Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sufate tạo ra từ gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
===



===

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
===



===

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP

NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

THS. HÀ THỊ MINH TÂM

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn cô: ThS. Hà Thị Minh Tâm – Người đã chỉ
bảo, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em rất nhiều để em có thể thực
hiện và hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn, khoa SinhKTNN, Viện nghiên cứu khoa học và Ứng dụng trường đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo điêu kiện giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm để em có thể
hoàn thành khóa luận này.
Trong quá trình thực hiện nghiên cứu bản thân em đã có nhiều cố gắng
tuy nhiên kiến thức của em còn hạn chế. Do đó, đề tài nghiên cứu của em
không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được tất cả những góp ý,
phản hồi của quý thầy cô và các bạn sinh viên về đề tài nghiên cứu của em
được hoàn thiện hơn.
Cuối cùng em xin được bày tỏ tới những người bạn và gia đình của em
đã quan tâm, cổ vũ tinh thần và khích lệ em, tạo điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm

2019
Sinh viên

Cao Thị Mai


LỜI CAM ĐOAN
Tôi: Cao Thị Mai xin cam đoan về tính trung thực của đề tài:
Thứ nhất: Đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy
trong môi trường nước vo gạo” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự chỉ đạo hướng dẫn trực tiếp của ThS. Hà Thị Minh Tâm.
Thứ hai: Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa
từng công bố ở đâu.
Thứ ba: Chắc chắn đề tài của tôi không trùng với một đề tài nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm
2019
Sinh viên

Cao Thị Mai


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VLC
ThS

Vật liệu Cellulose
Thạc sĩ

OD

Mật độ quang phổ

PC

Cellulose thực vật

h

Giờ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
. L do chọn đề tài...........................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.....................................................................................2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu....................................................................................3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................3
5.

nghĩa khoa học và nghĩa thực ti n...........................................................3

6. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................5
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)......................................................5
. . . Đặc điểm cấu trúc của VLC......................................................................5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC.................................................................... 6
1.1.3. Ứng dụng của VLC.................................................................................6
1.2. Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate.......................................................7
1.2.1. Neomycin sulfate.................................................................................... 7

1.2.2. Tính chất lí hóa........................................................................................8
.2.3. Dược l và cơ chế tác dụng.....................................................................8
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Neomycin sulfate.......................9
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam...................................10
1.3.1. Trên thế giới..........................................................................................10
1.3.2. Tại Việt Nam.........................................................................................11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............12
2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................12
2.2. Máy móc, thiết bị nghiên cứu.................................................................. 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................13


2.3.1. Bố trí thí nghiệm...................................................................................13
2.3.2. Chuẩn bị VLC....................................................................................... 13
2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết của màng........................................................... 14
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn.......................................................... 15
2.3.5. Phương pháp chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate................................16
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của VLC đã nạp thuốc
Neomycin sulfate............................................................................................ 18
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả................................................19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................20
3.1. Kết quả tạo VLC từ môi trường nước vo gạo.......................................... 20
3.2. Tinh chế VLC...........................................................................................21
3.3. Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate nạp vào VLC...........................21
3.4. Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng ra khỏi VLC..........22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo VLC......................................13
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) trung bình của dung dịch Neomycin sulfate ở
các nồng độ khác nhau ở bước sóng 277nm...................................15
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS (pH = 7,4)....................................................17
Bảng 3.1. Kết quả thu VLC tươi.....................................................................20
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các VLC với độ dày khác nhau.............21
Bảng 3.3. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau.......................................23
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các VLC có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm
trong các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác
nhau (%) (n =3)...............................................................................25


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin [1].................................................7
Hình 2. . Sơ đồ biểu di n quy trình nuôi cấy thu nhận VLC............................14
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Neomycin trong môi trường dung
dịch đệm PBS (pH = 7,4) 16
Hình 3.1. Nuôi cấy VLC từ môi trường nước vo gạo..................................... 20
Hình 3.2. VLC sau khi tinh chế.......................................................................21
Hình 3.3. Lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng ra khỏi VLC................22
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh mật độ quang (OD) của lượng thuốc được giải
phóng ở VLC 0,3 cm và 0,5 cm trong các môi trường pH khác nhau
(n = 3)
23


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đ tài
Neomycin được phát hiện vào năm 949 bởi Selman Waksman tại phòng
thí nghiệm của mình. Neomycin là một loại kháng sinh aminoglycoside chống
lại vi khuẩn trong cơ thể phổ rộng mà việc sử dụng hiện tại chỉ giới hạn
ở đường uống và bôi [1]. Neomycin có sự hấp thu bằng miệng tối thiểu và
việc sử dụng nó không liên quan đến các trường hợp tổn thương gan cấp tính.
Neomycin được sử dụng để giảm nguy cơ nhi m trùng trong quá trình
phẫu thuật đường ruột của bạn, Neomycin cũng được sử dụng để giảm các
triệu chứng hôn mê gan. Trong việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng
bất kì một loại kháng sinh nào có thể dẫn đến làm giảm hiệu quả thuốc.
Neomycin cũng có thể được sử dụng cùng với chế độ ăn uống đặc biệt
để điều trị một vấn đề nghiêm trọng nhất định về não. Tình trạng này được
gây ra bởi quá nhiều chất tự nhiên (amoniac). Thông thường, gan được loại bỏ
amoniac, nhưng bệnh gan có thể gây ra quá nhiều amoniac tích tụ trong cơ
thể. Thuốc này giúp điều trị bệnh não bằng cách tiêu diệt một số vi khuẩn
đường ruột tạo ra amoniac. Quá trình sử dụng Neomycin sulfate có tác dụng
làm giảm bớt nguy cơ nhi m trùng sau khi phẫu thuật đường ruột. Nó cũng đã
được sử dụng để điều trị phát triển quá mức vi khuẩn đường ruột nhỏ,
Neomycin cực kỳ độc với thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi so sánh
với các Aminoglycosid khác. Trường hợp ngoại lệ là số lượng Neomycin rất
nhỏ nó như một chất bảo quản trong một số vắc-xin thường là 25 μg mỗi liều.
Neomycin sulfate là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều chị vết
thương. Tuy nhiên, một số nhược điểm do kem Neomycin sulfate gây ra làm
ảnh hưởng đến phương pháp điều trị như khả năng thảm thấu qua da đạt
không cao 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da….[ ].
Vật liệu Cellulose (VLC) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là
chủng Gluconacetobacter xylinus. Mặc dù có chung công thức phân tử
(C6H10O5) n với cellulose thực vật (PC), VLC không có lignin, hemiaelluloses và
pectin, thường có trong cellulose có nguồn gốc thực vật; do đó thanh lọc VLC là
một quá trình d dàng, năng lượng thấp trong khi thanh lọc PC

1


thường đòi hỏi các hóa chất khắc nghiệt. Các đặc tính độc đáo khác của VLC
là mức độ trùng hợp cao hơn và tính chất bền kéo đáng chú do cấu trúc mạng.
Khi so sánh với PC, sợi VLC cũng có diện tích riêng cao hơn khả năng giữ
nước cao hơn (giữ tới hàng trăm lần trọng lượng của nó trong nước) và thời
gian khô lâu hơn. Hơn nữa, việc sản xuất vật liệu này không đòi hỏi các
phương pháp xử lý hóa học khắc nghiệt để phân lập và tinh chế cellulose.
Trên thế giới nó được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác
nhau: như dùng màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lượng cho tế bào, sử dụng làm chất biến đổi độ nhớt trong
sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực
phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, VLC đã được
ứng dụng làm thuốc chống viêm và giảm đau, như trị phong thấp, bị thâm tím,
căng bắp thịt, đau thắt lưng cấp và thoái hoá khớp. Nó còn được dùng để điều
trị đau bụng kinh. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng VLC còn ở mức
độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu
[2].
Nước vo gạo là hợp chất chất gần gũi với cuộc sống hằng ngày có thể
thấy ở mọi nơi đặc biệt trong các gia đình, quán ăn,… hơn nữa giá thành rẻ.
Chính vì vậy nên sử dụng nước vo gạo làm môi trường để lên men những vi
khuẩn cần thiết cho nghiên cứu.
Nhằm tăng sự giải phóng của thuốc đồng thời giảm tác dụng không
mong muốn của thuốc, chúng tôi đã chọn và nghiên cứu đề tài:
“ Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Neomycin
sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo ”
2. Mục đích nghiên cứu

- Tạo ra được vật liệu cellulose từ Gluconacetobacte xilinus nuôi cấy từ
môi trường nước vo gạo.
- Thiết kế được hệ thống gồm VLC nạp thuốc và khảo sát sự giải phóng
của VLC nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên men từ

2


môi trường nước vo gạo từ các độ dày màng khác nhau trong môi trường pH
khác nhau mô phỏng đường tiêu hóa.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp thuốc
neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên men từ môi trường
nước vo gạo và viên thuốc thương mại (đối chứng) trong các môi trường giải
phóng thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau.
- Nghiên cứu sự xuyên thấm và quá trình giải phóng qua màng thẩm
tích của vật liệu cellulose nạp thuốc neomycin sulfate tạo ra từ
Gluconacetobacte xilinus lên men từ môi trường nước vo gạo và viên thuốc
thương mại (đối chứng) trong các môi trường giải phóng thuốc mô phỏng theo
đường dạ dày – ruột khác nhau.
- Nghiên cứu động học giải phóng thuốc từ các loại VLC nạp thuốc.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp thuốc neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên
men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5.

ngh a khoa học và ý ngh a th c ti n

5.1. Ý nghĩa khoa học:
- Nghiên cứu về VLC tìm ra được môi trường tạo ra VLC có khả năng
giải phóng kéo dài.
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của VLC.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn:
- Thiết kế được quy trình tạo VLC từ chủng Gluconacetobacte xilinus
lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Sử dụng VLC dùng làm hệ thống giải phóng thuốc để đưa vào điều
trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng độ thuốc trong máu trong

3


một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh, giảm các tác dụng
phụ không mong muốn và nâng cao được khả năng sử dụng thuốc.
- Từ các kết quả nghiên cứu ta có thể áp dụng vào trong thực ti n.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị VLC;
- Phương pháp xây dựng đường chuẩn;
- Chuẩn bị bộ đệm;
- Chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate;
- Xác định lượng Neomycin sulfate nạp vào VLC;
- Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng của VLC;
- Phương pháp xử lý thống kê.

4


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan v vật liệu cellulose (VLC)
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc của VLC
Gluconacetobacter xylinus được mô tả lần đầu tiên vào năm 1886 bởi
Adrian John Brown, người đã xác định được vi khuẩn trong khi nghiên cứu
quá trình lên men. Gluconacetobacter xylinus được nghiên cứu phổ biến nhất
vì khả năng tạo ra một lượng VLC tương đối lớn từ nhiều nguồn carbon và
nitơ trong nuôi cấy lỏng và đã trở thành chủng phổ biến nhất để sản xuất các
vật liệu khác nhau, bao gồm giấy, bao bì thực phẩm, vật liệu y tế và nuôi cấy
tế bào. Rất khó để có được năng suất cao bằng Gluconacetobacter xylinus
trong một hệ thống lên men quy mô lớn do năng suất thấp của nó trong môi
trường nuôi cấy khuấy trộn. Tuy nhiên, VLC do Gluconacetobacter xylinus
tiết ra có các đặc tính độc đáo bao gồm chất lượng cao về độ bền cơ học, khả
năng giữ nước, độ kết tinh, khả năng phân hủy sinh học và khả năng tương
thích sinh học.
VLC có cấu tạo từ những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose không
phân nhánh, chủng Gluconacetobacter xylinus là sản phẩm của một số loài vi
khuẩn. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của VLC giống
cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau về
cấu trúc đại thể [13, 19].
Theo nghiên cứu AJ. Brown (1886) cho biết VLC có đường kính 1,5nm
gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết hợp với nhau thành bó có bản chất là
hemicellulose. Nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 – 8nm.
Có hai cách tiếp cận chính để tổng hợp VLC bằng cách sử dụng vi sinh
vật: (i) nuôi cấy tĩnh, dẫn đến sự phát triển của một hạt VLC trắng dày đặc ở
giao diện chất lỏng không khí; và (ii) nuôi cấy động, trong đó cellulose được
sản xuất theo quy trình phân tán trong môi trường nuôi cấy, tạo ra các viên bất
thường hoặc các vi sợi lơ lửng. Việc lựa chọn phương pháp (nghĩa là nuôi cấy

5


tĩnh hoặc động) phụ thuộc vào ứng dụng cuối cùng của VLC vì các đặc tính
vật l , hình thái và cơ học của VLC tổng hợp khác nhau dựa trên quá trình
canh tác. Ví dụ, cellulose thu được thông qua phương pháp nuôi cấy động có
độ bền cơ học thấp hơn so với cellulose được tạo ra bởi nuôi cấy tĩnh. Hơn
nữa, phương pháp nuôi cấy động cho năng suất thấp hơn so với nuôi cấy tĩnh
và đột biến cao hơn ở vi sinh vật là có thể xảy ra, điều này có thể ảnh hưởng
đến việc sản xuất VLC.
Mặt khác, khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động thấp
hơn khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy tĩnh [6, 18].
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC
VLC có một số tính chất độc đáo như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ
học lớn, khả năng thấm hút nước cao,...
- Độ tinh khiết cao: VLC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Nên VLC rất d bị vi khuẩn phân hủy
hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [20].
- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [9, 20].
- Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: đó là khả năng giữ nước rất
lớn, nó có thể hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó (Patel & Suresh 2008;
Wippermann et al. 2009) [21].
1.1.3. Ứng dụng của VLC
- VLC là một loại cellulose nguyên chất được tổng hợp bởi các vi sinh
vật, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm thực phẩm, vật liệu y
sinh, làm giấy và màng chuyển đổi. Do đó, nó như một vật liệu mới đã được
thu hút nhiều sự chú hơn với sự phát triển của sinh học phân tử,... nổi bật nhất
là trong lĩnh vực y học [9,14].
- Trong y học, VLC thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được nghiên

cứu và ứng dụng làm da nhân tạo. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí
Minh đã nghiên cứu và ứng dụng VLC được tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng
thực nghiệm trên đối tượng là thỏ.

6


Những kết quả ứng dụng trên đã chứng minh rằng VLC có khả năng
giúp vết thương mau lành và ngăn không nhi m trùng [3]. Nó được ứng dụng
để sản xuất màng băng vết thương, sử dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ
quan [2].
1.2. Tổng quan v thuốc Neomycin sulfate
1.2.1. Neomycin sulfate
- Tên thông thường: Neomycin
- Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6
– [(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –
[(2R,3R,4R,5S,6S)– 3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2
– yl] oxy – 3 – hydroxy – 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –
hydroxycyclohexyl] oxyoxane – 3,4 – diol [10].
- Công thức phân tử: C23H46N6O13

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin [1]
- Khối lượng phân tử: 614.65g/mol
- Đầu tiên được phân lập từ Streptomyces fradiae và Streptomyces
albogriseus năm 949 (NBRC 2773). Neomycin là một hỗn hợp của neomycin
B (framycetin); và thuốc epomer neomycin C, thành phần sau

7

chiếm khoảng 5–15% hỗn hợp. Nó là một hợp chất cơ bản hoạt động tích cực
nhất với phản ứng kiềm. Nó có khả năng chịu nhiệt hòa tan trong nước trong
khi không tan trong dung môi hữu cơ. Neomycin có hoạt tính tốt chống lại vi
khuẩn Gram dương và Gram âm, nhưng rất độc. Do đó, việc sử dụng nó bị
hạn chế trong việc điều trị nhi m trùng đường ruột [1].
- Một gen Neomycin sufate thường được bao gồm trong DNA plasmid
được sử dụng bởi các nhà sinh học phân tử để thiết lập các dòng tế bào động
vật có vú ổn định thể hiện protein nhân bản trong văn hóa; nhiều plasmid biểu
hiện protein thương mại có chứa Neomycin sulfate như một marker có thể lựa
chọn. Các tế bào không bị lây nhi m cuối cùng sẽ chết khi nuôi cấy bằng
neomycin hoặc kháng sinh tương tự. Neomycin hoặc kanamycin có thể được
sử dụng cho prokaryote, nhưng genin (G4 8) nói chung là cần thiết cho sinh
vật nhân chuẩn.
- Neomycin liên kết với tiểu đơn vị 30S của ribosome và ức chế dịch
protein từ mRNA.
- Neomycin thể hiện ái lực gắn kết cao đối với phosphatidylinositol
4,5-bisphosphate (PIP2), là một thành phần phospholipid của màng tế bào.
1.2.2. Tính chất lí hóa
Ở dạng tinh khiết Neomycin có đặc điểm: màu trắng ngà, d tan trong
nước, rất khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [8], [12]. Quang
phổ hấp thụ của neomycin ở bước sóng 277nm. Định tính neomycin trong các
chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt,...) sử dụng
phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [15].
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng
- Không nên dùng thuốc này nếu chúng ta bị dị ứng với neomycin hoặc
các loại kháng sinh tương tự như amikacin (Amikin), gentamicin
(Garamycin), kanamycin (Kantrex), paromomycin (Humatin, Paromycin),
streptomycin, hoặc tobramycin (Nebcin, Tobi), không nên dùng neomycin nếu
bị viêm loét đại tràng, bệnh Crohn, tắc nghẽn đường ruột hoặc bệnh viêm ruột
khác, không sử dụng neomycin nếu bạn đang mang thai. Nó có thể gây hại

cho thai nhi.
8


- Neomycin thường được dùng tại chỗ trong điều trị các nhi m khuẩn ở
tai, mắt, da hoặc dùng uống để sát khuẩn đường tiêu hóa trước khi phẫu thuật đặc
biệt tắc nghẽn thần kinh cơ và liệt hô hấp đã được báo cáo sau khi sử dụng
neomycin đường uống. Cần xem xét khả năng xảy ra tắc nghẽn thần kinh cơ và
liệt hô hấp nếu dùng neomycin, đặc biệt là đối với bệnh nhân dùng thuốc gây mê,
thuốc ức chế thần kinh cơ như ubocurarine, succinylcholine, decamethonium
hoặc ở bệnh nhân truyền máu. Nếu tắc nghẽn xảy ra, muối canxi có thể đảo
ngược các hiện tượng này nhưng có thể cần hỗ trợ hô hấp cơ học [2].

* Dược động học
- Neomycin hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% liều uống
được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3g, nồng độ đỉnh
huyết thanh đạt được khoảng 4 microgam/ml và khi thụt thuốc sự hấp thu
cũng tương tự. Trường hợp niêm mạc bị viêm hoặc tổn thương khả năng hấp
thu thuốc có thể tăng lên, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt
tính. Nửa đời của thuốc khoảng 2 - 3 giờ.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Neomycin sulfate
* Chỉ định:
- Sử dụng tại chỗ bao gồm điều trị nhi m trùng mắt hời hợt do vi khuẩn
nhạy cảm (sử dụng kết hợp với các thuốc chống nhi m trùng khác), điều trị
viêm tai ngoài do vi khuẩn nhạy cảm, điều trị hoặc phòng ngừa nhi m trùng
do vi khuẩn ở da súc rửa để ngăn ngừa nhi m trùng tiểu và nhi m khuẩn que
gram âm ở bệnh nhân nhi m khuẩn bằng ống thông tiểu trong [1].
- Neomycin được dùng tại chỗ để điều trị các nhi m khuẩn ngoài da, tai
và mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm.
- Thuốc còn được chỉ định để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu

thuật và làm giảm vi khuẩn tạo NH3 trong ruột khi bị hôn mê gan.
* Chống chỉ định:
- Nên tránh sử dụng đồng thời neomycin với các thuốc lợi tiểu mạnh
như ethacrynic acid hoặc furosemide, vì một số thuốc lợi tiểu nhất định có thể
gây độc tai.

9


- Không sử dụng với trường hợp tắc ruột, mẫn cảm với aminoglycosid,
trẻ em dưới 1 tuổi [1].
- Các yếu tố khác làm tăng nguy cơ nhi m độc là tuổi cao và mất nước
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới tính đến cuối năm 20 4 cũng mới chỉ có 8 nghiên cứu ứng
dụng VLC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo, trong đó có 9
nghiên cứu với VLC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi VLC và 7
với các vật liệu Nanocomposite. VLC đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được
tiến hành nghiên cứu.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Neomycin nhưng điển hình:
- Năm 949 Selman A. Waksman đã phát hiện neomycin được sản xuất
từ môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [11]. Các nhà khoa học trên
tìm ra quá trình sinh tổng hợp và khả năng kháng khuẩn của neomycin.
- Pedersoli W. M. và cs (1994) [14] nghiên cứu về khả năng hấp thụ
của neomycin trên bê con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả tỉ lệ hấp thụ đạt
không cao, đã bị đào thải qua thận rất lớn, việc này gây đầu độc cho thận.
- Nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [16] chỉ ra rằng do
neomycin sulfate ở dạng muối so với neomycin đơn thuần thì ít gây dị ứng
với cơ thể hơn nên cải thiện hoạt động kháng khuẩn.

- Alguacil J. và cs (2015) [10] cũng đưa ra nghiên cứu về khả năng
kháng khuẩn của các dạng thế hệ của neomycin.
- Amita H. và cs (2015) [10] đã tìm ra công thức chế tạo gel chứa
neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và
cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt. Điều đó giúp tăng hiệu quả
giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt.

10


1.3.2. Tại Việt Nam
Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần
thứ 4 năm 999 [1].
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng VLC bắt đầu từ những năm
2000. Những nghiên cứu trong nước bước đầu đã thành công trong tuyển
chọn chủng có đặc tính quý, sản xuất thử nghiệm VLC và thử nghiệm ứng
dụng trong sản xuất bao bì, gạc và mặt nạ.
Neomycin mới chỉ được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một
số hoạt chất khác. Trong đó hướng nghiên cứu sử dụng VLC để hấp thụ thuốc
neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu.

11


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Neomycin (98%) được mua từ Trung Quốc.
- Giống Gluconacetobacte xilinus mua từ Nhật Bản.
- Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức.
- NaOH, HCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 và một số hóa chất khác.

- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC: Đường glucose,
acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihiđrophotphat, HCl,
NaOH, … đạt tiêu chuẩn phân tích.
- VLC (99% hàm lượng nước) sản xuất từ vi khuẩn Gluconacetobacte
xilinus do lên men ở môi trường nước vo gạo.
2.2. Máy móc, thiết bị nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản);
- Cân phân tích (Sartorius-Thụy Sỹ);
- Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder-Đức);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức);
- Máy thử độ hòa tan;
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton – Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Ống nghiệm, đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500 ml) có nút xoáy, bình
tam giác, gạc vô trùng, hộp nhựa, lọ penicilin, giấy bạc, bình định mức loại
100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet chính xác 1 ml, 5 ml, 10 ml,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.

12


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Cho VLC nạp Neomycin sulfate vào giải phóng thuốc
ở các điều kiện pH khác nhau rồi tính tốc độ giải phóng thuốc ở mỗi pH đó.
- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho VLC có độ dày khác nhau đã
nạp Neomycin sulfate giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.3.2. Chuẩn bị VLC

- Chuẩn bị VLC bởi chủng Gluconacetobacte xilinus ở môi trường
nuôi cấy được biểu thị ở bảng 2.1 [23]:

Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng lên men tạo VLC

Thành phần

Khối lƣợng

Nước vo gạo

1000ml

C6H12O6

30g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Pepton

10g

Dịch giống Gluconacetobacte xilinus

10%

Để tạo được VLC ta cần:
- Chuẩn bị các thành phần môi trường theo Bảng 2.1 [6].
- Đưa môi trường vừa chuẩn bị vào nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 1130C,
15 phút.
- Lấy môi trường đưa vào buồng cấy khử trùng dưới tia cực tím trong
15 phút rồi để nguội môi trường.

13


- Trộn môi trường với 10% dịch giống sau đó lắc đều tay đảm bảo
giống phân bố đều.
- Sử dụng đèn cồn khử trùng miệng lọ, dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ,
ủ tĩnh trong khoảng 6 – 14 ngày ở 260C.
- Sau khi được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem ngâm nước cất 2
ngày, sau đó lấy VLC đem tinh chế theo quy trình ở sơ đồ 2.2:
Tách VLC thô
Ép loại nước
Bình chứa NaOH 3%
48h, rửa và ép
Bình chứa HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
Thu VLC tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ biểu di n quy trình nuôi cấy thu nhận VLC
2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết của màng

2.3.3.1. Mục đích
Kiểm tra xem có sự có mặt của đường glucose trong VLC.
2.3.3.2. Nguyên tắc
Dùng thuốc thử Fehling để phát hiện sự có mặt của đường D – glucose,
nếu có thì sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
2.3.3.3. Tiến hành

14


- Bước 1: Dịch thử của VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học. Mẫu
đối chứng là nước cất và dung dịch D – glucose.
- Bước 2: Mỗi ống nghiệm chứa 1 ml thuốc thử Fehling. Đun dưới
ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
- Bước 3: Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn
- Các nồng độ: 0,05 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25
mg/ml; 0,3 mg/ml được pha từ Neomycin.
- Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu
dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 277 nm.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo cường độ quang
phổ của các dung dịch như trên ở bước sóng 277 nm trong các dung dịch mẫu
chuẩn [4].
- Các thao tác đều được tiến hành thực hiện 3 lần để kết quả đo có độ
chính xác cao, ghi lại kết quả và lấy giá trị trung bình ở 3 lần đo để dựng
đường chuẩn.
- Sử dụng phần mềm Excel 2010 để dựng đồ thị đường chuẩn và lập
phương trình chuẩn neomycin.
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) trung bình của dung dịch Neomycin sulfate ở
các nồng độ khác nhau ở bƣớc sóng 277nm

Nồng độ
(mg/ml)

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

OD(Abs277nm) 0.0049± 0.0130± 0.0210± 0.0290± 0.0370± 0.0440±
0,0001 0,0010 0,0015 0,0010 0,0020 0,0012

Sử dụng phần mềm Excel 2010 thiết kế đồ thị biểu di n và lập đường
chuẩn Neomycin sulfate, kết quả biểu thị như hình 2.1:

15


OD277nm

0,05

y = 0,1574x - 0,0027

R² = 0,9995

0,04
0,03

OD277nm
Linear (OD277nm)

0,02
0,01
0
0

0,1

0,2

0,3

0,4

Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Neomycin trong môi trƣờng

dung dịch đệm PBS (pH = 7,4)
Từ Hình 2.1 ta có phương trình đường chuẩn ở bước sóng 277 nm là:
Y = 0.1574x – 0.0027 (R2 = 0.9995) (1)
Trong đó:

x là nồng độ Neomycin sulfate (mg/ml)
y là giá trị OD tương ứng với nồng độ x

R2 là hệ số tương quan

2.3.5. Phương pháp chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate
Ta có 2 mẫu sau:
Mẫu 1: VLC có độ dày 0,3 cm.
Mẫu 2: VLC có độ dày 0,5 cm.
Sử dụng 2 mẫu trên để thử nghiệm lượng thuốc Neomycin sulfate hấp
thụ vào VLC.
VLC sau khi tinh chế cho vào sấy khô 60%, sau đó để vào bình có chứa
100 ml dung dịch đệm PBS (pH=7,4)[7] chứa thuốc Neomycin sulfate 2
mg/ml và để rung động ở 180 vòng và 400C trong 2 giờ, để vật liệu được hấp
thụ tối đa nhất [15].

16