Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển paraconiothyrium sp VK 13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH XUÂN CHUNG

TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN-2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH XUÂN CHUNG

TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 844.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. TRẦN HỒNG QUANG

THÁI NGUYÊN-2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ,
chuyên ngành Hóa phân tích, Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học
– Đại học Thái Nguyên, tôi đã luôn nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ của các
thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Lời đầu tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời
cảm ơn tới TS Trần Hồng Quang ( Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm khoa
học và Công nghệ Việt Nam ) - người đã truyền cho tôi tri thức cũng như tâm
huyết nghiên cứu khoa học, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều
kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo Khoa
Hóa Học, các thầy cô trong Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa Học - Đại
học Thái Nguyên đã giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
thời gian ,đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn
thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã
luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Luận văn được sự đồng ý sử dụng một phần nội dung của Nhiệm vụ hợp
tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (mã số
Nhiệm vụ: VAST.HTQT.HANQUOC.03/17-18)
Trong quá trình thực hiện luận văn do còn hạn chế về mặt thời gian cũng
như trình độ chuyên môn của bản thân nên không tránh khỏi những thiếu
sót. Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô, bạn
bè và đồng nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn

Đinh Xuân Chung


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... a
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... B
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. C
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1. Sơ lược về phương pháp sắc ký : ............................................................... 3
1.1. Định nghĩa................................................................................................. 3
1.2. Nguyên tắc của sắc ký .............................................................................. 3
1.3 Các giai đoạn của quá trình sắc ký ……………………………………….3
1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng ...................................................... 4
2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .............
11
2.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H ........................ 15
2.1.1. Cường độ vạch phổ ............................................................................... 15
2.1.2. Phân loại phổ......................................................................................... 16
2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C............................................. 21
2.2.1. Phổ 13C tương tác 1H........................................................................... 22
2.2.2. Phương pháp phổ 13C xóa tương tác 1H.............................................. 23
3. Tình hình nghiên cứu vi nấm biển trên thế giới..................................... 24
Chương 2: THỰC NGHIỆM........................................................................... 29
2.1. Thực nghiệm:.......................................................................................... 29
2.1.1. Mẫu nghiên cứu: ................................................................................. 29
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 29
2.2. Dụng cụ và hóa chất................................................................................. 31
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết và phân tích sắc ký................................ 31
2.2.2. Thiết bị phân tích xác định cấu trúc ......................................................

31
2.2.3. Hóa chất sử dụng phân tích sắc ký và cấu trúc ..................................... 31
2.3. Thực nghiệm phân tích sắc ký các hợp chất ............................................ 32


2.4. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất ......................................... 33
2.4.1. Hợp chất VK-13-1 (modiolide D): ..................................................... 33
2.4.2. Hợp chất VK-13-2 (modiolide E):...................................................... 34
2.4.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR ........................................................ 34
Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................... 36
3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất VK-13-1....................................................... 36
3.2 Phân tích cấu trúc của hợp chất VK-13-2 ............................................ 39
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 43
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46


DANH MỤC CHỮ VIẾT
TẮT
13

C NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR Spectroscopy

CC
DAD
DEPT
EtOAc
HMBC
HSQC
HRESITOFMS

Sắc ký cột
Column Chromatography
Bộ phát hiện mảng điot
Diode array detector
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
Ethylacetate
Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
Heteronuclear Single Quantum Coherence
Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử thời
gian bay
High Resolution Electronspray Ionization Time-OfFlight Mass Spectroscopy

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
High-performance liquid chromatography

MeOH
PDA
TLC

Methanol
Potato Dextrose Agar
Sắc ký lớp mỏng
Thin layer chromatography

a


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC ....................................................................... 4
Hình 1.2: Phổ 1H NMR của 1-xiclopentylbut-1-en-3-on ............................... 14
Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của etylbenzen. Chiều cao bậc
thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm......... 15
Hình 1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của một số hợp chất............... 17
Hình 1.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của 3-brom-2-tertbutoxithiophen ................................................................................ 18
Hình 1.6. Phổ lý thuyết A2B........................................................................... 18
Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của 1,3,4-tribrombut-1-in ........................................ 19
Hình 1.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của stirenoxit ......................... 19
Hình 1.9 Phổ lí thuyết hệ ABX với JAX và JBX a) ngược dấu, b) cùng dấu..
20
Hình 1.10. Phổ lý thuyết A2B2....................................................................... 21
Hình 1.11. Phổ CHTN–13C có tương tác C–H (a) và xóa tương tác C–H (b)...
23

Hình 1.12 Một số hình ảnh về bốn loài vi nấm mới ....................................... 25
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ Paraconiothyrium sp. VK-13 ............
32
Hình 2.2. Sắc ký đồ HPLC phân tách hợp chất VK-13-2............................... 33
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-1......................................... 36
Hình 3.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-1 ...... 37
Hình 3.3. Các tương tác NOESY chính của hợp chất VK-13-1 ..................... 37
Hình 3.4. Hiệu số H của VK-13-1a và VK-13-1b ........................................ 38
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-2......................................... 39
Hình 3.6. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-2 ...... 40
Hình 3.7. Hiệu số H của VK-13-2a và VK-13-2b ........................................ 41

b


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1 . Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-1 ...................................... 37
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-2 ....................................... 40

c


MỞ ĐẦU
Đã từ lâu các loài nấm trên cạn được biết đến như nguồn cung cấp các
hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Kể từ khi penicillin được phát hiện bởi
Alexander Fleming vào năm 1928 tạo ra bước đột phá trong điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn, vi nấm đã trở thành một nguồn phát triển thuốc quan trọng cho
y học. Bên cạnh các hoạt chất kháng khuẩn phổ biến có nguồn gốc từ vi nấm
như fusidic acid và griseofulvin, một số loại thuốc kháng nấm mới như
Eraxis, Cancidas, và Altabax được bán tổng hợp từ các hợp chất phân lập từ

vi nấm. Các hoạt chất hạ mỡ máu statin sử dụng trong điều trị bệnh mạch
vành từ mevastitin và lovastatin . Tuy nhiên việc phát hiện lặp lại với tần suất
cao các hợp chất đã biết đã cản trở việc nghiên cứu phát triển thuốc từ nguồn
nấm trên cạn truyền thống. Do đó hiện nay việc nghiên cứu nấm trên thế giới
đã chuyển hướng sang khu vực có hệ sinh thái và môi trường còn ít được biết
đến, đó là các đại dương. Các đại dương bao phủ ba phần tư diện tích bề mặt
trái đất và là nơi trú ngụ của tất cả các loài vi sinh vật thiết yếu. Các ổ sinh
thái như trầm tích, rừng ngập mặn, tảo, và các sinh vật biển cung cấp các điều
kiện sống riêng biệt cho các vi sinh vật[1].
Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi
khuẩn, vi nấm, vi tảo-các đối tượng có khả năng nhân sinh khối lượng lớn,
phục vụ cho phát triển thuốc đang được các nhà khoa học trên thế giới rất
quan tâm. Trong đó, các hợp chất thứ cấp sản sinh từ vi nấm có sự đa dạng
cao về cấu trúc và hoạt tính sinh học và tiềm năng khai thác còn rất lớn. Với
nguồn thực vật và động vật biển dồi dào và phong phú, cùng với sự đa dạng
về hệ sinh thái và môi trường sống, sự đa dạng về sinh học của các chủng vi
nấm ở biển Việt Nam được đánh giá rất cao và tiềm năng khai thác các hợp
chất có hoạt tính sinh học có giá trị là rất khả quan. Tuy nhiên, cho đến nay
hướng nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chủng
vi nấm từ biển hầu như chưa được tiến hành ở Việt Nam. Do đó việc nghiên
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




cứu một cách hệ thống nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài vi nấm phân lập từ biển ở Việt Nam, qua đó tìm ra các
hoạt chất sinh học phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo là cần thiết.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên thế giới cho thấy chi vi nấm
Paraconiothyrium là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất thứ cấp có nhiều
hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, ở nước ta việc nghiên cứu về thành phần hóa
học, tác dụng dược lý của các loài vi nấm biển nói chung và vi nấm
Paraconiothyrium còn rất mới mẻ và giàu tiềm năng. Vì vậy, em đã lựa chọn
đề tài: “Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển
Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại”
Mục tiêu của đề tài :
Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất thứ cấp phân tách từ
chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng các phương pháp phổ
như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HRESIMS), phổ cộng
hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều (2D NMR).
Các bước thực hiện của đề tài:
1. Nghiên vứu phân tách một số hợp chất bằng các phương pháp phân tích sắc
ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), và sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) từ sinh khối của chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13.
2. Nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất thứ
cấp bằng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân
giải cao (HRESIMS), phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều
(2D NMR).

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1. Sơ lược về phương pháp sắc ký :[22.23]

1.1. Định nghĩa
Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự
phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua
pha tĩnh.
Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.
1.2. Nguyên tắc của sắc ký
Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố
ác chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha ĩnh(stationaryphase)
và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa
hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha
động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai
pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách
khỏi nhau sau một thời gian nhất định.
1.3. Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn
chính:
a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột
canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha
động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách
khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký.
Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra
ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng
được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa
giải (eluate).
3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy
từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.
Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng
thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.
c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất
không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử.
Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột
bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột.
1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng [24]
1.4.1. Cơ sở lý thuyết
Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một
chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.
Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố
khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập
thể.
1.4.2. Cấu trúc

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ
phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha
động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường
với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector.
1.4.2.1 Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với
một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ
cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải
là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp
với thiết bị loại bỏ bọt khí.
Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động
hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải
gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient,
hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể
được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao.
1.4.2.2. Bộ phận tiêm mẫu
Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu
hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao.
Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích
thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay có
thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ.
1.4.2.3. Pha tĩnh
Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:

- Silica (silica dioxyd), alumina trioxyd hoặc graphit xốp thường được
dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về
khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng;
- Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng
trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự
cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động;
5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




- Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia
tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ
không gian;
- Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica
gel hoặc graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia
tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động
và pha tĩnh;
- Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose
hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v... dùng để tách các đồng
phân đối quang (sắc ký đối quang).
Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi
hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động. Bề mặt của
chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc
thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che
phủ một số lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản
chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách
của hệ sắc ký.

Các pha liên kết dùng phổ biến là:
Octyl
Octadecyl
Phenyl

= Si–(CH2)7–CH3
= Si–(CH2)17–CH3
= Si–(CH2)n–(C6H5)

Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN
Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2
Diol

= Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH

Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc
ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




tới 8,0. Cột chứa graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divinylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.
Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến
đổi, graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cyanopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số
trường hợp.
Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh
phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình

dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những
tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong
trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ
liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề
mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi peak, đặc biệt
của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica.
Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên
luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng
cho
phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là
vi cột. Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời
gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng,
nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên,
nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 °C vì khả năng phân hủy của
pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra.
1.4.2.4. Pha động
Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực. Sự có
mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm
thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động
chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ.
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu
phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị
bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng)

của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau. Ngoài ra, dung
môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van
chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường
được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử
dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt
khí trong cốc đo của detector.
Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất
làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát
hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác
được dùng phải có chất lượng phù hợp. Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện
với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử
dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi
hữu cơ nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký.
Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu
trong sắc ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp
sắc ký sử dụng pha tĩnh không chọn lọc đối quang.
1.4.2.5. Detector
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu
ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của
các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại detector phù hợp. Tín hiệu detector thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế,
độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…
Trên cơ sở đó, người ta sản xuất rất nhiều lọai detector khác nhau, trong
đó Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, mỹ phẩm Thái Nguyên đang áp
dụng Detector mảng diod (DAD) trong máy HPLC.
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Detector DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để
định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
1.4.3. Phương pháp tiến hành
Làm cân bằng cột với pha động và tốc độ dòng theo qui định, ở nhiệt độ
phòng hoặc nhiệt độ qui định trong chuyên luận riêng, cho đến khi đường nền
ổn định. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo yêu cầu. Các
dung dịch phải không được có các tiểu phân rắn.
1.4.4. Hiệu năng
Thành phần và tốc độ dòng của pha động được qui định trong chuyên
luận riêng. Pha động là hỗn hợp dung môi được đuổi khí bằng bơm chân
không hoặc bằng một thiết bị đuổi khí khác phù hợp nhưng không ảnh hưởng
đến thành phần của hỗn hợp.
Trong quá trình định lượng, khi trong chuyên luận riêng không qui định
dùng chuẩn nội, nên sử dụng bộ phận tiêm mẫu có thể tích cố định. Trong một
số trường hợp ngoại lệ, khi trong chuyên luận chỉ dẫn tính theo chiều cao
peak thì không cần quan tâm đến hệ số đối xứng.
Cột sắc ký thường được làm bằng thép không gỉ có kích thước (chiều dài
× đường kính trong) được qui định trong chuyên luận riêng. Trong chuyên
luận riêng, khi pha tĩnh được ký hiệu bằng một chữ cái thì tra cứu ở phần
Nguyên vật liệu nêu ở dưới đây. Đường kính danh nghĩa của hạt pha tĩnh
được để trong ngoặc đơn ngay sau ký hiệu chữ cái cụ thể. Nếu không có chỉ
dẫn khác trong chuyên luận riêng, quá trình sắc ký được tiến hành ở điều kiện
nhiệt độ không đổi trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi sử dụng các pha
động có pH cao với cột có bản chất là silica nên sử dụng một tiền cột ở trước
cột phân tích.
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Trừ khi có các chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, hệ thống detector
gồm một detector đo quang gắn với một cốc đo có thể tích nhỏ (khoảng 10 L
là phù hợp). Phải đặt bước sóng theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng.
Khi dùng một máy sắc ký có thiết kế riêng biệt có thể phải thay đổi các
điều kiện sắc ký đã ghi trong chuyên luận riêng. Trong trường hợp này, người
phân tích cần đảm bảo rằng những thay đổi đó cho kết quả tương đương.
1.4.5. Thể tích tiêm
Khi thể tích tiêm không qui định trong chuyên luận riêng, nên chọn một
thể tích tiêm phù hợp để áp dụng. Chọn thể tích tiêm phụ thuộc vào đáp ứng
của phép phân tích, detector sử dụng, hiệu lực cột và toàn bộ hiệu năng của hệ
thống sắc ký. Khi không có chỉ dẫn, thường dùng thể tích tiêm là 20 L, tuy
nhiên cần kiểm tra sự thích hợp trong điều kiện cụ thể.
1.4.6. Peak phụ (Peak thứ cấp)
Có thể cần chất đối chiếu để xác định peak phụ. Peak phụ là một peak có
trên sắc ký đồ nhưng không phải là peak chính hay peak của chuẩn nội hoặc
peak của dung môi hay của các thuốc thử tạo dẫn xuất.
1.4.7. Nguyên vật liệu
Các dung môi và thuốc thử dùng để pha các dung dịch sử dụng trong
phân tích phải có chất lượng thích hợp cho sắc ký lỏng.
Khi chuyên luận riêng quy định pha tĩnh được gán với một chữ cái (A
hoặc B hoặc C) là muốn nói tới các pha tĩnh như mô tả dưới đây:
Pha tĩnh A, hạt silica;
Pha tĩnh B, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm octylsilyl
(C8); Pha tĩnh C, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm
octadecylsilyl (C18).
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN) viết tắt của tiếng Anh là
NMR (nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại
nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác
định cấu tạo các hợp chất hữu cơ phức tạp như các hợp chất thiên nhiên, các
thuốc chữa bệnh, các chất trong thành phần dầu mỏ. Phương pháp phổ biến
được sử dụng là CHTHN- 1H và phổ CHTHN- 13C. Hạt nhân của nguyên tử
1

H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment

từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là
spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [26]
Độ chuyển dịch hoá học
Hằng số chắn và từ trường hiệu dụng:
Hằng số chắn xuất hiện do hai nguyên nhân:
- Hiệu ứng nghịch từ: các điện tử bao quanh nguyên tử sinh ra một từ
trường riêng, ngược chiều với từ trường ngoài nên làm giảm tác dụng của nó
lên hạt nhân nguyên tử. Lớp vỏ điện tử càng dày đặc thì từ trường riêng
ngược chiều với từ trường ngoài càng lớn tức hằng số chắn càng lớn.
- Hiệu ứng thuận từ: bao quanh phân tử là lớp vỏ điện tử, các điện tử này
chuyển động sinh ra một dòng điện vòng, do đó xuất diện một từ trường riêng
có hướng thay đổi ngược hướng hoặc cùng hướng với từ trường ngoài. Tập
hợp tất cả các điểm trên các đường sức mà tại đó tiếp tuyến vuông góc với từ
trường ngoài sẽ tạo nên một mặt parabol. Phía trong mặt parabol, từ trường

tổng hợp nhỏ hơn B0 vì từ trường riêng ngược hướng với từ trường ngoài,
còn phía ngoài parabol thì từ trường tổng hợp lớn hơn B0 vì từ trường riêng
cùng hướng với từ trường ngoài. Do đó hằng số chắn phía ngoài parabol nhỏ
còn phía trong thì có hằng số chắn lớn nghĩa là độ chuyển dịch học cùng các
proton nằm phía ngoài parabol sẽ lớn còn phía trong sẽ nhỏ.
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Độ chuyển dịch hóa học : Đối với các hạt nhân trong phân tử càng phức
tạp trong nguyên tử do ảnh hưỏng của các đám mây electron của các nguyên
tử bên cạnh. Độ chuyển dịch hóa học của 13C trong các hợp chất hữu cơ biến
đổi trong khoảng từ 0-230ppm (so với TMS) tức là lớn gấp 20 lần so với sự
biến đổi độ chuyển dịch hóa học của 1H.
TMS là chất có hằng số chắn lớn nhất nên dùng nó làm chất chuẩn để đo
độ chuyển dịch hoá học.Đối với hạt nhân 1H thì: 0 H TMS TMS H
 Ở đây, σ TMS là hằng số chắn của chất chuẩn
TMS (tetrametylsilan), σH là hằng số chắn của hạt nhân mẫu đo, ν TMS ν H
là tần
số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo. Hằng số chắn σ xuất
hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do
đó tuỳ thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và

13

C trong phân tử khác nhau mà

mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số
chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hoá học của mỗi hạt nhân khác
nhau. Tổng quát: δ = σTMS – σX σX: hằng số chắn của chất cần đo. δ không
có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với phổ CHTHN 1H
thì δ có giá trị từ 1 đến 12 ppm còn phổ 13C thì δ có giá trị từ 0 đến 220ppm.
Vậy độ chuyển dịch hoá học δ là đại lượng đặc trưng cho những hạt nhân
cùng loại của một đồng vị bị che chắn tương đương nhau trong một hợp chất.
Nó không phụ thuộc vào thiết bị bên ngoài (cường độ từ trường hay tần số
sóng) không có thứ nguyên và được tính bằng ppm
Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử
có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong
phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

 

 TM S 

x

.10 6 ( ppm)

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN





o

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa
một các tổng quát như sau:





c huan



x

o

6

.10 ( ppm)

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân

mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn .[25]
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt
trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân
phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách
tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có
từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J
phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên
kết ngăn giữa các tương tác .[25]

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các
hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút
ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau .[26]
Ở hợp chất VIII, hai proton Hc và Hd ứng với kí hiệu A và B, proton Hb

ứng với kí hiệu X. Vân cộng hưởng của proton Hd ở 6,67 ppm bị tách thành 4
hợp phần với Jcd=16Hz và Jbd= 8Hz. Proton Hc cộng hưởng ở trường mạnh hơn
,6,05 ppm . Tín hiệu của Hc cũng là một vân bốn. Ở vân này cũng xác định
được Jcd=16 Hz và Jbc= 1Hz. Sở dĩ giá trị Jbc nhỏ vì đó là tương tác truyền qua
4 liên kết (trong đó có một liên kết đôi). Proton Hb không những tương tác với
Hc, Hd mà còn tương tac với hai nhóm metylen trong vòng xiclopentan. Tín
hiệu của Hb thể hiện ở vân bội ở khoảng 2,6 ppm.Tín hiệu của proton khác
trong vòng xiclo- pentan thể hiện bởi một vân “béo” ở khoảng 1,7 ppm. Tín
hiệu của nhóm metyl (a) thể hiện bởi một vân đơn ở 2,23 ppm.(hình bên dưới)

Hình 1.2: Phổ 1H NMR của 1-xiclopentylbut-1-en-3-on
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H
2.1.1. Cường độ vạch phổ
Diện tích giới hạn bởi đường cong phổ tỷ lệ với số proton của mỗi nhóm,
nhưng việc đo diện tích này khó chính xác. Người ta sử dụng đường cong tích
phân để xác định tỷ lệ số proton của mỗi nhóm, vì chiều cao của bậc thang tỷ
lệ với số proton ở mỗi nhóm. Ngoài ra, chiều cao bậc thang còn tỷ lệ với nồng
độ chất trong dung dịch, do đó người ta có thể tính được nồng độ chất dựa
vào đường chuẩn và chất chuẩn.[27]

Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của etylbenzen. Chiều cao
bậc thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm
Các phổ cộng hưởng từ nhân 1H hiện nay, thay vì đường cong tích phân

cho số liệu tỷ lệ proton của mỗi nhóm ở chân mỗi tín hiệu phía dưới phổ, nhìn
các số liệu này có thể dự đoán được số proton có mặt ở mỗi nhóm trong phân
tử và xác định tổng số proton trên phổ có phù hợp với tổng số proton trong
công thức dự đoán không.
Các chữ số ở phía dưới phổ chỉ số proton tương ứng của mỗi nhóm tín
hiệu phổ, tương đương với tỷ lệ chiều cao bậc thang ở đường cong tích phân.
Các chữ số phía trên cho các giá trị độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu,
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN