HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ và sử DỤNG bộ xét NGHIỆM xác ĐỊNH mức độ đứt gãy DNA TINH TRÙNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN MINH THU

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ VÀ SỬ DỤNG
BỘ XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ
ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN MINH THU

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ VÀ SỬ DỤNG
BỘ XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ
ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG
Chuyên ngành : Y Sinh học - Di truyền
Mã số
:

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. NGUYỄN THỊ TRANG
2. TS. TRIỆU TIẾN SANG

HÀ NỘI – 2019


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Khái niệm vô sinh và vô sinh nam.........................................................3
1.2. Tình hình vô sinh hiện nay.....................................................................3
1.2.1. Tình hình vô sinh trên thế giới........................................................3
1.2.2. Tình hình vô sinh tại Việt Nam.......................................................4
1.3. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng...................................................4
1.3.1. Khái niệm đứt gãy DNA tinh trùng.................................................4
1.3.2. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng................................................5
1.3.3. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở
nam giới..........................................................................................8
1.4. Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng trên thế giới.........12
1.4.1. Phương pháp sử dụng các probe thuộc cấu trúc chất nhiễm sắc...12
1.4.2. Các phương pháp phát hiện trực tiếp tinh trùng có DNA bị đứt gẫy........13
1.4.3. Các phương pháp kiểm tra tính ổn định của chất nền nhân tế bào
tinh trùng.......................................................................................14
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................15
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................15
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn......................................................................15
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ.........................................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................15
2.2.1. Thời gian nghiên cứu....................................................................15

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................15
2.2.3. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu............................................................16
2.2.4. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................16
2.2.5. Quy trình nghiên cứu.....................................................................17
2.3. Các bước tiến hành xét nghiệm............................................................18
2.3.1. Hóa chất và dụng cụ......................................................................18


2.3.2. Chuẩn bị mẫu................................................................................18
2.3.3. Quy trình xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng.............................18
2.3.4. Khác biệt giữa quy trình xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy
DNA của bộ kit tự pha và kit Halosperm......................................20
2.3.5. Đánh giá kết quả............................................................................20
2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu............................................................22
2.4.1. Hoàn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm chẩn đoán đứt gãy
DNA tinh trùng..............................................................................22
2.4.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng
.......................................................................................................26
2.4.3. Đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh
trùng bằng kit tự pha và kit thương mại........................................27
2.5. Phân tích và xử lý số liệu.....................................................................27
2.6. Đạo đức nghiên cứu.............................................................................27
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................28
3.1. Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng xét nghiệm xác định mức độ
đứt gãy DNA tinh trùng.......................................................................28
3.1.1. Tối ưu hóa nồng độ thạch agarose tạo hỗn hợp với tinh dịch.......28
3.1.2. Tối ưu hóa lam kính......................................................................29
3.1.3. Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính và ly giải........................31
3.1.4. Đánh giá độ chính xác của bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy
DNA tinh trùng..............................................................................34

3.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh
trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA
tinh trùng bằng kit tự pha và kit thương mại.......................................36
3.2.1. Xác định độ nhạy của bộ xét nghiệm............................................42
3.2.2. Xác định độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm......................................42
3.2.3. Đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh
trùng bằng kit tự pha và kit thương mại........................................42


Chương 4: BÀN LUẬN..................................................................................46
4.1. Hoàn thiện quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng..........46
4.1.1. Tối ưu hóa nồng độ thạch agarose tạo hỗn hợp với tinh dịch.......46
4.1.2. Tối ưu hóa lam kính......................................................................47
4.1.3. Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính và ly giải........................48
4.1.4. Đánh giá độ chính xác của bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy
DNA tinh trùng..............................................................................51
4.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh
trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA
tinh trùng bằng kit tự pha và kit thương mại.......................................53
4.2.1. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu..................................................53
4.2.2. Đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh
trùng bằng kit tự pha và kit thương mại........................................54
KẾT LUẬN.....................................................................................................55
KIẾN NGHỊ....................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

Axit deoxyribonucleic

WHO

World Health Organization

DFI

DNA fragmentation index

IUI

intrauterine insemination

IVF

in vitro fertilization

ICSI

intracytoplasmic sperm injection


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

So sánh quy trình xét nghiệm của kit Halosperm và kit tự pha.. 20

Bảng 2.2.

Bảng quy ước xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ xét........26

Bảng 3.1.

So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch agarose........................28

Bảng 3.2.

So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch phủ lam kính...............29

Bảng 3.3.

Kết quả tạo tiêu bản tinh dịch - thạch trên các loại lam kính......30

Bảng 3.4.

So sánh DFI giữa các dung dịch biến tính..................................31

Bảng 3.5.

So sánh DFI giữa các dung dịch ly giải......................................33

Bảng 3.6.

Kết quả thử nghiệm xác định độ chính xác của bộ kit tự pha.....35

Bảng 3.7.

Kết quả đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng bằng 2 phương

pháp.............................................................................................36

Bảng 3.8.

Kết quả kiểm nghiệm mức độ đứt gãy ADN tinh trùng..............42

Bảng 3.9.

Bảng kiểm định hệ số tương quan giữa 2 phương pháp.............44

Bảng 3.10. Bảng kiểm định T - test của chênh lệch giữa 2 phương pháp.....44


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. So sánh tỷ lệ đứt gãy ADN tinh trùng bằng kit tự pha và kit
thương mại Halosperm..............................................................43
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ Bland Altman thể hiện tương hợp của 2 phương pháp
đo...............................................................................................45


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng .........................................5
Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997) ...............................7
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu............................................17
Hình 2.2. Hình ảnh tinh trùng có quần halo và không có quầng halo ...........21
Hình 2.3: Độ chính xác..................................................................................24
Hình 3.1. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch của bộ kit Halosperm.....29
Hình 3.2. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch tự pha........................29
Hình 3.3. Hình ảnh tiêu bản của kit Halosperm.............................................30

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng biểu
Bảng 2.1. So sánh quy trình xét nghiệm của kit Halosperm và kit
tự pha
Bảng 2.2. Bảng quy ước xác định độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm
Bảng 3.1. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch agarose
Bảng 3.2. So sánh kết quả giữa các thể tích thạch agarose
Bảng 3.3. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch phủ lam kính
Bảng 3.4. So sánh kết quả giữa các loại lam kính
Bảng 3.5. So sánh DFI giữa các dung dịch biến tính
Bảng 3.6. So sánh DFI giữa các dung dịch ly giải
Bảng 3.7. Giá trị đánh giá độ lặp lại của kit tự pha
Bảng 3.8. Bảng sơ bộ xác định độ nhạy của bộ xét nghiệm
Bảng 3.9. Bảng kết quả xác định độ nhạy của bộ xét nghiệm
Bảng 3.10. Các giá trị đánh giá độ đặc hiệu của kit tự pha

Trang
19 - 20
26
28
28
28
29
29
29 - 30
30
31
32
32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vô sinh là một vấn đề sức khỏe sinh sản cấp thiết và đang có xu hướng
gia tăng trong xã hội hiện nay. Theo thống kê của Hiệp hội Tiết niệu Châu Âu,
có khoảng 15% cặp vợ chồng vô sinh và 42,6% trong số kể trên được tìm thấy
nguyên nhân do nam giới [1]. Còn tại Việt Nam, một nghiên cứu phối hợp
giữa Bệnh viện Phụ sản Trung ương và Đại học Y Hà Nội cho thấy tỷ lệ vô
sinh năm 2009 ở mức khoảng 7,7%; vô sinh nam và vô sinh nữ có tỷ lệ tương
đương nhau [2].
Các kết quả trên cho thấy nam giới có vai trò không kém nữ giới trong
vấn đề chẩn đoán và điều trị vô sinh. Để chẩn đoán vô sinh nam thì tinh dịch
đồ là xét nghiệm thường quy. Tuy nhiên, xét nghiệm này chỉ cho phép đánh
giá được tình trạng tinh dịch và tinh trùng. Muốn chẩn đoán được chính xác
nguyên nhân làm giảm số lượng và chất lượng tinh trùng, bệnh nhân nam giới
vô sinh cần được làm thêm nhiều xét nghiệm khác, trong đó có xét nghiệm
đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng. Đây là một xét nghiệm rất quan
trọng, đã được ứng dụng từ lâu và cho thấy được vai trò của nó trong chẩn
đoán vô sinh nam.
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều cơ sở sản xuất bộ kit xét nghiệm xác
định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng, tuy nhiên ở Việt Nam chưa có bộ kit
riêng. Tất cả bệnh nhân muốn làm xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đều
phải sử dụng bộ kit nhập ngoại với giá thành khá cao. Để hạn chế nhược điểm
này, góp phần đưa xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đến gần hơn với bệnh
nhân, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Hoàn thiện quy trình pha chế
bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ứng dụng chẩn
đoán vô sinh nam" với các mục tiêu sau:

2

1. Hoàn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt
gãy DNA tinh trùng.
2. So sánh kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới
vô sinh bằng bộ xét nghiệm tự pha với bộ kit thương mại Halosperm.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm vô sinh và vô sinh nam
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng trong
độ tuổi sinh sản, có sinh hoạt tình dục đều đặn 2 - 3 lần trong một tuần và
không dùng bất kỳ biện pháp tránh thai nào, tuy nhiên sau 1 năm mà người vợ
vẫn chưa thể có thai [1].
Vô sinh được chia làm 2 loại: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát.
Vô sinh nguyên phát là trường hợp cặp vợ chồng chưa từng có thai (vô sinh
I). Vô sinh thứ phát là trường hợp cặp vợ chồng đã từng có thai ít nhất 1 lần,
nay không thể có thai nữa (vô sinh II) [1].
Phân loại theo nguyên nhân, vô sinh có thể đến từ người nam, người nữ
hoặc do cả hai. Vô sinh nam là trường hợp xác định nguyên nhân do người
chồng [1].
1.2. Tình hình vô sinh hiện nay
1.2.1. Tình hình vô sinh trên thế giới
Trong nghiên cứu của WHO kéo dài từ năm 1994 đến năm 2000, tại
Trung và Đông Á là khu vực có tỷ lệ vô sinh nam thấp nhất (2,05 - 3,07%).
Các trường hợp vô sinh do cả nam và nữ là 3,79%, và chỉ do yếu tố nữ là

5,1% [3].
Theo Hiệp hội Tiết niệu Châu Âu, tính đến tháng 3 năm 2016 có khoảng
15% cặp vợ chồng không có con và đang tìm kiếm các phương pháp điều trị
vô sinh. Cứ chín cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh có một cặp gặp vấn đề về
sinh con đầu tiên (vô sinh I) và cứ sáu cặp vợ chồng thì có một cặp vợ chồng
gặp khó khăn trong lần sinh con tiếp theo (vô sinh II). Trong số 50% các cặp
vô sinh trên, người ta đã xác định được nguyên nhân do bất thường ở các chỉ
số tinh dịch của nam giới [1].


4

Một công bố của Agarwal A. (2015), trên thế giới có khoảng 48,5 triệu
cặp vợ chồng vô sinh, chiếm tỷ lệ khoảng 15%. Thêm vào đó, tỷ lệ vô sinh
nam ở các quốc gia trên thế giới dao động từ 2,5 - 12%, cao nhất ở Trung và
Đông Âu (8 - 12%) và Châu Úc (8 - 9%) [3].
Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ ước tính, tỷ lệ vô sinh ở nam
giới nước này là 9,4% [3].
Nghiên cứu của Mehra B. L. (2018) ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ nam giới vô
sinh lên tới 45% [4].
1.2.2. Tình hình vô sinh tại Việt Nam
Theo nghiên cứu của Nguyễn Viết Tiến (2009) thực hiện trên 14.936 cặp
vợ chồng trong độ tuổi 15 - 49 ở 8 tỉnh với 8 vùng sinh thái khác nhau, tỉ lệ vô
sinh chung trên toàn quốc hiện ở mức 7,7%, trong đó vô sinh nguyên phát là
3,9% và vô sinh thứ phát là 3,8%. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỉ lệ vô sinh
cao nhất ở Khánh Hoà (13,9%) và thấp nhất là Hải Phòng (3,8%) [2].
Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Lê Văn Vệ (2009) cho biết tỉ lệ
vô sinh do nguyên nhân hoàn toàn từ phía người chồng là khoảng 40,8%, từ
cả 2 phía là 10,3% và còn 11,5% chưa rõ nguyên nhân [5].
1.3. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng

1.3.1. Khái niệm đứt gãy DNA tinh trùng
Đứt gãy DNA là sự tổn thương một hoặc hai mạch của phân tử DNA,
đây là sự tách rời hoặc phá vỡ các sợi DNA thành từng mẩu nhỏ, có thể xảy ra
với cả DNA trong nhân và DNA của ty thể tinh trùng. Đứt gãy DNA tinh
trùng cũng giống như với các tế bào khác, đó là sự tích tụ dần dần ảnh hưởng
do các tác nhân bên trong cũng như bên ngoài cơ thể. Tuy nhiên, DNA tinh
trùng có cơ chế tự sửa chữa kém và do đó đứt gãy DNA tinh trùng có ảnh
hưởng lớn tới chất lượng tinh trùng [6], [7].


5

1.3.2. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng
Đứt gãy DNA tinh trùng do nhiều nguyên nhân gây ra như: rối loạn quá
trình sản sinh tinh trùng, tác động của các chất oxi hóa trong và ngoài cơ thể,
giãn tĩnh mạch tinh, nhiễm khuẩn đường sinh dục - tiết niệu, ảnh hưởng từ các
điều kiện hóa - lý của môi trường... Các nguyên nhân trên được phân loại
thành 6 cơ chế chính, có thể xảy ra trong quá trình sản xuất hoặc vận chuyển
tinh trùng, xuất hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau gây nên đứt gãy DNA
tinh trùng [8]. Các cơ chế này được mô tả trong hình 1.1 như sau:

Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng [8].
(i) Rối loạn quá trình chết theo chương trình trong sản xuất tinh trùng.
(ii) Quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng không hoàn chỉnh.
(iii) Tác động bởi các chất oxy hóa trong quá trình vận chuyển tinh trùng
sau tinh hoàn.
(iv) Tác động của caspase nội sinh và enzym endonuclease.
(v) Tác động của tia xạ và hóa chất.
(vi) Tác động của chất độc trong môi trường.

6

1.3.2.1. Rối loạn quá trình chết theo chương trình trong sản xuất tinh trùng
Trong quá trình sản sinh tinh trùng, cơ chế loại bỏ tế bào mầm bất
thường được điều chỉnh bởi tế bào Sertoli. Có 50 - 60% tế bào bất thường
được loại bỏ theo cơ chế này. Ban đầu, các tế bào mầm bất thường được nhận
biết, đánh dấu và sau đó bị thực bào bởi tế bào Sertoli [6], [8], [9], [10].
Khi cơ chế trên bị rối loạn, các tế bào mầm bất thường không được tiêu
diệt, tạo ra tinh trùng có DNA bất thường trong tinh dịch người bệnh. Hậu quả
của sự rối loạn này, gây ra sự thay đổi chất lượng DNA giữa tế bào mầm và tế
bào tinh trùng qua quá trình phân chia và biệt hóa. Do vậy, hình thái tinh
trùng có hình thái bình thường thì không có nghĩa là chất lượng DNA tinh
trùng đó cũng bình thường [6], [8], [10].
Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng ở bệnh nhân nam giới có
oligospermia - ít tinh trùng - thì xác suất một tinh trùng có hình thái bình
thường nhưng DNA đứt gãy cao hơn rất nhiều so với nam giới có số lượng
tinh trùng bình thường. Từ đó có thể kết luận có mối liên quan giữa sự toàn
vẹn của DNA tinh trùng và sự trưởng thành, biệt hóa của tinh trùng đó [8].
1.3.2.2. Quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng không hoàn chỉnh
Sự rối loạn quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng có thể là nguyên
nhân dẫn đến sự đứt gãy DNA tinh trùng. Chất nhiễm sắc chứa trong hạt nhân
tinh trùng con người nói riêng và động vật có vú nói chung là một cấu trúc
cực kỳ nhỏ gọn và ổn định. DNA tinh trùng phải được tổ chức một cách đặc
biệt, khác biệt đáng kể so với các tế bào soma, để đạt được trạng thái ngưng tụ
này. Tác giả Ward L. (1997) đã đề nghị một mô hình DNA tinh trùng trong đó
cấu trúc DNA tinh trùng ban đầu bị phá vỡ, các protein histon sẽ được thay
thế bằng protamin [11]. Do đó, trong quá trình trưởng thành, sự phá vỡ cấu
trúc DNA tinh trùng là hoàn toàn cần thiết, tuy nhiên các vết nứt từ quá trình
này nếu không được phục hồi có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng sau này.

7

Cơ chế này thường xảy ra ở thời kỳ tiền tinh trùng và làm tinh trùng dễ tổn
thương hơn trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn [8], [12], [13], [14].

Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997) [11].
1.3.2.3. Đứt gãy DNA tinh trùng trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn
Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ đứt gãy DNA của tinh trùng
sau xuất tinh cao hơn nhiều so với tinh trùng trong tinh hoàn. Chính bản thân
tinh trùng chưa trưởng thành sản xuất ra một hàm lượng gốc oxi tự do cao, có
thể gây tổn thương DNA ở tinh trùng trưởng thành. Ảnh hưởng của các gốc
oxi tự do này tác động lên tinh trùng chủ yếu trong quá trình vận chuyển sau
tinh hoàn. Vì mặc dù thời gian bán hủy của các gốc oxi tự do rất ngắn, chỉ từ
nano giây đến micro giây, nhưng sự tiếp xúc giữa tinh trùng chưa trưởng
thành và tinh trùng trưởng thành trong ống dẫn tinh và mào tinh đã tạo điều
kiện cho DNA tinh trùng cảm ứng với các gốc oxi tự do [8], [9], [15], [16].


8

1.3.2.4. Tác động của caspase nội sinh và enzym endonuclease
Caspase (cysteine - aspartic protease) là enzym đóng vai trò quan trọng
trong quá trình chết tế bào theo chương trình. Endonuclease là enzym giới
hạn, phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không
gây tổn hại đến bases. Sự hoạt hóa enzym caspase và endonuclease bởi các
gốc oxi tự do và các yếu tố lý hóa cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng
[8], [15], [17].
1.3.2.5. Tác động của tia xạ và hóa chất

Việc tiếp xúc với tia xạ và hóa chất cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh
trùng. Các phương pháp điều trị ung thư được cho là có ảnh hưởng bất lợi đến
khả năng sinh sản nam và làm giảm số lượng tinh trùng, phát sinh từ các tác
dụng độc tế bào của hóa trị hoặc xạ trị trên biểu mô tinh trùng [8], [18]. Một
nghiên cứu của O’Flaherty cho thấy rằng sự toàn vẹn của DNA tinh trùng bị
ảnh hưởng ở bệnh nhân ung thư tinh hoàn và u lympho Hodgkin sau khi hóa
trị [19].
1.3.2.6. Tác động của chất độc trong môi trường
Nam giới sống trong môi trường có ô nhiễm không khí, nguồn nước... có
tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao hơn do có sự phơi nhiễm với các chất độc
trong môi trường. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng càng tăng khi thời gian phơi
nhiễm càng kéo dài [8].
1.3.3. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở
nam giới
Theo Sheena Lewis (2013), 80% số cặp vợ chồng vô sinh không rõ
nguyên nhân là do chất lượng tinh trùng quá yếu hay đứt gãy DNA tinh trùng.
Khi DNA đứt gãy tại những vị trí chứa gen liên quan đến khả năng sinh sản


9

hay sự phát triển, làm tổ của phôi thì khả năng có con rất thấp. Khoảng 25%
bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA cao [20].
Có 3 mức độ đứt gãy DNA tinh trùng:
- DFI < 15% là tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp.
- DFI 15 – 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng trung bình.
- DFI > 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao [21].
Erenpreiss J. (2006) nhận thấy tỷ lệ có thai tự nhiên gần như bằng không
ở nam giới có DFI > 30% [22].
Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 bệnh nhân vô sinh

nam cho thấy DFI trung bình là 34,0 ± 24,9%, trong đó 79% bệnh nhân có
DFI >15% [23].
- Mối liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ
Nghiên cứu của Utsuno H. (2013) đã chứng minh đứt gãy DNA có liên
quan đến hình thái bất thường của tinh trùng [24].
Cassuto N.G. (2012) phân tích 10.400 tinh trùng của 26 bệnh nhân và
thấy tồn tại mối tương quan thuận giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các thông
số bất thường hình thái tinh trùng [25].
Irvine (2000) cũng nhận định các thông số tinh dịch, đặc biệt là mật độ
tinh trùng có mối tương quan nghịch với tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng [26].
Tuy nhiên, nghiên cứu của Nasrin Sheikh (2008) cho rằng ở nhóm bệnh
nhân vô sinh có mối tương quan nghịch rõ giữa tỷ lệ đứt gãy DNA với khả
năng di động của tinh trùng. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cũng tương quan
nghịch với hình thái bình thường của tinh trùng nhưng không có tương quan
đáng kể với mật độ tinh trùng [27].
Tại Việt Nam, Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 nam
giới vô sinh cho thấy có sự khác biệt về DFI có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm
bệnh nhân có tinh dịch đồ bình thường và bất thường. Cụ thể có mối tương


10

quan nghịch giữa tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng và tỷ lệ di động tiến tới, vận
tốc trung bình, đồng thời có mối tương quan thuận với bất thường hình thái
tinh trùng. Tuy nhiên các mối tương quan này chỉ ở mức thấp [23].
Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Thị Thuý An và cộng sự (2014) nghiên cứu
trên 29 mẫu tinh dịch kết luận tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng tương quan
nghịch với mật độ, tỷ lệ di động tiến tới, tỷ lệ sống và tỷ lệ hình thái bình
thường của tinh trùng [28].
- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng với thất bại của hỗ trợ sinh sản

Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng của bệnh nhân càng cao thì khả năng thụ
thai sau các chu trình hỗ trợ sinh sản càng thấp. Khi DFI > 20%, khả năng
sinh sản của nam giới giảm. Khi DFI > 30%, cơ hội để thụ tinh tự nhiên, thụ
tinh nhân tạo (IVF) hoặc bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) gần như
bằng không, thay vào đó nên lựa chọn phương pháp tiêm tinh trùng vào bào
tương trứng (ICSI) [29].
Qua nghiên cứu, Avendano và cộng sự (2009) nhận thấy tinh trùng di
động tốt và có tỷ lệ hình thái bình thường cao vẫn có nhiều khả năng bị đứt
gãy DNA, đồng thời phát hiện tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường nhưng bị
đứt gãy DNA có mối tương quan nghịch với kết quả thụ thai sau ICSI cũng
như chất lượng phôi [30].
Virro M.R và cộng sự (2004) cho rằng nam giới có DFI > 30% khi thực
hiện hỗ trợ sinh sản có khả năng tạo phôi thấp và có tỷ lệ thất bại cao khi làm
IUI/IVF [31].
Như vậy, DFI có giá trị cao dự đoán vô sinh nam cũng như tỷ lệ thành
công của các phương pháp hỗ trợ sinh sản. Tuy nhiên, việc xác định khả năng
sinh sản của nam giới lại đang được đánh giá chủ yếu bởi những chỉ số trong
tinh dịch đồ như hình thái tinh trùng, mật độ, độ di động… ở hầu hết các bệnh
viện và trung tâm hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam. Điều này giải thích vì sao


11

bệnh nhân với kết quả tinh dịch đồ bình thường vẫn có khả năng vô sinh cũng
như tỷ lệ có thai sau điều trị còn thấp.
- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng đến giãn tĩnh mạch tinh ở nam giới
A. Zini (2011) cho rằng giãn tĩnh mạch tinh có liên quan đến tỷ lệ đứt gãy
DNA tinh trùng ở nam giới. Bệnh lý này được cho là nguyên nhân dẫn đến tăng
nhiệt độ ở tinh hoàn, gây xơ hóa tĩnh mạch tinh và teo nhỏ tinh hoàn, gia tăng
stress oxi hóa thứ phát, ảnh hưởng đến chất lượng DNA tinh trùng [32].

C. G. Blumer và cộng sự (2008) đã tiến hành khảo sát trên 16 bệnh nhân
nam giới được chẩn đoán giãn tĩnh mạch tinh độ II và độ III và nhóm chứng.
Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các chỉ số về tinh dịch đồ giữa
nhóm bệnh và nhóm chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng ở nhóm
bệnh tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [33].
R. P. Bertolla và cộng sự trong một nghiên cứu năm 2006 cũng đồng ý
khi cho rằng không có sự khác biệt về tinh dịch đồ trên bệnh nhân giãn tĩnh
mạch tinh, tuy nhiên tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng lại tăng cao ở nhóm bệnh
nhân này. Từ các kết luận trên, các tác giả đề nghị tăng tỷ lệ đứt gãy DNA tinh
trùng là một yếu tố để hướng đến chẩn đoán và theo dõi điều trị giãn tĩnh
mạch tinh [34].
- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới với sảy thai, thai lưu
Calini T. và cộng sự (2017) nghiên cứu trên 112 cặp vợ chồng có tiền sử
sảy thai nhiều lần nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa tỷ lệ đứt gãy DNA
tinh trùng của nam giới trong nhóm nghiên cứu với nhóm chứng. Chỉ số DFI
có mối tương quan tỷ lệ thuận với tuổi của nam giới và số lần sảy thai. Tuy
nhiên chưa thể khẳng định chắc chắn đứt gãy DNA tinh trùng là nguyên nhân
của sảy thai hay thai lưu tái diễn [35].


12

Phạm Thị Xuân (2016) đã đánh giá trên152 cặp vợ chồng có tiền sử sẩy
thai, thai lưu cho thấy 79,3% mẫu tinh dịch của người chồng có DFI > 15%.
Nhóm sẩy thai > 2 lần có 100% trường hợp tỷ lệ đứt gãy DNA trung bình
hoặc cao. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng tỷ lệ thuận với số lần sẩy thai, thai
lưu và tăng theo tuổi của bệnh nhân [36].
Một nghiên cứu của Robinson L. và cộng sự (2012) trên 2969 cặp vợ chồng
kết luận: ở nhóm nam giới có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao thì tỷ lệ sảy thai
cao gấp 3,94 lần so với nhóm có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp [37].

1.4. Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng trên thế giới
1.4.1. Phương pháp sử dụng các probe thuộc cấu trúc chất nhiễm sắc
1.4.1.1. Acridine Orange test (AOT) - phương pháp sử dụng chất nhuộm
acridine orange
- Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của acridine orange từ màu
xanh (khi liên kết với DNA mạch đôi, không bị biến tính) sang màu đỏ (khi liên
kết với DNA mạch đơn bị biến tính hoặc DNA đứt gãy mạch đơn) [38], [39].
- Ưu điểm: giá rẻ, thao tác đơn giản.
- Nhược điểm: Tín hiệu huỳnh quang nhanh mất màu [39].
1.4.1.2. Sperm chromatin Structure Assay (SCSA) - phương pháp khảo sát
cấu trúc chromatin tinh trùng
- Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này tương tự AOT [39].
- Ưu điểm: Có thể định lượng tinh trùng bị đứt gãy DNA hoặc có nhiễm
sắc chất đóng gói chưa hoàn chỉnh, giá rẻ, thao tác đơn giản, được phổ biến
rộng rãi [39].
- Nhược điểm: Máy đo dòng tế bào và phần mềm đọc kết quả chuyên
dụng đắt tiền [39].


13

1.4.1.3. Toluidine blue (TB) - phương pháp sử dụng chất nhuộm toluidine
blue
- Nguyên tắc: Khi toluidine blue gắn vào vùng giàu lysine của histone
(tinh trùng chưa trưởng thành) sẽ tạo màu tím đậm, còn khi gắn kết với
protamine toluidine tạo màu xanh nhạt.
- Ưu điểm: giá rẻ, thao tác đơn giản.
- Nhược điểm: thiết bị đắt tiền, kết quả mang tính chủ quan cao [39].
1.4.2. Các phương pháp phát hiện trực tiếp tinh trùng có DNA bị đứt gẫy
1.4.2.1. Terminal deoxynucleotidyl tranferase mediated dUTP nick end

labeling assay (TUNEL) - phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các
dUTP được xúc tác bởi enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase
- Nguyên tắc: Phương pháp TUNEL định lượng sự gắn kết của dUTP tại
các mạch đôi hoặc mạch đơn DNA bị đứt gãy trong phản ứng được xúc tác
bởi enzyme TdT (terminal deoxynucleotidyl tranferase) [38], [40], [41].
- Ưu điểm: Có tính nhạy cao với trường hợp đứt gãy DNA mạch đôi và
mạch đơn.
- Nhược điểm: Cần trang thiết bị đắt tiền, độ đặc hiệu thấp [38].
1.4.2.2. Phương pháp điện di tế bào đơn (single-cell gel electrophoresis) hay
phương pháp COMET
- Nguyên tắc: Điện di tế bào đơn để xác định tỷ lệ và mức độ đứt gẫy
DNA tinh trùng. Hình ảnh tinh trùng bị đứt gẫy DNA thu được dưới kính hiển
vi huỳnh quang có dạng giống hình sao chổi (comet) nên còn được gọi là
phương pháp Comet [42], [43].
- Ưu điểm: độ nhạy cao.
- Nhược điểm: Tốn nhiều thời gian cho việc phân tích kết quả hình ảnh.


14
a) Alkaline COMET assay (pH  12) - phương pháp điện di tế bào đơn
trong môi trường kiềm: Độ nhạy cao, đặc hiệu sự đứt gãy DNA mạch đơn.
b) Neutral COMET assay (pH  9) - phương pháp điện di tế bào đơn
trong môi trường trung tính: Đặc hiệu với đứt gãy DNA mạch đôi
c) 2T - COMET assay: Kết hợp hai phương pháp Alkaline COMET và
Neutral COMET. Đồng thời phát hiện và phân biệt đứt gãy DNA mạch đơn và
mạch đôi trên cùng một cá thể tế bào [43].
1.4.3. Các phương pháp kiểm tra tính ổn định của chất nền nhân tế bào
tinh trùng
1.4.3.1. Phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng
(Sperm chromatin dispersion test - SCD)

- Nguyên tắc: Mẫu tinh dịch được cố định trên gel agarose và xử lý bằng
dung dịch acid và muối để loại bỏ các protein nhân. Khi đó DNA của tinh
trùng không bị đứt gẫy sẽ tạo quầng sáng xung quanh lõi nhân tinh trùng khi
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Ngược lại, các tế bào có DNA đứt
gẫy sẽ không tạo quầng sáng [43].
- Ưu điểm: Giá thành rẻ, thao tác đơn giản.
- Nhược điểm: Kết quả quan sát mang tính chủ quan [43].


15

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu tinh dịch của bệnh nhân nam được chẩn đoán vô sinh tại Bệnh
viện Đại học Y Hà Nội, làm xét nghiệm đánh giá độ đứt gãy DNA tinh trùng
tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- Bệnh nhân nam giới từ 18 tuổi.
- Bệnh nhân đã được chẩn đoán vô sinh.
- Xét nghiệm tinh dịch đồ có mật độ tinh trùng trên 1 triệu/ml.
- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân nam giới dưới 18 tuổi.
- Tinh dịch đồ của bệnh nhân có mật độ dưới 1 triệu/ml.
- Nam giới bị các bệnh ung thư bộ phận sinh dục.
- Nam giới bị nhiễm HIV.
- Nam giới đang mắc bệnh tâm thần.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thu thập mẫu từ tháng 8/2018 đến tháng 6/2019.
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm tư vấn di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.