(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
............... ***...............

Hoàng Đăng Sáng

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỘT BIẾN CÓ
KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA KẾT
HỢP VỚI XỬ LÝ KHÁNG SINH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐỖ THỊ HUYỀN
ThS. TRẦN BĂNG DIỆP

LỜI CẢM ƠN
Hà Nội - 2018


Để hoàn thành nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên tôi xin
chân thành cảm ơn sâu sắc đến ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, ngƣời thầy
đã chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu - ThS. Trần Băng Diệp
và ngƣời thầy cho tôi những ý kiến quí báu - TS. Đỗ Thị Huyền, các cô đã giúp tôi
trong quá trình hoàn thiện luận văn. Ngoài ra tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy,
Cô giảng dạy đã cho tôi nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu.
Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội,
Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam và anh chị em đồng nghiệp tại phòng Nghiên
cứu Công nghệ bức xạ đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm việc,
học tập và hoàn thiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và
tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu.
Đề tài “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh
protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” đã nhận đƣợc sự
hỗ trợ rất lớn từ đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ, mã số
ĐTCB/01/15/TTCX, do Ths. Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm./.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018
Hoàng Đăng Sáng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi.
Các số liệu và tài liệu đƣợc trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên
cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã đƣợc công bố trƣớc đó.
Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.
Hà Nội,tháng 11 năm 2018
Học viên

Hoàng Đăng Sáng


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP
Khuẩn lạc KKS- 0,2

DNA
EDTA
GLP – 1

: Adenosine triphosphate
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
rifampicin nồng độ 2 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
streptomycin nồng độ 20 µg/ml
: Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung
streptomycin nồng độ 200 µg/ml
: Deoxyribonucleic acid
: Ethylendiamin tetraacetic acid
: Glucagon – like peptide – 1

KS
MMP
MT
PCR
ppGpp

: Kháng sinh
: Matrix metallo protease
: Môi trƣờng
: Polymerase chain reaction
: Guanosine – 5‟diphosphate – 3‟diphosphat

RNA
RNAP
sp.
TB
tRNA
VK
VSV

: Ribonucleic acid
: RNA polymerase
: Species
: Tế bào
: RNA vận chuyển
: Vi khuẩn
: Vi sinh vật

Khuẩn lạc KKS- 2
Khuẩn lạc KKS- 20
Khuẩn lạc KKS- 200


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................................................4
1.1. PROTEASE............................................................................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................................ 4
1.1.2. Phân loại protease..................................................................................................... 4
1.1.3. Nguồn thu protease................................................................................................. 6
1.1.4. Ứng dụng của protease .............................................................................................. 8

1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp ............................................................................. 8
1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu............................................................................ 10
1.1.4.3. Trong nông nghiệp ............................................................................................ 11
1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS ................................................... 12
1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis.................................................................................12
1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ....................................................................... 12
1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên .................................... 12
1.2.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 12
1.2.1.4. Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy ................................................. 13
1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử ....................................................................... 14
1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis ................15
1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng....................................... 15
1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease ...... 17
1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy ............................................................ 18
1.3.

PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP

(PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME ............................................................................... 18
1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV ............................................................................18
1.3.2. Công nghệ gen .........................................................................................................19


1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến ................................................................................ 19
1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền ........................................................................................... 20
1.3.3. Công nghệ trao đổi chất ..........................................................................................20
1.3.4. Công nghệ ribosome ................................................................................................21
1.4. TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC XẠ
ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT ................................................... 24
1.4.1. Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa ..............................................24

1.4.1.1. Các quá trình xảy ra sau khi bức xạ đi vào tổ chức sinh học ....................... 24
1.4.1.2. Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa ..................................................... 26
1.4.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở vi sinh vật............................27
PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 30
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ................................................................................................. 30
2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................................30
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................30
2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................................31
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................................. 31
2.2.1. Bảo quản và giữ giống.............................................................................................31
2.2.2. Xử lý chiếu xạ..........................................................................................................32
2.2.2.1.

Nuôi cấy huyền dịch tế bào .......................................................................... 32

2.2.2.2.

Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy: ....................................................................... 32

2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật......................................................................32
2.2.4. Định tính và định lƣợng protease ...........................................................................33
2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch ........................................................... 33
2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến ............................................................................. 34
2.2.5. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ ..
.......................................................................................................................36


2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ
kết hợp với kháng sinh .......................................................................................................36
2.2.7. Xác định đột biến ....................................................................................................37

2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu ...............................................................................37
2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12 ......................................................... 38
2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................................. 38
2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA ............................................................................... 38
2.2.7.5. Giải trình tự ........................................................................................................ 39
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 40
3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO
LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN................................................................................ 40
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định .......40
3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis ........................................................................................................................ 42
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG .................................................... 44
3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis ...............44
3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng
Bacillus subtilis ..................................................................................................................45
3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis ..................................................................................................................47
3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI
CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS......................................................................... 49
3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng
Bacillus subtilis ............................................................................................................... 50
3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các
chủng kháng xạ và kháng streptomycin ........................................................................ 51
3.3.2. Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin ..................................................................55


3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng
Bacillus subtilis ............................................................................................................... 55

3.3.2.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các
khuẩn lạc kháng xạ và kháng rifampicin ....................................................................... 56
3.4. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC GEN rpoB, rpsL Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ
KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO HƠN CHỦNG GỐC ........................................................... 59
3.4.1. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL ở các chủng gốc, các khuẩn lạc sinh
protease cao hơn chủng gốc ..............................................................................................59
3.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng gốc và khuẩn lạc sinh protease
cao ............................................................................................................................................. 59
3.4.2.2. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR
................................................................................................................................................... 61
3.4.2.3.Tinh sạch sản phẩm PCR khuếch đại các gen rpoB và rpsL để giải

trình tự xác định đột biến ..................................................................................................... 61
3.4.2.4. Giải trình tự gen rpoB của 2 chủng thuần và các khuẩn lạc sinh protease
vƣợt trội..................................................................................................................................... 62
3.4.2.5. Giải trình tự gen rpsL của 2 chủng thuần và các chủng đột biến ................ 66
3.4.2.6. Phân tích so sánh kết quả giữa kiểu đột biến, vị trí đột biến với khả năng
sinh protease ............................................................................................................................. 68
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 70
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN..............73
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................... ..73
PHỤ LỤC .................................................................................................................................................. ..81


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại protease ........................................................4
Hình 1. 2. Vai trò protease trong nghiên cứu ung thƣ ...................................................10
Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu ...........................11
Hình 1.4. Tế bào VK Bacillus subtilis quan sát dƣới kính hiển vi ..........................13
Hình 1.5. Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi ............14

Hình 1.6. Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp của ribosome ..........21
Hình 1.7. Công nghệ ribosome. ................................................................................22
Hình 1.8. Cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở Escherichia coli, Streptomyces
coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae. ...............................................23
Hình 1.9. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới DNA ...................24
Hình 1.10. Các loại tổn thƣơng do tác động của bức xạ ion hóa trên DNA....................26
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease ......................................................34
Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh
protease......................................................................................................................40
Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao............41
Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng Bacillus subtilis tuyển chọn ..................41
Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus
subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .................................................42
Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng Bacillus subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau
khi thu và sau bảo quản 48 giờ ..................................................................................43
Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng ........44
Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng VK Bacillus subtilis sống sót trong dịch
nuôi cấy và liều chiếu xạ ...........................................................................................46


Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng Bacillus
subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................50
Hình 3.9. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và
của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 300
Gy ..............................................................................................................................53
Hình 3.10. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần
và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 500
Gy ..............................................................................................................................54
Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng Bacillus
subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................55

Hình 3.12. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần
và của các khuẩn lạc kháng rifampicin .....................................................................57
Hình 3.13. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng
xạ và kháng rifampicin ..............................................................................................58
Hình 3.14. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các chủng B.subtilis trên gel
agarose 0,8 %. ............................................................................................................60
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB (A) và gen rpsL (B) từ
các chủng B.subtilis trên gel agarose 1,5 %.................................................................61
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR tinh sạch tƣơng ứng với đoạn gen rpoB
và rpsL trên gel agarose 1,5 %. .................................................................................62
Hình 3.17. So sánh trnh tự amino acid của tiểu phần β – RNA polymerase đƣợc mã
hóa từ gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. .....63
Hình 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus
subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. .........................................................................63
Hình 3.19. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (B5_rpoB) với chủng đột biến 609
(rpoB-M)....................................................................................................................64
Hình 3.20. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (H12) với chủng đột biến 2, chủng 6
và chủng 1379 ...........................................................................................................65


Hình 3.21. So sánh trình tự nucleotide của gen rpsL ở 2 chủng thuần Bacillus
subtilis B5 và Bacillus subtilis H12 ..........................................................................66
Hình 3.22. Trình tự gen rspL của chủng thuần (B5_rpsL) với chủng đột biến
301_rpsL, chủng 321_rspL và chủng 609_rpsL. ......................................................67
Hình 3.23. Trình tự gen rpsL của chủng thuần (H12_rpsL) với chủng đột biến
2_rpsL, chủng 19_rpsL và chủng 1904_rpsL. ..........................................................67
Hình 3.24. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng
thuần B5 và chủng đột biến 609-B5............................................................................68
Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng
thuần B5 và chủng đột biến 533-B5.................................................................................68

Hình 3.26. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng
thuần H12 và chủng đột biến 19-H12 .........................................................................69


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số chủng VSV có khả năng tổng hợp protease cao ..............................7
Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của VK Bacillus subtilis................................................13
Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào
...................................................................................................................................30
Bảng 2.2. Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin ...............35
Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính ........................................35
Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu ..........................37
Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và
rpsL từ DNA tổng số .................................................................................................38
Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả
năng sinh protease .....................................................................................................40
Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease
...................................................................................................................................41
Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng Bacillus subtilis tại các liều
chiếu xạ khác nhau ....................................................................................................48
Bảng 3.4. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh
protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 chiếu xạ...........................................52
Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 200 µg/ml có khả năng sinh
protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 kháng xạ và kháng streptomycin 20
µg/ml .........................................................................................................................53
Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease
cao đƣợc sàng lọc từ các chủng Bacillus subtilis chiếu xạ .......................................56
Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội .......59
Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ
(OD) ở bƣớc sóng 260 nm trên máy Nano Drop .........................................................60

Bảng 3.9. Danh sách các khuẩn lạc có đột biến ở gen rpoB. Vị trí đột biến đƣợc chỉ
ra trên kết quả trình tự ...............................................................................................65
Bảng 3.10. Tổng hợp các đột biến xuất hiện trên gen rpoB các chủng gây đột biến
chọn lọc và hoạt tính protease của các chủng này....................................................69


MỞ ĐẦU
Protease là nhóm enzyme có chức năng phân giải các liên kết peptide của
protein để tạo thành các amino acid đơn lẻ. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong
nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà
khoa học cũng nhƣ các công ty hóa dƣợc lớn trên thế giới. Theo thống kê, hiện
nay protease chiếm đến 65% sản phẩm enzyme thƣơng mại toàn cầu và doanh thu
ƣớc tính có thể đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019.
…………..
( />Vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn nguyên liệu thích
hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ
dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng vi khuẩn này có hoạt tính ổn
định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005). Tuy nhiên, các
chủng Bacillus tự nhiên thƣờng cho năng suất sinh protease không cao và vì thế
việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vƣợt trội là một lựa
chọn lý tƣởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease.
Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh
vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt
bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến
10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , notron
có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia
phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của
DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA.

Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt
tính của vi sinh vật (Awan, 2011).
Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh
vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh
(Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng
chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng
streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng
sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa
và cs, 2006). Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công
trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây
đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã
hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013;
1


Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome
(Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh
làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp
protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản
phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp
ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả
năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần. Trong khi, theo báo cáo
của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái
tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp
đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản
xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử
dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục
những hạn chế này.
Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối
đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen. Tuy nhiên, thời

gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết
hợp kháng sinh với xử lý chiếu xạ đƣợc xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực
chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn,
đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs,
2005; Al-Sudany và cs, 2010).
Nhƣ vậy, việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng
kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của
nghiên cứu. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo
chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ
gamma kết hợp với xử lý kháng sinh”
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt
tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nƣớc.
Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng.
+ 2.1: Xử lý chiếu xạ các chủng Bacillus subtilis từ nội dung 1.
+ 2.2: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ với tốc độ sinh trƣởng.
2


+ 2.3: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ và khả năng sinh protease.
+ 2.4: Xác định liều chiếu xạ thích hợp để có đƣợc tỷ lệ đột biến sinh protease
cao.
Nội dung 3: Xử lí chiếu xạ kết hợp sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng tới
các gen mã cho sản phẩm liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protease của chủng
Bacillus subtilis
+ 3.1: Sàng lọc các chủng sau chiếu xạ có khả năng chống chịu kháng sinh
do bị đột biến trên các gen tham gia tổng hợp ribosome.
+ 3.2: Sàng lọc các chủng Bacillus subtilis chịu bức xạ và kháng kháng sinh

có khả năng sinh protease.
+ 3.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc
dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao.
Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có
khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc.

3


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. PROTEASE
1.1.1. Giới thiệu chung
Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân
tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.1) ().
Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó
protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học
ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày
và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc
trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở
dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998).

Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase
().
1.1.2. Phân loại protease
Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase
(López-Otín, 2007).
* Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,
exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do
của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các

dipeptide hoặc tripeptide.
- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carboxyl của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide.

4


* Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase
đƣợc chia thành 5 nhóm ():
- Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động
là –OH của serine. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật nhƣ
chymotrypsin, trypsin, elastase (López-Otín, 2007). Nhóm subtilisin gồm
hai loại enzyme là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Carter, 1989).
Các serine protease thƣờng hoạt động mạnh ở pH 9 – 11 và có tính đặc
hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
- Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là
cysteine. Nhóm này bao gồm các protease thực vật nhƣ papayin, bromelin,
một vài protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín, 2007). Các
cysteine protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.
- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin,
cathepsin, rennin (López-Otín, 2007). Các aspartic protease thƣờng có hai
gốc aspactic acid bảo thủ tham gia xúc tác nằm trong trung tâm hoạt
động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH axit.
- Threonine protease: Các threonine protease tƣơng tự nhƣ serine protease
nhƣng chúng chứa gốc xúc tác là amino acid threonine trong trung tâm
hoạt động. Threonine protease chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1995, cơ chế
phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với

protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động
tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007).
- Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với
các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion
kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít
protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham
gia phản ứng xúc tác. Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung
tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991).
Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào
động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991).
5


Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu
đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật.
Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline
protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp. (López-Otín,
2007).
1.1.3. Nguồn thu protease
Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động
vật, thực vật, tới vi sinh vật.
Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ
dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch
vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa.
Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông
tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.
Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong
quả. Papain thu đƣợc từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ; bromelain thu từ quả, chồi

dứa, vỏ dứa; ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả (Veloorvalappil và cs.,
2003). Tuy nhiên, do nồng độ enzyme trong mô thực vật nói chung thấp nên cần sử
dụng lƣợng lớn nguyên liệu thực vật để thu đƣợc protease.
Nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi có khả năng tổng hợp mạnh
protease. Protease vi sinh vật có thể ở trong tế bào hoặc đƣợc tiết vào môi
trƣờng nuôi cấy (Phạm Thành Hổ, 2003). Các vi khuẩn thƣờng dùng trong tổng
hợp protease là B. subtilis, B. cereus, B. brevis, B. licheniformis… sinh các
protease trung tính. B. thermophilus tổng hợp protease chịu nhiệt, các loài xạ
khuẩn tổng hợp protease gồm có S. griseus, S. rimosus…Nấm sợi tổng hợp
protease gồm có A. oryzae, A. awamori, A. niger,… một số loài Penicilium và
Rhizopus (Veloorvalappil và cs, 2003; Lƣơng Đức Phẩm, 2007).
Do khả năng tăng sinh khối nhanh, các vi sinh vật sinh protease đƣợc xem là
đối tƣợng thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp
và đời sống nhờ những ƣu điểm chính sau:
-

Chủ động quá trình sản xuất enzyme do quá trình sinh trƣởng, phát triển và
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào điều
kiện ngoài.

6


Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau và

-

enzyme thu đƣợc từ chúng có hoạt tính cao. Chu kì sinh trƣởng và phát triển
của vi sinh vật ngắn do đó có thể tăng năng suất thu hồi sản phẩm.
-

Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hƣớng có lợi
(định hƣớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).

-

Giá thành enzym vi sinh vật không cao nhờ môi trƣờng nuôi cấy tƣơng đối
rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất.
Cho đến nay, số lƣợng enzyme đƣợc sản xuất hàng năm ở các nƣớc phát triển

(chủ yếu là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản) vào khoảng 300.000 tấn, trong đó có 600 tấn
protease tinh khiết đƣợc sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc (Veloorvalappil và cs, 2003). Các kỹ thuật sinh học
phân tử hiện đại cho phép sản xuất protease cố định trên các chất mang không tan,
và điều đó giúp enzyme có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng.
Bảng 1.1. Một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao
(Veloorvalappil và cs, 2003)
Nấm

VK

Aspergillus candidus

Alteromonas

A. flavus

Arthrobacterprotophormiae

B. alcalophilus subsp.

A. fumigatus

Brevibacterium linens

halodurans

A. melleus

Hyphomonasjannaschiana

B. amyloliquefaciens

A. niger

Lactobacillus helveticus

B. cereus strain

A. oryzae

Malbrancheapulchella

A. sojae

sulfurea

B. coagulans

A. sydowi

Microbacterium sp.

B. firmus

Cephalosporium

Bacillus spp.
sp. B. alcalophilus

sp. Nocardiopsisdassonvillei

var. B. circulans

B. intermedius

Chrysosporiumkeratinop Oerskoviaxanthineolytica

B. lentus

hilum

Pimelobacter sp.

B. licheniformis

Conidioboluscoronatus

Pseudomonas aeruginosa

B. megaterium

Entomophthoracoronata

Pseudomonas maltophilia

B. proteolyticus

Fusariumeumartii

Pseudomonas sp.

B. pumilus

Paecilomyces lilacinus

Salinivibrio sp.

B. sphaericus

Scedosporium

Staphylothermusmarinus

B. subtilis

7


apiospermum

Streptomyces sp.

B.

Tritirachium

album Streptomyces microflavus

subtilis

amylosacchariticus

Limber

Streptomyces moderatus

Bacillus sp.

Rhizopusoligosporus

Streptomyces rectus

B. stearothermophilus

Streptomyces

rectus

var.

var.

proteolythicus
Streptomyces rimosus
Streptomyces sp.
Thermoactinomyces sp.
Thermoactinomycesthalpophilus
Thermobacteroidesproteolyticus
Thermococcusceler,
T. stetteri, T. litoralis
Thermomonosporafusca
Thermusaquaticus
Torulathermophila
Vibrio alginolyticus
Vibrio metschnikovii
Xanthomonasmaltophila
1.1.4. Ứng dụng của protease
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp,
nông nghiệp, y tế, v.v…
1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp
 Công nghiệp sản xuất bia và công nghiệp chế biến thủy sản
Các enzyme dùng trong sản xuất bia là enzyme α – amylase, β – amylase, các
protease, pentosanase và β – glucanase. Trong đó, các enzyme này có vai trò
chuyển hóa các polysaccharide đại mạch, các hợp chất đạm khó tan trong MT lên
men thành các oligopeptide và amino acid với khối lƣợng đủ đảm bảo cho hoạt
động sống bình thƣờng của nấm men, cho sự hoàn chỉnh vị bia và tạo bọt (Lê Ngọc
Tú và cs, 1998).

8

Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam nhiều nghiên cứu ứng dụng
enzyme protease từ Bacillus subtilis trong quy trình sản xuất nƣớc chấm giúp rút
ngắn thời gian chế biến, tăng hàm lƣợng đạm và hƣơng vị cho sản phẩm (Ichishima
và cs, 1983).
 Công nghiệp thuộc da và công nghiệp dệt
Chế biến da bao gồm một số công đoạn nhƣ ngâm ƣớt, tẩy lông, làm mềm và
thuộc da (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Quá trình thuộc da thƣờng dùng các hóa chất
độc hại nhƣ Na2SO3, nên đòi hỏi chi phí cao để xử lý nƣớc thải. Việc sử dụng
enzyme thay thế hóa chất đã thành công trong việc nâng cao chất lƣợng da, giảm ô
nhiễm môi trƣờng. Protease có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần
protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm da bị cứng. Kết quả, loại
bỏ các chất nhớt, tăng độ mềm dẻo cho da; những tính chất đó đƣợc hoàn thiện hơn
sau khi thuộc da. Trƣớc đây, để làm mềm da ngƣời ta dùng protease đƣợc phân lập
từ cơ quan tiêu hóa của động vật (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Hiện nay, việc đƣa các
protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (Aspergillus
oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả
và dần chiếm một vị trí quan trọng (Ogino và cs, 2007).
Protease đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo
đƣợc tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) làm cho sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm.
Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine; lớp này gây dính bết các sợi tơ
tự nhiên, nhờ đó làm bong và tách rời các sợi tơ, giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng
(Phạm Thị Trân Châu và cs, 2006).
 Công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa nhƣ: chất làm sạch kính, răng giả, kem đánh răng và nhiều nhất trong
bột giặt. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm
1956 với tên BIO – 40 đƣợc thu nhận từ B. subtilis (Rao và cs, 1998). Đến năm
1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX

đƣợc chiết xuất từ B. licheniformis (Rao và cs, 1998). Gần đây, tất cả các protease
bổ sung vào chất tẩy trên thị trƣờng đều là serine protease, đƣợc sản xuất từ
Bacillus sp. và chủ yếu từ B. subtilis (Rao và cs, 1998). Trên thế giới, mỗi năm
ngƣời ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai
công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal đã cung cấp cho toàn cầu
hơn 95% lƣợng enzyme protease hàng năm (Gupta và cs, 2002).

9


 Xử lý ô nhiễm môi trường
Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung
dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dƣỡng cho cá, vật nuôi. Protease
thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bƣớc, ban đầu chúng đƣợc hấp
thụ lên các chất rắn, sau đó cắt các chuỗi polypeptit nhờ đó thể tận dụng nguồn
protein này, giảm thiểu tác nhân gây ô nhiễm môi trƣờng (Whiteley và cs, 2006).
1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu

Hình 1. 2. Vai trò protease trong nghiên cứu ung thƣ (Freije và cs, 2011). Các tế bào
ung thƣ chỉ di căn tới các vị trí khác trên cơ thể khi các protease nhƣ cystein protease,
metallo protease (MMP) phân cắt protein xung quanh khối u
Protease đƣợc coi là một họ thuốc lớn mang nhiều tiềm năng tuyệt vời. Cơ
quan quản lý lƣơng thực và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food & Drug Administration –
FDA) đã phê duyệt 11 loại protease
( />
dùng

cho

điều

trị

HIV

Protease cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh ung thƣ. Các cystein
protease và metallo protease kích thích quá trình di căn bằng cách phân cắt các
protein ngoại bào xung quan khối u (Hình 1.2) (Freije và cs, 2011). Ngƣợc lại,
chính protease cũng đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ khi chúng kích hoạt các
quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) (Freije và cs, 2011). Chất ức chế
proteasome Velcade đƣợc chấp nhận trong điều trị ung thƣ máu từ năm 2003
( />Các serine – protease – dipeptidyl – peptidase – amin 4 (DPP4) là protease
tham gia vào quá trình điều hòa glucose và là đích trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.
10


GLP – 1, hormone ruột là tín hiệu quan trọng cho sự giải phóng insulin. Protease
DPP4 bất hoạt GLP – 1, do đó làm giảm bài tiết insulin và tăng nồng độ đƣờng
trong máu. Các chất ức chế DPP4 đầu tiên đƣợc sử dụng trong bệnh tiểu đƣờng là
Sitagliptin (Merk) đƣợc chấp nhận bởi FDA Hoa Kỳ vào năm 2006
( />USD (Tỷ)

Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu.
(Protein Hydrolysis Enzymes Market - Global Trends & Forecasts to 2019, 2014)
Ngoài ra, protease đƣợc sử dụng nhiều trong điều trị các bệnh về tim mạch,
nhiễm trùng máu, rối loạn tiêu hóa, vẩy nến, xơ nang…………………………..…
( />1.1.4.3. Trong nông nghiệp
Nông nghiệp tuy không phải là mục tiêu hàng đầu của công nghệ sinh học ở
nhiều nƣớc công nghiệp phát triển trên thế giới, nhƣng trên thực tế những hoạt động
nghiên cứu, sản xuất và thƣơng mại hóa các sản phẩm công nghệ sinh học trong

nông nghiệp cũng đƣợc nhiều tập đoàn lớn quan tâm. Trong lĩnh vực này, protease
đã đƣợc sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi theo cách trộn trực tiếp hoặc kết hợp
với một số enzyme khác thành chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn … Protease còn đƣợc
dung để phân cắt các protein dƣ thừa trong phụ phẩm của ngành công nghiệp chế
biến thực phẩm, thủy sản để tạo ra các amino acid bổ sung vào thức ăn chăn nuôi,
chẳng hạn trong sản xuất thức ăn cho tôm. Bên cạnh đó, protease còn đƣợc sử dụng
trong phân bón để phân hủy các protein trong đất hoặc phân hữu cơ có nguồn gốc
động vật thành các amino acid hoặc sản phẩm trung gian mà thực vật có thể hấp thụ
đƣợc, cũng nhƣ làm sạch các ao hồ nuôi tôm, cá.
11


1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS
1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis
1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm
sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,
Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là
Bacillus subtilis.
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Division) : Firmicutes
Lớp (Class)
: Bacilli
Bộ (Order)

: Bacillales

Họ (Family)

: Bacillaceae

Giống (Genus)

: Bacillus

1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn B. subtilis có mặt trong hầu hết các môi trƣờng tự nhiên, phần lớn
cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Thông
thƣờng đất trồng có khoảng 106 - 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dƣỡng nhƣ vùng sa
mạc thì vi khuẩn này gần nhƣ không hiện diện. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong
các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B. subtilis chiếm 75 - 79% vi
khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng, chao...
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon
trong khi một số loài khác nhƣ B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trƣởng. Đặc biệt các loài nhƣ B. popilliae, B.
lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi
trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ nutrient agar (NA) hay nutrient broth (NB).
1.2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram (+) nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím, kích
thƣớc 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.

12