết 9  10


•Bước 3: Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hoá
Chọn và đếm các đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc đaặc trưng của
Bacillus cereus
Chọn ra 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi
TSA, ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hàng các thử nghiệm
sinh hóa.

Bacillus cereus trên môi trường Mossel và MYP