ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH cầu TINH DỊCH và mối LIÊN QUAN GIỮA BẠCH cầu với một số CHỈ số TINH DỊCH đồ ở NAM GIỚI vô SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU
TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA
BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ
Ở NAM GIỚI VÔ SINH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU
TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA
BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ
Ở NAM GIỚI VÔ SINH

Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền
Mã số

:
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
TS.BS. Đoàn Thị Kim Phượng
HÀ NỘI - 2018


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3
1.1. Sự hình thành và biệt hóa tinh trùng.......................................................3
1.1.1. Đại cương về quá trình hình thành tinh trùng ở người.........................3
1.1.2. Quá trình sinh tinh tại tinh hoàn................................................................4
1.1.3. Sự thuần thục của tinh trùng tại mào tinh hoàn.....................................7
1.2. Các loại tế bào trong tinh dịch................................................................8
1.2.1. Tế bào sinh tinh..............................................................................................8
1.2.2. Tế bào không sinh tinh...............................................................................10
1.3. Các phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch...........................12
1.3.1. Phương pháp nhuộm esterase ..................................................................12
1.3.2. Phương pháp nhuộm elastase ..................................................................12
1.3.3. Phương pháp nhuộm peroxidase .............................................................13
1.3.4. Phương pháp đo gốc tự do oxy hóa của BC tinh dịch bằng
Chemiluminescence...................................................................................13
1.3.5. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch BC bằng kháng thể đơn
dòng...............................................................................................................14
1.4. Các nghiên cứu trong nước và thế giới về bạch cầu trong tinh dịch.....14
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................15
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................15

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu......................................................................................15
2.2.2. Các quy trình kỹ thuật................................................................................17
2.2.3. Phương pháp thu thập thông tin...............................................................18
2.3. Phân tích xử lý số liệu...........................................................................18
2.4. Sai số và cách khống chế:.....................................................................18
2.4.1. Sai số...............................................................................................................18
2.4.2. Cách khắc phục............................................................................................19
2.5. Đạo đức nghiên cứu..............................................................................19


Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ....................................................................20
3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu..........................................20
3.2. Số lượng bạch cầu trong tinh dịch........................................................21
3.3. Mối liên quan giữa bạch cầu với số lượng, hình thái, độ di động tinh
trùng......................................................................................................22
3.3.1. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng...........22
3.3.2. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng...........22
3.3.3. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng.......23
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN.................................................................24
4.1. Phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch bằng phương pháp
nhuộm peroxidase.................................................................................24
4.2. Ti lệ mẫu có số lượng BC cao tong tinh dịch........................................24
4.3. Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với số lượng,
hình thái, độ di động tinh trùng.............................................................24
KẾT LUẬN.....................................................................................................25
KIẾN NGHỊ....................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BC

: Bạch cầu

KHV

: Kính hiên vi

PMN

: Polymorphonuclear leukocytes

WHO

: World Health Organization


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Tỉ lệ phần trăm số mẫu có số lượng “tế bào khác” cao trong tinh dịch.....21
Bảng 3.2: Tỉ lệ phần trăm số mẫu số lượng bạch cầu cao trong tinh dịch......21

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ vô sinh I theo thời gian.......................................................20
Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ vô sinh II theo thời gian.....................................................20
Biểu đồ 3.3: Biểu hiện lâm sàng viêm đường sinh dục tiết niệu.....................21
Biểu đồ 3.4. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng.....22
Biểu đồ 3.5. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng.....22
Biểu đồ 3.6. Tương quan giữa số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng..23

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Quá trình hoàn thiện tinh trùng.........................................................7
Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành........................................................9


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh dịch đồ là một trong những xét nghiệm cơ bản nhất đánh giá chức
năng sinh sản của nam giới trong độ tuổi sinh sản. Hiện nay, có khá nhiều xét
nghiệm chức năng sinh sản nam đã được triển khai như: tinh dịch đồ, tìm tinh
trùng trong nước tiểu, mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch…Trong đó tinh
dịch đồ là xét nghiệm đầu tay và phổ biến nhất chứa đựng nhiều chỉ số quan
trọng trước khi người bác sĩ đưa ra một chỉ định tiếp theo đối với những
trường hợp có bất thường trong kết quả tinh dịch đồ[1][2]. Trong tinh dịch
người, ngoài tinh trùng trưởng thành còn có các loại tế bào như tế bào bong,
tinh trùng non, bạch cầu. Các tế bào này được gọi chung là các “tế bào khác”,
hay “tế bào tròn” để phân biệt với các tinh trùng trưởng thành. Số lượng tế
bào khác trong tinh dịch bình thường cho phép dưới 1 triệu/ml [3]. Khi các tê
bào này tăng quá mức cho phép, dù là bạch cầu hay tinh trùng non đề là một
trong các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới. Tuy nhiên, với phương pháp
nhuộm thông thường như Giemsa hay Papanicolau dưới KHV quang học
không thể phân biệt được không thể phân biệt được từng loại tế bào trên. Đặc
biệt bạch cầu trong tinh dịch cần được phân biệt với các loại tế bào còn lại để
định hướng chẩn đoán và điều trị những trường hợp viêm nhiễm đường sinh
dục tiết niệu. Ngược lại, tinh dịch chứa nhiều tế bào tinh trùng non thường là
dấu hiệu của bệnh lý tổn thương tinh hoàn, hoặc quá trình biệt hóa tinh trùng
chưa hoàn chỉnh. Việc phân loại các tế bào nhiều quá mức trong tinh dịch là tế
bào sinh tinh non hay bạch cầu có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và quyết

định điều trị [4] [5]. Nhận thấy sự cần thiết và tính khả thi của vấn đề trên,
góp phần chẩn đoán chính xác hơn một số tình trạng viêm nhiễm đường sinh
dục nam, hỗ trợ chức năng sinh sản nam giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu


2
đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu trong tinh dịch và mối liên
quan giữa bạch cầu và một số chỉ số tinh dịch đồ”
Mục tiêu của đề tài:
1. Phát hiện được bạch cầu trong tinh dịch bằng phương pháp nhuộm
peroxidase.
2. Phân tích mối liên quan giữa bạch cầu với số lượng, độ di động và
hình thái tinh trùng.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sự hình thành và biệt hóa tinh trùng.
1.1.1. Đại cương về quá trình hình thành tinh trùng ở người.
Tinh trùng là giao tử đực ở người mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n=23),
là loại tế bào có mức độ biệt hóa cao để thực hiện chức năng sinh sản.
Quá trình sinh tinh phụ thuộc đầu tiên vào sự phát triển của tinh hoàn
thời kì bào thai (bắt đầu vào khoảng tuần 4-6). Ở giai đoạn này, các tế bào
mầm sinh dục nguyên thủy ở gờ sinh dục bắt đầu tăng sinh, một số sẽ bị thoái
hóa, số còn lại sẽ biệt hóa thành tiền tinh nguyên bào và ngưng lại ở giai đoạn
này. Đến khoảng từ lúc sinh đến 6 tháng tuổi, các tiền tinh nguyên bào bắt đầu
biệt hóa thành tinh nguyên bào và tăng sinh. Đến lúc dậy thì, các tinh nguyên
bào bắt đầu giảm phân để tạo thành tinh bào.

Tinh trùng được sinh ra tại các ống sinh tinh trong tinh hoàn sau đó di
chuyển vào mào tinh để hoàn thành sự trưởng thành cuối cùng trước khi được
xuất tinh. Nếu không có hiện tượng phóng tinh thì các tinh trùng sẽ chết, thoái
hóa và được hấp thụ bởi tế bào biểu mô của mào tinh hoàn. Vào thời điểm
phóng tinh thì các tinh trùng di chuyển dọc theo ống dẫn theo, sau đó được
trộn lẫn với dịch của tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến hành niệu đạo và cuối cùng
được tống xuất ra ngoài theo đường niệu đạo.
Quá trình hình thành tinh trùng bắt đầu từ lúc dậy thì và tiếp diễn liên tục
cho đến lúc chết. Quá trình sinh tinh là một quá trình rất hiệu quả (mỗi ngày
có thể có 150 triệu tinh trùng được tạo ra ở mỗi tinh hoàn) trong khi đó quá
trình thụ tinh là một quá trình không hiệu quả vì có hàng trăm triệu tinh trùng
vào đường sinh dục nữ nhưng chỉ có một tinh trùng thụ tinh cho trứng để tạo
hợp tử. Do đó, nếu quá trình sinh tinh giảm sút hoặc có sự tác động của cá yếu
tố vật lý, hóa học, sinh học trong hay ngoài cơ thể thì số lượng và chất lượng


4
sẽ không đảm bảo làm cho quá trình thụ tinh bị ảnh hưởng dẫn tới thiểu năng
sinh sản [6][7][8].
1.1.2. Quá trình sinh tinh tại tinh hoàn.
Quá trình hình thành tinh trùng tại tinh hoàn thực chất là quá trình phát
triển và phân bào của các tinh nguyên bào (2n) chưa biệt hóa và không có khả
năng thụ tinh thành các tinh trùng (1n) có độ biệt hóa cao và khả năng thụ tinh
khi gặp trứng. Đây là quá trình diễn ra liên tục tại các ống sinh tinh trong tinh
hoàn của nam giới từ lúc dậy thì cho đến lúc chết.
Mỗi tinh nguyên bào đều phải trải qua 3 giai đoạn để trở thành tinh
trùng:

♦ Giai đoạn tinh nguyên bào: đây là giai đoạn các tinh nguyên bào phân
bào nguyên nhiễm để tạo thành các loại tinh nguyên bào và tinh bào I để cung

cấp cho quá trình sinh tinh.

♦

Giai đoạn tinh bào: đây là giai đoạn các tinh bào phân chia giảm

nhiễm 2 lần để tạo 4 tinh tử đơn bội.

♦

Giai đoạn tinh tử: đây là giai đoạn các tinh tử biến đổi các bộ phận

như đuôi, nhân, bộ Golgi, ti thể để biệt hóa thành tinh trùng trưởng thành
có chức năng.
Các giai đoạn này diễn ra đồng thời và liên tục trong các ống sinh tinh
của tinh hoàn, bắt đầu từ khi các tế bào mầm nguyên thủy biệt hóa thành các
tinh nguyên bào nhưng quá trình này ngừng lại cho đến tuổi dậy thì mới tiếp
tục. Ở tuổi dậy thì, mỗi ngày mỗi tinh hoàn có thể sản xuất từ 50-150 triệu
tinh trùng [9][10]. Quá trình này diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời của
người nam giới nhưng cũng bắt đầu giảm từ tuổi 40.

♦ Giai đoạn tinh nguyên bào.


5
Ở giai đoạn này, các tinh nguyên bào nằm ở phần đáy của biểu mô sinh tinh
phân bào liên tục để tạo ra nhiều thế hệ tê bào để cung cáp cho quá trình sinh
tinh. Tuy nhiên, cũng có một số tinh nguyên bào có chu kỳ rất dài, rất ít phân
chia, đóng vait rò dự trữ, cung cấp cho quá trình sinh tinh khi có sự thiếu hụt.
Ở người có 3 loại tinh nguyên bào dựa vào hình dạng:

 Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, phân chia để tạo tinh nguyên
bào loại A nhạt màu khi có sự thiếu hụt.
 Loại A nhạt màu: phân bào liên tục để tạo thành tinh nguyên bào loại B.
 Loại B: phân chia liên tục để tạo thành tinh bào I.
Sự phân bào liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo cho quá trình sinh
tinh ở nam giới được diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời.

♦ Giai đoạn tinh bào.
Ở giai đoạn này, các tinh bào I thực hiện quá trình giảm phân để tạo ra
các tinh tử. Giảm phân là quá trình đảm bảo cho sự chuyển tiếp từ tế bào
lưỡng bội (2n) thành đơn bội (n) trong quá trình sinh tinh. Trong quá trình
giảm phân có 2 hiện tượng quan trọng liên quan đến chất liệu di truyền, đó là
số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa và sự tái tổ hợp vật liệu di truyền
giữa các chromatid.
Phân bào giảm nhiễm được chia làm 2 giai đoạn:
 Giảm phân lần 1: từ tinh bào I sẽ tạo ra 2 tinh bào II, giai đoạn này
kéo dài vài ngày.
 Giảm phân lần 2: từ tinh bào II sẽ tạo ra 2 tinh tử, giai đoạn này
thường bắt đầu một thời gian ngắn sau khi giảm phân I kết thúc và
diễn ra rất nhanh trong vòng vài giờ. Do vậy, đời sống tinh bào II
thường ngắn hơn tinh bào I [4], [9].
Như vậy sau quá trình phân bào giảm nhiễm từ một tinh bào I sẽ tạo ra 4
tinh tử tương đương với số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa.

♦ Giai đoạn tinh tử.


6
Sự biệt hóa tinh tử để tạo thành tinh trùng diễn ra ngay sau khi quá trình
giảm phân kết thúc và cũng là giai đoạn cuối của quá trình sinh tinh. Sự biệt

hóa này gồm:
 Bất hoạt toàn bộ bộ gen để đảm bảo sự hoạt động hoàn toàn sau khi
thụ tinh với trứng.
 Nhiễm sắc thể được nén gọn để thu nhỏ kích thước của nhân, từ đó thu
nhỏ kích thước đầu tinh trùng tạo điều kiện cho quá trình di chuyển:
trong quá trình này, protein histon trong chromatid sẽ được thay thế
bằng protein protamin, protein này giúp sắp xếp lại các chuỗi DNA
làm cho kích thước của nhân sẽ được thu nhỏ và nằm ngay dưới màng
tinh trùng. Sau khi thụ tinh, protamin sẽ được thay thế bằng histon ở
trong tế bào trứng.
 Hình thành các cấu trúc giúp cho sự vận động của tinh trùng như đuôi
và sự loại bớt bào tương. Hiện tượng loại bớt bào tương diễn ra ở tinh
trùng trưởng thành, các túi bào tương sẽ được loại ra ngoài từ phần cổ
của tinh trùng. Khi tinh trùng được phóng thích vào ống sinh tinh thì
các túi bào tương vẫn còn tồn tại, tại mào tinh các túi bào tương sẽ
trượt dần từ cổ xuống đuôi và ra ngoài.
 Biệt hóa cấu trúc để tinh trung nhận biết được trứng và có khả năng
thụ tinh với trứng.
Kết thúc quá trình này, tinh trùng sẽ được hình thành với hình dạng và
cấu trúc ở mức độ biệt hóa cao để đảm bảo chức năng giao tử đực ở người.
Toàn bộ quá trình hình thành tinh trùng từ tinh nguyên bào đến tinh trùng
mất khoảng 70 ngày, ngoài ra để tinh trùng đảm bảo được chức năng của
mình thì phải trải qua quá trình trưởng thành cuối cùng tại mào tinh khoảng
10-24 ngày [4], [10].


7

Hình 1.1: Quá trình hoàn thiện tinh trùng
1.1.3. Sự thuần thục của tinh trùng tại mào tinh hoàn.

Trong quá trình di chuyển tại mào tinh hoàn thì tinh trùng hoàn thành
quá trình chuyển hóa cuối cùng về hình thái, sinh hóa, chuyển hóa và sinh lý:

♦ Hình thái: mất đi các túi bào tương thừa, hình thái và kích thước của
cực đầu ổn định.

♦ Sinh hóa: cấu trúc glycoprotein ở màng tinh trùng thay đổi để dễ dàng
nhận diện trứng và thực hiện các phản ứng với trứng khi gặp trứng.

♦ Chuyển hóa: tinh trùng tăng chuyển hóa và tăng vận động. Ở đầu mào
tinh hoàn tinh trùng di động yếu, không đồng bộ và không định hướng
nhưng ở cuối mào tinh, tinh trùng đã có khả năng di động nhanh và định
hướng tốt để đến được với trứng.

♦ Sinh lý: tinh trùng ở cuối mào tinh có khả năng thụ tinh cao hơn ở đầu
mào tinh.


8
Như vậy tinh trùng phải mất khoảng 10-12 tuần để hoàn thành quá trình
từ tinh nguyên bào ở ống sinh tinh đến giai đoạn trưởng thành hoàn toàn và
chuẩn bị xuất tinh ở mào tinh.
1.2. Các loại tế bào trong tinh dịch: nguồn gốc và đặc điểm của chúng
1.2.1. Tế bào sinh tinh.
 Tinh trùng trưởng thành (chiếm >90% trong tinh dịch đồ bình thường
[1], [11])

♦

Nguồn gốc: tinh trùng được tạo ra từ các tế bào sinh tinh, nằm trong

các ống sinh tinh thuộc hai tinh hoàn.

♦

Đặc điểm: một tinh trùng được coi là bình thường về hình thái khi

đầu, cổ, đoạn trung gian và đuôi tinh trùng phải nằm trong giới hạn bình
thường (WHO 1999) [11]
 Đầu: hình bầu dục hoặc hơi dẹt (khi nhìn mặt bên); dài 4-5 µm, rộng
2 µm. Khu vực chứa nhân nằm ở đoạn sau phình to, bắt màu đậm trên tiêu
bản nhuộm màu. Phía trước đầu là túi cực đầu bắt màu nhạt, chiếm 40-70%
diện tích vùng đầu. Đầu tinh trùng có thể có không bào tuy nhiên chỉ coi tinh
trùng bình thường khi không bào ≤ 20% vùng đầu.
 Cổ: là đoạn ngắn, hẹp, gắn thẳng với trục đầu.
 Đoạn trung gian: tiếp nối với đoạn cổ, khoảng 1 µm, có bao ti thể. Cổ
vả đoạn trung gian được định ranh giới với đuôi bởi vòng Zensen, đây là nơi
màng bào tương dày lên. Chiều dài cổ và đoạn trung gian gấp 1,5 lần chiều
dài đầu.
 Đuôi: gồm 2 đoạn là đoạn chính và đoạn cuối. Đoạn chính dài khoảng
45 µm, thẳng, thon, nhỏ hơn phần cổ, không cuộn. Đuôi có một dây trục nằm ở
trung tâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào. Ở đoạn
cuối, đuôi vuốt nhỏ lại chỉ còn dây trục ở giữa và bọc ngoài bởi màng tế bào.


9
Tinh trùng có thể có bào tương, thường nằm ở phần cổ và đoạn trung
gian, cũng có khi ở phần đuôi.. Diện tích bào thương thường < 1/3 diện tích
đầu. Tinh trùng bình thường có chiều dàu từ 50-60 µm.

Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành
 Các tế bào dòng tinh khác

♦ Tinh nguyên bào: là tế bào đầu dòng tinh, kích thước nhỏ (9-15 µm),
nằm sát màng đáy biểu mô tinh, ở ngăn ngoài của biểu mô tinh.

♦ Tinh bào 1: là tế bào lớn, đường kính khoảng 25 µm, cách màng đáy
bởi một hàng tinh nguyên bào, có bội NST 2n. Tinh bào 1 có nhân hình
cầu, các bào quan khác khá phong phú.

♦ Tinh bào 2: có kích thước nhỏ, gồm 2 loại: một loại mang NST X và
một loại mang NST Y. Trên tiêu bản mô học của tinh hoàn hầu như
không tìm thấy tinh bào 2 bởi tinh bào 2 ngay sau hình thành đã bước
vào lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân để tạo tiền tinh trùng.

♦ Tiền tinh trùng (tinh tử): nằm gần lòng ống sinh tinh, có hình hơi dài,
nhân sáng, bào tương có các bào quan: bộ Golgi, ti thể. Tiền tinh trùng


10
qua một quá trình biệt hóa phức tạp để tạo thành tinh trùng (quá trình này
gồm 4 giai đoạn, xảy ra khi các tiền tinh trùng đang được vùi trong các
khoảng trống ở mặt tự do phía lòng ống sinh tinh của các tế bào Sertoli).
Các tế bào dòng tinh này hiếm khi xuất hiện trong tinh dịch đã xuất tinh
trừ một số trường hợp bất thường.
1.2.2. Tế bào không sinh tinh (tế bào tròn_round cell)
Bạch cầu (WBC)

♦ Nguồn gốc: huy động từ máu ngoại vi đến hoặc từ các mô lân cận.
♦ Đặc điểm: có 5 loại tế bào bạch cầu: bạch cầu ưa kiềm, ưa acid, trung

tính, mono và BC lympho kích thước đa dạng từ 5-20 µm. bạch cầu có
hình tròn hoặc bầu dục dễ nhầm với tinh tử khi quan sát bằng mắt
thường.
 Tế bào mầm chưa trưởng thành (immature germ cells)

♦ Nguồn gốc
Tế bào mầm sinh dục được sinh ra từ các tế bào biểu mô sinh tinh của
ống sinh tinh. Đa phần là các tinh tử tròn và tinh bào, hiếm khi là tinh
nguyên bào. Chúng phải trải qua các giai đoạn phát triển khác nhau trước
khi đi đến mào tinh hoàn thiện chuẩn bị đầy đủ nhất về cấu tạo và chức
năng tìm và thụ tinh với trứng. Vì một nguyên nhân nào đó, các tế bào mầm
chưa trưởng thành được phóng thích sớm trước khi nó có đủ khả năng thụ
tinh với trứng, sẽ xuất hiện trong mẫu tinh dịch, có thể quan sát được dưới
kính hiển vi điện tử.

♦ Đặc điểm: tinh tử và tinh bào có thể phân biệt được với bạch cầu trong
phiến phết nhuộm tinh dịch bằng quy trình Papanicolaou [12]. Việc xác
định có thể dựa trên màu thuốc nhuộm, kích thước nhân và hình dạng, sự
thiếu peroxidase nội bào và không có kháng nguyên bạch cầu đặc hiệu.


11
Tinh tử nhiều nhân có thể nhầm lẫn về mặt hình dạng với bạch cầu hạt
nhưng bắt màu hồng nhạt,t rái với màu hơi xanh của bạch cầu hạt [12]. Tinh
tử tròn có thể được xác định bằng các thuốc nhuộm chuyên biệt cho vùng
cực đầu đang phát triển [13] lectin hay các kháng thể đặc hiệu [14], [15].
Kích thước nhân cũng có thể giúp cho việc xác định: tinh nguyên bào (rất
hiếm khi thấy trong tinh dịch) có nhân xấp xỉ 8µm, tinh bào có nhân xấp xỉ
10µm, và tinh tử có nhân xấp xỉ 5µm. Những kích thướ này chỉ là tương đối
vì sự thoái hóa và giai đoạn phân chia có thể ảnh hưởng lên kích thước của

nhân.
 Tế bào biểu mô

♦ Nguồn gốc
Là các tế bào biểu mô vảy của các ống bài tiết và các tế bào biêu mô từ
các túi tinh

♦ Đặc điểm
Tế bào biểu mô vảy từ biểu mô bề ngoài của ống bài tiết có liên quan
đến sự xuất hiện của vi khuẩn và viêm.
Tế bào biểu mô từ các túi tinh chứa sắc tố màu vàng trong tế bào chất
của chúng, cũng được thấy sau khi nhuộm bằng kỹ thuật Papanicolaou, có thể
được tìm thấy với số lượng lớn tong viêm túi tinh mạc, đôi khi kết hợp với
các hạt sắc tốt trong huyết tương tinh dịch.
1.3. Các phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch[16]
Có 2 phương pháp giúp phát hiện các tế bào khác (tế bào không sinh tinh
non sperm cells) đang được sử dụng là phương pháp nhuộm tế bào học và
phương pháp xét nghiệm miễn dịch.


12
Trong đó phương pháp nhuộm tế bào phát hiện hoạt tính enzym từ các
quần thế bạch cầu được khuyến cáo cho việc phát hiện bạch cầu trong tinh
dịch[16][17].
1.3.1. Phương pháp nhuộm esterase (Leukocyte esterase)

♦

Nguyên lý: phát hiện hoạt động của emnzym ngoại bào của bạch

cầu dựa trên sự phân cắt của nhóm indoxyl ester bởi enzym esterase của
bạch cầu tạo ra màu xanh chàm (Cytur test, Boehringer Mannheium, Ger
many)

♦ Ưu điểm: Dễ thực hiện, nhanh và không quá tốn kém.
♦ Nhược điểm: kết quả không tương thích với các phương pháp nhuộm
BC trong tinh dịch khác như phương pháp nhuộm peroxidase. Ngày nay
không được khuyến cáo dùng để phát hiện BC trong tinh dịch.
1.3.2. Phương pháp nhuộm elastase (Granulocyte elastate)

♦ Nguyên lý:
 Với phương pháp ELISA: elastase được tiết ra từ các PMN lưu hành
trong các dịch cơ thể, thường bị ràng buộc với chất ức chế alpha1-antitryosin.
Ống polystyren phủ kháng thể với elastase của BC hạt được ủ tiếp với mẫu
huyết tương tinh dịch và kháng thể thỏ có chứa phosphotase kiềm với chất ức
chế alpha1-antitrypsin.
Hoạt tính phosphatase kiềm liên kết sau đó được xác định bằng quang
phổ quang học bằng cách sử dụng p-nitrophenylphosphatase làm chất nền.
 Với phương pháp RIA: (Radioimmunoassay, phương pháp miễn dịch
đánh dấu phóng xạ): mẫu huyết tương tinh dịch được ủ với một số lượng nhất
định elastase và kháng thể kháng elastase. Tỉ lệ giữa phóng xạ tự do và phóng
xạ gắn thể hiện nồng độ elastase trong huyết tương tinh dịch.

♦ Ưu điểm: đánh giá khách quan hoạt động chức năng của bạch cầu


13

♦ Nhược điểm: chỉ đánh giá được những BC tiết elastase, khó thực hiện
và đắt.

1.3.3. Phương pháp nhuộm peroxidase (Myelo-peroxidase)
Nguyên lý: trong PMN có hệ thống enzym peroxidase nội bào, với sự
hiện diện của H2O2, chất nền là benzidine hoặc o-toluidine sẽ tạo thành phức
hợp màu nâu đậm có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Do đó, bạch cầu
đơn nhân vào mốt số đại thực bào (đã ăn PMN) sẽ được xác định.

♦ Ưu điểm: nhanh chóng, dễ thực hiện và giá thành rẻ. Nhuộm được các
tế bào BC hạt đa nhân, là loại BC chủ yếu trong tinh dịch. Phương pháp
này đủ ý nghĩa trong thực hành lâm sàng

♦ Nhược điểm:
 Chỉ những bạch cầu có chứa peroxidase mới được phát hiện.
 Không phân biệt được BC lympho và mono.
 Chất khí được tạo thành bởi peroxidase và nhiệt của đèn kính hiển vi tạ
o thành các bọt nước cản trở việc đọc kết quả.
 Benzidine có thể gây ung thư.
1.3.4. Phương pháp đo gốc tự do oxy hóa của BC tinh dịch bằng
Chemiluminescence. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hoi thiết bị phức tạp
nên thường được dùng trong nghiên cứu hơn là thực tiễn lâm sàng.
1.3.5. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch BC bằng kháng thể đơn dòng.
Đây là phương pháp nhuộm đặc hiệu nhất, có thê phân biệt được BC hạt,
lympho và đại thực bào. Phương pháp này còn cho phép nhuộm chọn lọc từng
quần thể tế bào, được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện BC tong tinh dịch.
1.4. Các nghiên cứu trong nước và thế giới về bạch cầu trong tinh dịch
Johanisson và cs., 2000 đã phân biệt bạch cầu với các tinh tử và tinh bào
trong phiến phết được nhuộm theo quy trình Papanicolaou (dựa trên sự khác


14
nhau về màu nhuộm, kích thước và hình dạng nhân) [4]. Wolff,

1995;

Johanisso và cs., 2000: xét nghiệm hoạt tính của men peroxidase do bạch cầu
hạt có chứa peroxid là dạng bạch cầu chiếm ưu thế trong tinh dịch [4]. Homyk
và cs., 1990; Eggert-Kruse và cs., 1992: xét nghiệm hóa miễn dịch tế bào có
thế phân biệt bạch cầu hạt với bạch cầu thông thường và các kháng thể kháng
tinh trùng. [4]


15

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là mẫu tinh dịch của những bệnh nhân nam trong
độ tuổi 18-50 bị vô sinh đến khám, tư vấn, làm xét nghiệm TDĐ tại Trung
tâm Tư vấn di truyền và phòng khám nam khoa – tiết niệu, Bệnh viện Đại học
Y Hà Nội từ tháng 06/2018 đến tháng 06/2019.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả


16

Thu thập thông tin bệnh nhân
Tên, tuổi, địa chỉ.
Có biểu hiện viêm nhiễm hay không

Lay mẫu tinh dịch (kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày)

tinh trùng
giá độ di động tinhĐánh
trùnggiá số lượng “tế bào khác”
Đánh giá số Đánh giá hình thái Đánh
lượng tinh tùng

Tế bào khác ≤ 1 triệu/ml
Tế bào khác > 1 triệu/ml

Nhuộm peroxidase

Tính tỉ lệ các mẫu có bất thường số lượng bạch cầu trong tinh dịch.
Phân tích mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng.
Phân tích mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với hình thái tinh tùng.
Phân tích mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với tốc độ tinh trùng.


17
Cỡ mẫu:

n=
Trong đó:
- n : Số mẫu cần thu thập.
- : Mức ý nghĩa thống kê, lấy giá trị =0,05.
- Z 1-/2: Giá trị tới hạn của phân bố chuẩn với mức ý nghĩa 2 phía của
sai lầm  đã ấn định (Z1-/2 = 1,96).
- p: theo nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ xuất hiện bạch cầu trong
tinh dịch là 10% [12]

- = Sai số mong muốn (=0,05).
Vậy n = 139. Thực tế chúng tôi thu thập…….mẫu.
2.2.2. Các quy trình kỹ thuật.

♦

Quy trình nhuộm peroxidase (sử dụng kit Viscosity-BR hoặc

Viscosity-CH của hãng Sperm Prosessor Pvt. Ltd, India đã được FDA phê
duyệt)
 (1) Bước 1: Dán nhãn đánh dấu mã bệnh nhân và mẫu.
 (2) Bước 2: Đo thể tích tinh dịch (đơn vị mililit)
 (3) Bước 3: Lấy 0,9ml dung dịch Reagent-I vào micro tube.
 (4) Bước 4: Thêm 0,1ml tinh dịch đã được hóa lỏng và mix đều ở (2)
vào micro tube.
 (5) Bước 5: Mix đều micro tube trên.
 (6) Bước 6: Thêm 1 giọt Reagent-II vào micro tube, lắc đều 1-2 phút.
 (7) Bước 7: Đê micro tube ở nhiệt độ phòng 20-30 phút.
Đánh giá kết quả nhuộm.
* (1) Lấy 10µL dung dịch đã nhuộm vào buồng phần tích tinh dịch hoặc
buồng độ sâu 10µm và đậy lamen.
* (2) Kiểm tra 10 vi trường dưới KHV vật kính x40.


18
* (3) Đếm: - Số lượng BC trong 10 vi trường.
- Số lượng BC bắt màu nâu (dương tính với peroxidase)
trong 10 vi trường.

♦ Đánh giá số lượng tinh trùng.

♦ Đánh giá độ di động tinh trùng.
♦ Đánh giá hình thái tinh tùng.
2.2.3. Phương pháp thu thập thông tin
2.2.3.1 Kỹ thuật thu thập thông tin
- Khai thác hồ sơ bệnh án bằng phương pháp hỏi bệnh và làm bệnh án.
- Thu thập các chỉ số tinh dịch bằng xét nghiệm tinh dịch đồ trên máy
Casa: mật độ, tỷ lệ sống, độ di động, bất thường hình thái, thể tích và pH.
2.2.3.2 Các chỉ số nghiên cứu
- Đặc điểm tình hình bệnh nhân: tuổi giới, trình độ văn hóa, nghề nghiệp
- Các chỉ số tinh dịch đồ: mật độ, tỷ lệ sống, độ di động, bất thường
hình thái, thể tích và pH.
- tỷ lệ bạch cầu trong tinh dịch
2.3. Phân tích xử lý số liệu
Quản lý số liệu bằng Excel 2010 và xử lý số liệu thu thập được trên phần
mềm SPSS phiên bản 20.0.
2.4. Sai số và cách khống chế:
2.4.1. Sai số
Trong quá trình lấy mẫu
Trong quá trình làm tinh dịch đồ
Trong quá trình nhuộm peroxidase và đếm số lượng bạch cầu
Trong quá trình nhập và xử lý số liệu


19
2.4.2. Cách khắc phục



Trong quá trình lấy mẫu: Lấy mẫu theo đúng quy định như:

- Kiêng quan hệ ít nhất từ 3-5 ngày trước khi lấy mẫu.
- Vệ sinh tay trước khi lấy mẫu.
- Tinh dịch được lấy bằng tay như thủ dâm và xuất tinh trực tiếp vào lọ
đựng mẫu.
- Lọ đựng tinh dịch phải được tiệt trùng và làm bằng loại nhựa không
ảnh hưởng đến tinh trùng.
- Không lấy mẫu bằng cách quan hệ.

 Trong quá trình làm tinh dịch đồ:
- Tuân thủ đúng các bước làm xét nghiệm tinh dịch đồ

 Trong quá trình nhuộm peroxidase và đếm số lượng bạch cầu
- Tuân thủ đúng các bước theo protocol
- Đếm số lượng bạch cầu một cách cẩn thận tránh bỏ sót

 Trong quá trình nhập và xử lý số liệu
- Số liệu được kiểm tra lại trước khi nhập vào phần mềm.
- Cần nhập liệu cẩn thận, nhập xong từng phiếu kiểm tra lại một lượt
phiếu đó rồi chuyển sang nhập phiếu tiếp theo.
2.5. Đạo đức nghiên cứu
- Bệnh nhân được giải thích rõ về mục đích của nghiên cứu, những lợi
ích có thể có và đóng góp cho khoa học của phương pháp xét nghiệm.
- Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia nghiên cứu và có ký giấy
cam kết.
- Thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối.
- Số liệu phân tích của bệnh nhân chỉ sử dụng cho nghiên cứu này và
không dùng cho bất kỳ mục đích nào khác.