Tìm hiểu phương pháp Lai Phân Tử

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM
Khoa Công Nghệ Thực Phẩm

•
•
•
•

Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
GVHD : Nguyễn Thị Mỹ Lệ
Đề tài : Lai Phân Tử
Nhóm : 12, Tiết 9-10, thứ 5


Nội dung chính

•
•
•
•
•

I. Lịch sử lai phân tử
II. Khái niệm về lai phân tử
III. Các phương pháp lai phân tử
IV. Ứng dụng của lai phân tử
V. Ví dụ của lai phân tử


I. Lịch sử lai phân tử

•

•

1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại
học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing). Quá trình này bao gồm
sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ
sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được
phát triển.
Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic
có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).


•
•

II. Khái niệm về lai phân tử
Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ
không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột.
Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình
không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ
từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại.
Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization).


II. Khái niệm về lai phân tử

•

Đặc điểm :

Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung.
Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân

tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA


II. Khái niệm về lai phân tử

Hình – sự lai giữa DNA và RNA



II. Khái niệm về lai phân tử

Nhiệt độ

Nồng độ DNA
và thời gian
phản ứng

Các yếu tố

Độ dài các

ảnh hưởng

trình tự

Lực ion

1. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng

- Nồng độ DNA nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung
càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng,
kết quả là tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên.
- Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên càng lớn
hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ
các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp (lai).


2. nhiệt độ

•

Tốc độ phản ứng lai phụ
thuộc nhiệt độ. Thông thường
phản ứng lai cực đại ở nhiệt
đố thấp hơn Tm của chính
nucleic acid đó độ 25%.


3. Độ dài của các trình tự

•

Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ sung.


4. Lực ion

•

Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ
phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng
độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn
toàn không còn tác dụng.


III. Các phương pháp lai phân tử

Lai trên pha lỏng

Lai trên pha rắn

Lai tại chỗ

Gồm 3 phương pháp


1. Lai trên pha lỏng

•

Nguyên tắc : Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là
một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do
chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ.


1. Lai trên pha lỏng

•

Phân tích định lượng các phân tử lai: 3 phương pháp.

Dùng quang phổ
kế

Sử dụng Nuclease
S1

Sắc kí trên hydroxylapatite


Phương pháp dùng quang phổ kế

-

DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn.
Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua
việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm.
Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện
tượng này có tên gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect).


Hiệu ứng siêu sắc :
Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng
đun nóng lên và làm lạnh từ từ thì kết quả
là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn
lúc đầu một chút. Nếu hạ nhiệt độ một cách

đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm. Đó là
do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu
tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi.


Phương pháp sử dụng nuclease S1

-

Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay
RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.

-

Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1.

-

Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử
lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng .


Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

-

Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci .

-

Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va
chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600C trong một dung dịch

Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai
với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết.

đệm Natri phosphat.


1. Lai trên pha lỏng

• Các ứng dụng :
1. Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài gần nhau
2. Phân tích các trình tự lặp lại 
3. So sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại. 


2. Lai trên pha rắn

•
•

Nguyên tắc : Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm
khác biệt ở đây là 1 trong 2 trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần
tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn.
Ưu điểm :
+ Thao tác dễ dàng.
+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở

dung dịch thuốc thử.

+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử.


2. Lai trên pha rắn

Hình – các bước lai trên pha rắn


2. Lai trên pha rắn

Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương pháp lai trên pha rắn :Giá thể rắn dùng để
cố định nucleic acid là các màng lai, có 2 loại màng lai : (1) màng lai bằng nitrocellulose và (2)
màng lai bằng nylon.


2. Lai trên pha rắn

•

Nhược điểm :
Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác.
Hiệu quả thấp.

Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so
với vận tốc lai trên pha lỏng do một
phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được
với các trình tự bổ sung.

2. Lai trên pha rắn
SOUTHERN BLOT

Ứng dụng : 4 phương

NORTHERN BLOT

pháp

WESTERN BLOT

DOT (SLOT) BLOT