XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM CHẤT DIỆT CỎ GLYPHOSATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HAI LẦN KHỐI PHỔ LCMSMS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

MAI THỊ NGA LINH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM CHẤT DIỆT CỎ
GLYPHOSATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG
HAI LẦN KHỐI PHỔ LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

MAI THỊ NGA LINH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM CHẤT DIỆT CỎ
GLYPHOSATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG
HAI LẦN KHỐI PHỔ LC-MS/MS

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440112.03
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Từ Bình Minh
TS. Chu Đình Bính

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2017.19
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Từ Bình Minh,
TS. Chu Đình Bính đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, truyền thụ kiến thức khoa
học và hướng dẫn về chuyên môn trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu, tạo mọi
điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các bạn đang học tập và nghiên cứu
tại bộ môn Hóa Phân Tích – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc
Gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có kết quả như ngày hôm nay.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo, các đồng nghiệp tại Trung tâm phân tích và
chứng nhận chất lượng sản phẩm Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện, khích lệ tôi
trong quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên giúp tôi
hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 01 năm 2019
Học viên

Mai Thị Nga Linh


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

IARC

Cơ quan nghiên cứu ung thư Quốc tế

WHO

Tổ chức y tế thế giới

EU

Liên minh châu Âu


EFSA

Ủy ban An toàn thực phẩm Châu Âu

LC

Liquid chromaroghraphy (Sắc kí lỏng)

GC

Gas chromaroghraphy (Sắc ký khí)

UV-Vis

Ultra violet-visible (Tử ngoại khả kiến)

FLD

Fluorescence detector (đầu dò huỳnh quang)

IC

Ion chromatography (Sắc kí ion)

ICP

Inductively coupled plasma (Plasma cảm ứng cao tần)

HILIC
API
APCI

Hydrophilic interation liquid chromatography
(Sắc kí tương tác ưa nước)
Atmospheric pressure ionization
(Ion hóa ở áp suất khí quyển)
Atmospheric pressure chemical ionization
(Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển)

EI

Electron impact (va đập điện tử)

SIM

Selected ion monitoring (Chế độ chọn lọc ion)

MS

Mass Spectrometry (Khối phổ)

GLY

Glyphosate

AMPA

Axit aminomethylphosphonic

GLU

Glufosinate

3PA

3-methylphosphinicopropionic axit

FMOC-Cl

9-flourenylmethylchloroformate

CAN

Acetonitrile

SPE

Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

HLB

Hydrophilic-lipophilic balance


MAX

Mixed-mode anion exchange (Cột đa cơ chế)

CAX

Cột trao đổi cation

NP

Normal phase (pha thường)

RP

Reversed phase (pha đảo)

MRL

Maximum residue level (Giới hạn tồn dư tối đa)

RSD

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

LOD

Limit of detection (giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantification (giới hạn đinh lượng)

MDL
MQL

Method detection limit
(Giới hạn phát hiện của phương pháp)
Method quantification limit
(Giới hạn định lượng của phương pháp)


MỞ ĐẦU
Trong những thập niên vừa qua, nhóm chất diệt cỏ cơ photpho – glyphosate
được sử dụng ngày càng phổ biến. Thuốc diệt cỏ glyphosate được sử dụng lần đầu
tiên vào năm 1974 ở hơn 100 quốc gia trên thế giới. Sở dĩ glyphosate được sử dụng
rộng rãi như vậy là do tính hiệu quả và được cho là an toàn đối với môi trường, hữu

ích trong việc kiểm soát cỏ dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi cũng như
không tồn tại lâu dài. Ngoài ra, thuốc diệt cỏ glyphosate còn là hóa chất có tính hiệu
quả cao và an toàn nhất trong số những hóa chất diệt cỏ được sử dụng trong nông
nghiệp. Nhưng cũng chính vì lý do đó con người đã lạm dụng việc sử dụng thuốc
diệt cỏ glyphosate tràn lan dẫn tới sự biến đổi gen cây trồng kháng glyphosate, cũng
như gia tăng lượng glyphosate trong môi trường đất, nước. Mặc dù glyphosate được
coi như hợp chất ít gây độc đến con người và động vật nhưng những nghiên cứu gần
đây cho thấy dư lượng nhóm chất diệt cỏ glyphosate được tìm thấy trong nhiều loại
mẫu bao gồm cả mẫu thực vật, động vật và con người.
Năm 2012, tòa án Pháp đã buộc tội Mosanto sau trường hợp một nông dân
của họ bị ngộ độc Lasso, một loại thuốc trừ sâu do hãng này sản xuất. Một người
nông dân 47 tuổi đã bị tổn thương thần kinh nghiêm trọng, mất trí nhớ, gần như mất
khả năng lao động do những cơn đau đầu kéo dài triền miên, sau khi hít phải hơi
độc từ loại thuốc trừ sâu độc hại này.
Glyphosate gây rúng động dư luận thế giới từ tháng 3/2015, khi cơ quan
Nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC) trực thuộc tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công
bố kết luận phân loại cho glyphosate thuộc nhóm chất độc 2A, nhóm chất có khả
năng gây ung thư. Điều này gây lên phản ứng mạnh mẽ tại các quốc gia và vùng
lãnh thổ như Mỹ và châu Âu đã cấm sử dụng các chất diệt cỏ họ glyphosate và đưa
ra các tiêu chuẩn cho các chất này trong các đối tượng khác nhau như thực phẩm,
môi trường.
Ngày 27/2/2016, Hà Lan, Thụy Điển cùng Pháp đã mạnh mẽ chống lại việc
tái cấp phép sử dụng thuốc diệt cỏ chứa glyphosate tại châu Âu. Có hơn 1,5 triệu

8


người đã gửi kiến nghị về vấn đề này đến ông Vytenis Andriukaitis, người được chỉ
định phụ trách chính sách y tế và an toàn thực phẩm của EU.
Quốc hội Hà Lan đã bỏ phiếu phản đối việc gia hạn giấy phép sử dụng

glyphosate trong khối EU. Bộ trưởng Môi trường Thụy Điển cho biết sẽ không mạo
hiểm tính mạng của người dân với những rủi to đến từ glyphosate.Thụy Điển sẽ
không bỏ phiếu thuận cho đến khi có các nghiên cứu sâu sắc và các nhà khoa học
của Ủy ban An toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) cần phải minh bạch hơn trong các
nghiên cứu của họ…..
Argentina sau khi WHO chính thức thông cáo về khả năng gây ung thư ở cấp
độ nguy hiểm của glyphosate, hơn 30000 chuyên gia y tế ở Argentina đã cùng yêu
cầu chính phủ nước này ban hành lệnh cấm sử dụng các sản phẩm chứa chất
glyphosate. Trong cuộc khủng hoảng Y tế liên quan đến virut Zika tại nước láng
giềng Brazil, các bác sĩ đã đưa ra những dữ kiện kết nối việc sản xuất những sản
phẩm biến đổi gen với sự tràn lan không kiểm soát của dịch bệnh. Hiện tại, nước
này đang phải chịu gánh nặng từ việc gia tăng tỷ lệ ung thư trên toàn quốc, mà một
trong những lý do hàng đầu trực tiếp đến từ việc sử dụng glyphosate trong nông
nghiệp.
Tại Việt Nam, glyphosate là chất phổ biến trong các loại thuốc diệt cỏ bày bán
tràn lan và cũng là loại hóa chất có trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được cấp
phép sử dụng. Theo thống kê, glyphosate được sử dụng ở Việt Nam tới 30000 tấn
mỗi năm, chiếm 30% lượng thuốc bảo vệ thực vật nói chung và chiếm 60% trong
nhóm thuốc trừ cỏ. Theo ông Hoàng Trung, Cục trưởng Cục Bảo vệ thực vật cho
biết, theo Luật Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật, Cục bảo vệ thực vật đã tiến hành rà
soát lại toàn bộ danh mục thuốc bảo vệ thực vật và xác định các hoạt chất có đầy đủ
bằng chứng về mặt khoa học có gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người, ảnh hưởng
đến môi trường… thì tiến hành loại bỏ khỏi danh mục được phép sử dụng.
Để kiểm soát hàm lượng chất diệt cỏ glyphosate trong môi trường và thực
phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được
nghiên cứu và úng dụng.Trong đó phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép nối hai

9

lần khối phổ LC-MS/MS với độ nhạy và độ chọn lọc cao cho phép phân tích trực
tiếp nhóm hợp chất diệt cỏ glyphosate. Do đó, LC-MS/MS được coi là phương pháp
phân tích có giá trị và cho hiệu quả sử dụng cao.
Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân
tích này, chúng tôi xây dựng phương pháp: “Xác định hàm lượng nhóm chất diệt
cỏ glyphosate bằng phương pháp sắc kí lỏng hai lần khối phổ LC-MS/MS”
Mục tiêu của đề tài nghiên cứu là:

1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất diệt cỏ glyphosate
trong thực phẩm và môi trường, bao gồm:
- Khảo sát các điều kiện phân tích trực tiếp các chất diệt cỏ họ glyphosate
trên máy sắc ký lỏng ghép nối với detector hai lần khối phổ
- Khảo sát và tối ưu các điều kiện xử lý mẫu cho nền mẫu nghiên cứu
- Thẩm định và xác định giá trị sử dụng phương pháp đã đưa ra
2. Áp dụng phương pháp xác định nhóm chất diệt cỏ glyphosate trong mẫu thực
phẩm và môi trường nhằm đánh giá khả năng ứng dụng thực tế của phương
pháp phân tích.

10


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về nhóm chất diệt cỏ glyphosate
1.1.1. Giới thiệu chung
Chất diệt cỏ họ glyphosate bao gồm glyphosate (GLY) và các dẫn xuất của nó như
axit

aminomethylphosphonic

(AMPA),

glufosinate

(GLU),

3-

methylphosphinicopropionic axit (3PA)… là các hợp chất cơ photpho. Glufosinate
là một hợp chất thường được phun kết hợp với glyphosate trong các thuốc diệt cỏ có
glyphosate trên thị trường. Sau khi phun vào đất, glufosinate bị chuyển hóa thành
3PA. Glyphosate được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp như một chất bảo vệ mùa
màng, chất diệt cỏ. Nó được nhà hóa học John E.Franz của hãng Mosanto khám phá
là một loại thuốc diệt cỏ vào năm 1970. Mosanto mang nó ra thị trường vào năm
1974 dưới tên thương mại là Roundup. Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm
nghiên cứu đến glyphosate và các chất chuyển hóa thường gặp của nó.

Hình 1.1 Cấu tạo của glyphosate và các dẫn xuất của nó (a)-glyphosate, (b)- axit
aminomethylphosphonic, (c)-glufosinate và (d)- 3-(methylphosphinico)propionic

11


1.1.2. Tính chất của nhóm chất diệt cỏ glyphosate
Thuốc diệt cỏ glyphosate là chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy vào
khoảng 230oC, ở 25oC glyphosate có độ hòa tan trong nước là 1,2%. Chúng cũng là
nhóm hợp chất có phân tử lượng nhỏ, độ phân cực cao, có khả năng tan tốt trong
nước và ít tan trong dung môi hữu cơ. Ngoài ra, glyphosate có cấu trúc tương tự
như những thành phần có trong cây như amino axit nên sẽ gây nhiễu trong quá trình
phân tích.
Glyphosate là thuốc trừ cỏ có phổ tác dụng rộng, diệt trừ được hầu hết các

loại cỏ đa niên và cỏ hàng niên. Đặc biệt thuốc trừ cỏ có hiệu quả cao và kéo dài đối
với một số loại cỏ khó trừ như cỏ tranh, lau sậy, cỏ ống. Glyphosate thuộc nhóm
thuốc trừ cỏ gốc lân hữu cơ do công ty Mosanto (Mỹ) phát minh và sản xuất từ năm
1974. Thuốc có nhiều tác dụng đến hoạt động sinh hóa của cỏ dại thông qua việc ức
chế sự hình thành men (enzyme) giúp cỏ tổng hợp amino axit như enol peruvyl
shikimate-3-phosphate và gây phá vỡ hình thành các men khác gồm phenylanilinelyase trong quá trình tổng hợp protein. Thuốc bị keo đất hấp thụ và bị nhiều
loại vi sinh vật phân hủy trong thời gian ngắn, chỉ tác dụng trên các phần non của
thực vật mà không ảnh hưởng đến rễ và các bộ phận già. Glyphosate có tác động
dẫn lưu, có thể xâm nhập vào bên trong thân qua bộ lá và các phần xanh của cây cỏ
rồi di chuyển đến tất cả các bộ phận của cây (kể cả rễ và thân ngầm) nên diệt cỏ rất
triệt để và hữu hiệu trong việc ngăn cản cỏ mọc trở lại.
Nhược điểm của glyphosate là có tác dụng diệt cỏ chậm, cỏ hàng niên sau
phun thuốc 4-5 ngày và cỏ đa niên sau phun thuốc 7-10 ngày cỏ mới chết.
Glyphosate là thuốc trừ cỏ không chọn lọc, ngoài tác dụng diệt được rất nhiều loại
cỏ, nếu thuốc không bám được vào lá hoặc những bộ phận xanh của cây trồng thì
thuốc diệt cả cây trồng.
Glyphosate được lưu hành trên thị trường với các tên thương phẩm khác
nhau như sau: Roundup 48 WSC (410 gam glyphosate/ lít), Sprark 160 WSC (160
gam glyphosate/ lít), Wallop 34,5 WSC (glyphosate + dicamba), Scout (glyphosate
+ pichloram), Nufarm 480SL (410 gam glyphosate/ lít).Trường hợp phơi nhiễm

12


thuốc diệt cỏ dẫn đến tử vong ở Quảng Ngãi ngày 25/03/2012 là ví dụ điển hình.
Phơi nhiễm thuốc diệt cỏ làm sảy thai và bị mờ mắt người dân do phun thuốc diệt
cỏ KANUP 480SL có hoạt chất glyphosate IPA Salt 480gam/lít để trồng mì tại xã
Sơn Kỳ, huyện Sơn Hà (Quảng Ngãi). Do sử dụng thuốc diệt cỏ phục vụ sản xuất
nhưng quá trình sử dụng không đúng quy trình kỹ thuật, khi bơm thuốc không có
phương tiện bảo hộ lao động, không đeo khẩu trang để che chống thấm vào cơ thể,

làm ảnh hưởng đến sức khỏe.
Độc tính của chất diệt cỏ glyphosate đối với con người và động vật LD 50 cấp
tính là 4900 mg/kg. Đối với trường hợp glyphosate xâm nhập qua đường nước uống
vào cơ thể, thường là trong vòng 15 phút sau khi uống có thể gây nôn mửa, đau cổ
họng, có các triệu chứng đau bụng, tiêu chảy…
1.1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL)
Giới hạn tồn dư tối đa (Maximum Residue Level: MRL) là hàm lượng tối đa
được cho phép hoặc có thể chấp nhận được trong nông sản, thức ăn, mẫu môi
trường mà không gây hại cho người sử dụng, vật nuôi khi sử dụng.
Bảng 1.1.Giới hạn cho phép của glyphosate và AMPA ở Việt Nam [8]
Loại
Cây ngô
Cây đậu tương khô
Cây đậu tương (tươi)
Rơm và rạ (khô) của cây ngũ cốc
Cỏ khô hoặc các loại cây thân cỏ (khô)
Bột mì
Lúa mì xay nguyên hạt
Cám lúa mì chưa chế biến
Quả Kiwi
Lúa mạch
Ngô
Yến mạch
Gạo
Lúa miến
Lúa mì
Sữa gia súc
Thịt gia súc
Thịt lợn

13

mg/kg
1
200
5
100
50
0.5
5
20
0,1
20
1
20
0,1
20
5
0,1
0,1
0,1


Phụ phẩm ăn được của gia súc
Phụ phẩm ăn được của lợn
Dầu hạt bông thô
Dầu hạt bông ăn được
Trứng
Thịt gia cầm
Hạt cải dầu

Hạt bông
Đậu (khô)
Đậu Hà lan (khô)
Hạt đậu tương (khô)
Ngô ngọt (ngô cả lõi)
Đậu tương (hạt non)

2
1
0,05
0,05
0,1
0,1
10
10
2
5
20
0,1
0,2

Bảng 1.2. Giới hạn cho phép của glufosinate và 3PA ở Việt Nam [8]
Loại
Cây ngô

mg/kg
0,2
0,1
0,1
0,5

0,1
0,2
0,05
0,05
0,05
0,1
0,05
0,05
5
5
0,05
3
2
2
0.1
0,05
0,05
0,05
0,5
0,05
0,05

Lá hoặc ngọn cây củ cải đường
Quả mọng và các loại quả nhỏ khác
Quả nho Hy lạp (đen, đỏ, trắng)
Quả họ cam quýt (quả có múi)
Quả chuối
Quả Kiwi
Quả dạng táo
Quả có hạt (stone fruits)

Ngô
Dầu hạt cải dầu thô
Dầu hạt hướng dương thô
Hạt cải dầu
Hạt hướng dương
Củ hành tây
Đậu Hà Lan (khô)
Đậu tằm (khô)
Đậu nói chung (khô)
Hạt đậu tương (khô)
Ngô dùng làm salat (corn salad)
Đậu nói chung (vỏ và/hoặc hạt non)
Củ cà rốt
Củ khoai tây
Củ cải đường (sugar beet)
Măng tây

14


Bảng 1.3. Giới hạn glyphosate của các nước trên thế giới [19]
STT

Quốc gia

1
2
3

EU

Nhật
Mỹ

Giới hạn tồn dư
trong thực phẩm
(mg/kg)
0,1
0,2
0,2

Giới hạn tồn dư
trong nước (µg/L)
0,1
700

1.2. Các phương pháp xác định nhóm chất diệt cỏ glyphosate
Từ tính chất hóa học và hóa lý của glyphosate và các dẫn xuất của nó, khi
thực hiện phân tích glyphosate và các dẫn xuất của nó gặp phải một số khó khăn
sau: glyphosate và các dẫn xuất của nó là các hợp chất phân cực mạnh, do đó các
hợp chất này hầu như không bị lưu giữ trên cột tách sắc ký thông dụng, đặc biệt là
cột tách pha đảo. Bên cạnh đó, trong cấu trúc của glyphosate và các dẫn xuất của nó
không chứa nhóm mang màu và nhóm trợ màu, do đó các phương pháp sắc ký với
detector thông dụng như UV-Vis không thể sử dụng cho phân tích trực tiếp các chất
này. Thêm vào đó, nồng độ của glyphosate và các dẫn xuất trong các đối tượng mẫu
sinh học và môi trường thường rất thấp, trừ một số trường hợp đặc biệt. Glyphosate
và các dẫn xuất của nó cũng là những chất rất dễ bị chuyển hóa. Do đó, các phương
pháp phân tích glyphosate và các dẫn xuất của nó tập trung chủ yếu vào hai phương
pháp phân tích sắc ký khí và sắc ký lỏng sử dụng các detector khác nhau. Trong
phần tiếp theo sẽ trình bày chi tiết về các phương pháp này dùng cho phân tích
glyphosate và các dẫn xuất chính của nó.

1.2.1. Phương pháp sắc kí khí GC-MS
Sắc ký khí (GC – Gas chromatography) là một quá trình tách các chất trong
một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí. Trong kỹ thuật sắc ký khí, người ta có pha tĩnh
(chất nhồi cột) và pha động được gọi là khí mang. Chất mang hay pha động (MP –
mobile phase) để chạy sắc ký ( rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách) là một chất
khí hay hỗn hợp của hai chất khí được trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp, còn chất
mẫu có thể là ở trạng thái khí hay trạng thái lỏng hoặc rắn [3].

15


Pha tĩnh trong kỹ thuật tách GC có thể là chất rắn hay chất lỏng. Pha tĩnh rắn
thường là các hạt rắn và xốp có cỡ hạt 3-5µm, độ xốp Sxốp từ 200-350m2/g, chịu
nhiệt cao (đến 450oC) và trơ với các chất khí nito, hydro, heli, argon, metan và oxi.
Đây là loại pha tĩnh phổ biến của GC. Nó được nhũ hóa bằng một hỗn hợp dung
môi thích hợp dễ bay hơi thành một hỗn hợp huyền phù và người ta dùng phương
pháp hút chân không để kéo pha tĩnh vào ống mao quản. Sau đó đem sấy khô trong
tủ sấy chân không, như thế dung môi sẽ bay hơi hết và để lại lớp pha tĩnh bám vào
thành ống mao quản tạo ra cột sắc ký mao quản. Pha tĩnh lỏng thường là các loại
dầu silicon có độ nhớt cao, có tính chất sắc ký chiết, cũng chịu nhiệt (250 oC) và nó
được giữ trong cột tách (ống mao quản) nhờ các hạt chất mang trơ không có tính
chất sắc ký. Như vậy pha tĩnh ở đây là các màng mỏng bám xung quanh hạt chất trơ
có bề dày từ 5-10 µm gắn trên thành ống mao quản tạo ra pha tĩnh và nó làm nhiệm
vụ sắc ký [3].
Pha động trong kỹ thuật tách GC thường là các chất khí. Pha động này có thể
là các khí đơn như nito, heli, argon, hydro hoặc hỗn hợp khí như (Ar và 5% CH 4)
hay (không khí + H2). Pha động để giải hấp chất phân tích ra khỏi cột tách khi chạy
sắc ký [3].
Như đã trình bày trong phần trên, glyphosate và dẫn xuất của nó là hợp chất
rất phân cực và không bay hơi, do đó không thể phân tích trực tiếp bằng GC. Vì

vậy, các hợp chất này được dẫn xuất hóa bằng các tác nhân dẫn xuất hóa thích hợp
để chuyển thành các hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt. Một trong những tác nhân
hiệu quả sử dụng cho phản ứng dẫn xuất hóa glyphosate là heptafluorobutanol và
anhydric trifluoroacetic dựa trên phản ứng tạo este sau:
F 3C

O
O

O
P
HO
HO

O

O

NH

TFAA / TFE
OH

CF 3

P

O
O

CF 3

16

N
O

F3C


Phương pháp phân tích glyphosate và AMPA bằng sắc ký khí kết hợp đầu dò
khối phổ GC/MS được báo cáo bởi sự hợp tác nghiên cứu của các nhà khoa học
L.Anderson, O. Bennett, M. Bosch….[30]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp
tiêu chuẩn để phân tích hàm lượng glyphosate và APMA trong mùa vụ bằng hệ
thống sắc kí khí GC/MS [11], nghiên cứu được thực hiện tại 13 phòng thử nghiệm
đặt tại 5 quốc gia, trong đó có 12 phòng thử nghiệm báo cáo lại kết quả nghiên cứu.
Thí nghiệm được bố trí trên mẫu mù (được mã hóa ở mức độ phòng thử
nghiệm), sẽ có 4 mẫu được phân tích (bao gồm 3 mẫu đã được thêm chuẩn và 1
mẫu kiểm soát) trên 3 nhóm nền mẫu, tổng sẽ có 21 mẫu được kiểm tra trong một
phòng thử nghiệm. Ba loại nền mẫu là ngô, đậu nành và quả óc chó được lựa chọn
dựa trên một số tiêu chí như sau: Đậu nành được lựa chọn do là một loại cây có chất
diệp lục cao, nhiều chất xơ và được sử dụng phổ biến. Ngô được lựa chọn dó nó có
hàm lượng tinh bột cao và có mặt một số loại dầu thực vật, đây cũng là một loại cây
trồng được sử dụng phổ biến. Loại cây trồng thứ ba được lựa chọn là hạt óc chó, do
nó có hàm lượng dầu thực vật cao.
Trong phương pháp nghiên cứu này, glyphosate và AMPA trong các mẫu
được chiết với nước.Mẫu chiết ban đầu được thêm metylchlorua (CH 3Cl) để loại bỏ
các hợp chất không phân cực, sau đó được làm sạch trên cột trao đổi cation (CAX).
Một lượng mẫu chiết sạch được dẫn xuất hóa trực tiếp với hỗn hợp trifluoroacetic
anhydride và heptafluorobutanol để tạo thành este heptafluorobutyl có các nhóm

chức axit và dẫn xuất trifluoroacetyl của các amin. Quá trình tạo dẫn xuất trực tiếp
của dịch chiết được thực hiện bằng cách pha chế thuốc thử tạo dẫn xuất trước khi
thêm một lượng nhỏ dịch chiết. Các dẫn xuất lúc này có khối lượng lớn được phân
tích bằng sắc kí khí GC sử dụng cột tách mao quản và được xác định khối phổ sử
dụng chế độ đo chọn lọc ion.
Nghiên cứu được thực hiện trên một số lượng mẫu lớn với ba loại nền mẫu
chính đã đề cập, sử dụng khối phổ với nhiều mảnh ion con m/z để khẳng định
không có các chất tương tự glyphosate và APMA, cũng như để xác nhận không có
các chất cùng tính chất với glyphosate và AMPA có thể tạo ra ion con m/z tương tự.

17


Ngoài ra, nghiên cứu này cũng sử dụng hai hệ thống GC/MS với các cột từ hai nhà
sản xuất khác nhau và hai cấu hình nhiệt độ lò khác nhau để đảm bảo không có các
chất có tính chất tương tự gây ảnh hưởng và cản trở đến quá trình phân tích khi sử
dụng một hệ thống GC/MS.
Phương pháp sắc ký khí sử dụng cột mao quản với chương trình nhiệt độ
thích hợp [11]. Hệ thống phân tích gồm một bộ lấy mẫu tự động, cột phân tích 0,25
mm x 30 m, là cột mao quản được phủ một lớp silica có độ dày 0,5 µm. Tốc độ khí
mang là 30 cm/s ở nhiệt độ 180oC, tương đương với áp suất khoảng 40-50 kPa (6-7
psi) nén ở đầu cột. Chương trình nhiệt độ được cài đặt như sau: giữ nhiệt độ ở 90 oC
trong vòng 1,5 phút, sau đó tăng lên 300 oC với tốc độ cứ 30oC/ phút (hoặc tốc độ
20oC/phút tùy thuộc vào khả năng của thiết bị phân tích) và giữ nhiệt độ 300 oC
trong vòng 4 phút. Một chương trình nhiệt độ khác có thể được thay thế để tăng độ
phân giải như sau: giữ nhiệt độ ban đầu ở 60 oC trong vòng 1,5 phút, sau đó tăng
nhiệt độ lên 120oC với tốc độ 10oC/phút, giữ nhiệt độ 120oC trong vòng 1 phút, rồi
tăng lên 300oC với tốc độ 30oC/phút và giữ nhiệt độ ở 400oC trong vòng 4 phút.
Thiết lập nhiệt độ van bơm mẫu ở 200 oC, nhiệt độ nguồn ion hóa là 280 oC, thể tích
bơm mẫu từ 2-5µL phụ thuộc vào khả năng phát hiện chất phân tích của thiết bị.

Van bơm mẫu được cài đặt theo chế độ không phân chia dòng (splitless mode) được
làm sạch 1 phút sau khi tiêm mẫu. Phương pháp phân tích có thể được tối ưu hóa
bằng cách điều chỉnh nhiệt độ lò ban đầu trong khoảng từ 60 oC – 90oC, các biến số
khác cũng được điều chỉnh để phù hợp như chương trình nhiệt độ và thời gian lưu.
Chế độ bắn phá ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI – electron impact) được
áp dụng kết hợp với chế độ chọn lọc ion (SIM- selected-ion monitoring) cho kết quả
ion m/z với dẫn xuất của glyphosate là 611,5, với dẫn xuất của AMPA là 446.
Thực hiện kiểm tra với các nền mẫu như hạt ngô, đậu nành, quả óc chó tại
các hàm lượng 0,05 mg/kg, 0,4 mg/kg, 2 mg/kg. Nghiên cứu này cũng thực hiện
phân tích các mẫu mù (mẫu được mã hóa theo cấp độ phòng thí nghiệm), bố trí thí
nghiệm với 12 mẫu được phân tích bao gồm 01 mẫu kiểm soát và 03 mẫu mù được

18


mã hóa theo phòng thí nghiệm trên ba nền mẫu là hạt ngô, đậu nành và quả óc chó,
mỗi mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ khác nhau.
Việc phân tích các mẫu có hàm lượng cao thường ít gặp khó khăn hơn so với
các mẫu có hàm lượng có nồng độ thấp do độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp
và thiết bị, vì vậy nghiên cứu đã tập trung vào việc phân tích mẫu có mức dư lượng
thấp và trung bình. Đối với các trường hợp mẫu có nồng độ phân tích cao sẽ được
pha loãng để phù hợp với khoảng tuyến tính.
Kết quả thu được đối với glyphosate là: độ thu hồi trung bình đạt 91%, độ
lệch chuẩn tương đối RSD là 11% đối với phép thử thực hiện trong cùng một phòng
thí nghiệm và độ lệch chuẩn tương đối RSD là 16% đối với phép thử thực hiện liên
phòng. Kết quả thu được đối với AMPA là: độ thu hồi trung bình đạt 87%, độ lệch
chuẩn tương đối RSD là 16% và 25% đối với phép thử thực hiện trong cùng phòng
thí nghiệm và thực hiện liên phòng.
Bên

cạnh

đó,

một

tác

nhân

dẫn

xuất

hóa

khác

là

N,O-

bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) cũng được nghiên cứu cho phản ứng
dẫn xuất hóa glyphosate dựa trên phản ứng tạo thành dẫn xuất trimetysilan của
glyphosate và AMPA trong sự có mặt của trimethylchlorosilane đóng vai trò như
một chất xúc tác [33]. Phản ứng tạo dẫn xuất và phổ khối lượng (phổ khối lượng với
nguồn va chạm electron) của glyphosate và AMPA được trình bày trong Hình 1.2
dưới đây
OH

O
NH

HO

P

BSTFA, TMCS / Pyridine

OH

TMSO
O

O

TMS
N

O
P

OTMS

OTMS

Hình 1.2. Phản ứng tạo dẫn xuất của glyphosate với BSTFA

19

Hình 1.3. Phổ khối lượng của dẫn xuất tạo bởi glyphosate và BSTFA
HO
HO

P

NH2

BSTFA, TMCS / Pyridine

TMSO
TMSO

O

P
O

Hình 1.4. Phản ứng tạo dẫn xuất của AMPA với BSTFA

20

NH-TMS


Hình 1.5. Phổ khối lượng của dẫn xuất tạo bởi AMPA và BSTFA
Các điều kiện cho phản ứng dẫn xuất hóa được khảo sát và tối ưu hóa như tỉ
lệ chất dẫn xuất hóa, pH của phản ứng dẫn xuất hóa và dung môi phản ứng. Kết quả
thực nghiệm chỉ ra rằng điều kiện là dung môi phản ứng là pyridine, tỉ lệ 60 :100 µL

pyridine : BSTFA và pH= 6 là tối ưu nhất. Các sản phẩm dẫn xuất hóa được phân
tích bằng GC-MS sử dụng cột tách DB 5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) sử dụng
chương trình nhiệt độ. Các chất phân tích được đo ở chế độ đo chọn lọc các mảnh
ion đặc trưng của chất phân tích sau khi dẫn xuất hóa. Tuy nhiên, phương pháp trên
chỉ ứng dụng cho nghiên cứu phản ứng dẫn xuất hóa mà không áp dụng vào phân
tích mẫu thực. Do đó, các thông tin về giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
không được đề cập trong nghiên cứu này.
1.2.2. Phương pháp sắc kí lỏng
Như đã trình bày trong phần trên, glyphosate và các dẫn xuất của nó là các
hợp chất phân cực mạnh, do đó nó hầu như không lưu giữ trên cột tách sắc ký thông
thường, ví dụ như cột tách pha đảo. Hiện nay, hầu hết các hướng phân tích đều tập
trung vào phản ứng tạo dẫn xuất của glyphosate với các tác nhân thích hợp nhằm

21


cải thiện khả năng tách sắc ký cũng như cải thiện về độ nhạy, độ chọn lọc của
phương pháp phân tích. Tổng quan về các phương pháp dẫn xuất hóa của
glyphosate và các chất dẫn xuất hóa của nó được trình bày chi tiết trong một bài báo
tổng quan gần đây [32].
1.2.2.1.Phương pháp sắc kí lỏng sử dụng detector UV-Vis
Phương pháp dẫn xuất hóa tạo hợp chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong
vùng UV-Vis được miêu tả chi tiết trong nghiên cứu của Maxin V. Khrolenko và
đồng nghiệp [27]. Phương pháp sử dụng kỹ thuật màng lỏng hỗ trợ (SLMsupported-liquid membrane) để chiết glyphosate và các dạng chuyển hóa của nó từ
đồ uống (nước hoa quả như nước cam, nho, táo, quả lý chua đen…), kết hợp với
đầu dò HPLC-UV sau khi đã dẫn xuất hóa với p-toluenesulphonyl chloride (TsCl).
Sử dụng kỹ thuật màng lỏng hỗ trợ SLM có thể được coi như là thay thế cho
tiền xử lý mẫu chất lỏng chứa thuốc diệt cỏ, đây là một phương pháp chiết xuất và
tiền cô đặc hiệu quả cho glyphosate và AMPA từ chất lỏng phức tạp, chẳng hạn như
mẫu nước ép trái cây. Kết hợp với việc tạo dẫn xuất và sử dụng hệ thống HPLC-UV,

nó áp dụng quy trình đơn giản để phân tích các hợp chất này. Đồng thời, việc áp
dụng kỹ thuật SLM còn có hiệu quả trong việc loại bỏ một số lượng lớn các hợp
chất gây nhiễu và làm giàu chất phân tích.
SLM là màng polyme xốp kỵ nước, có chứa dung môi hữu cơ trong các lỗ
màng. Cơ chế của màng SLM được tách ra thành hai pha: pha hỗ trợ nước và pha
nhận nước. Trong quá trình chiết mẫu chất lỏng xảy ra đồng thời cả ba bước: chiết
hợp chất vào pha dung môi hữu cơ, chuyển hợp chất qua màng và chiết lại trong
pha nhận. Một trong những lợi thế chính của kỹ thuật SLM là đồng thời chiết và
làm sạch hợp chất cần phân tích. Sau khi ứng dụng kỹ thuật SLM, các yếu tố làm
giàu và giới hạn của kỹ thuật này được đánh giá tương đương với các kỹ thuật chiết
khác, thậm chí trong một số trường hợp sử dụng kỹ thuật SLM sẽ cho mẫu chiết
sạch hơn nhiều so với các kỹ thuật chiết truyền thống.
Thực hiện thí nghiệm với các mẫu được thu thập và bảo quản trong chai
nhựa. Trước mỗi thí nghiệm làm giàu mẫu, dung dịch HCl 0,1M được bơm vào

22


kênh nhận, đồng thời với việc bơm nước vào pha hỗ trợ để kiểm tra độ ổn định của
màng. Màng được coi như là ổn định khi pH đạt trung tính. Cho 100 ml mẫu phân
tích bơm qua pha hỗ trợ, sau khi chiết xuất, lấy 1ml mẫu phân tích ở pha nhận để
tạo dẫn xuất. Trong trường hợp pha nhận là axit, mẫu phân tích được trung hòa tới
pH=7 với KOH đặc trước khi đem đi dẫn xuất. Riêng đối với các mẫu nước trái cây,
trước khi sử dụng kỹ thuật SLM, được ly tâm ở tốc độ 15000 vòng/phút ở 20 oC
trong vòng 10 phút đến khi loại bỏ các hạt rắn. Mẫu sau khi ly tâm được lọc qua bộ
giấy lọc và được xử lý bằng quy trình tương tự khi áp dụng kỹ thuật SLM. Dẫn xuất
hóa 1ml mẫu từ pha nhận bằng cách trộn với 0,5ml dung dịch đệm photphat 0,5M
(pH=11) và 0,2 ml p-toluenesulphonyl, dung dịch clorua (10mg/ml trong
acetonitrile) và duy trì trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50 oC trong 10 phút. Mẫu phân
tích sau khi dẫn xuất hóa được phân tích bằng HPLC sử dụng đầu dò UV-Vis, chế

độ chạy đẳng dòng sử dụng cột C18 250x 4,6mm. Pha động sử dụng là hỗn hợp
dung dịch đệm KH2PO4 0,06M (được điều chỉnh về pH=2,3 bằng H 3PO4) và
acetonitrile (tỉ lệ 85/15, v/v). Tốc độ dòng là 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là
20 µl, bước sóng hấp thụ là 240 nm.
Khoảng tuyến tính cho cả glyphosate và AMPA là 0,025-10 mg/L với hệ số
hồi quy 0,9998; giới hạn phát hiện là 0,01 mg/L. Độ thu hồi của glyphosate là
71,1%; 72,1%; 93,6% và 102,7%, độ thu hồi của AMPA là 64,1%; 64,6%; 81,7% và
89,2% tương ứng với các loại nước ép của cam, bưởi, táo và quả lý chua đen.
1.2.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng dùng detector huỳnh quang
Do đặc tính ion và tan nhiều trong nước của glyphosate và các dạng chuyển
hóa nên phương pháp sắc kí lỏng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp sắc kí khí. Do
trong thành phần hóa học của nó không có những nhóm chức thích hợp cho việc
phân tích bằng UV hoặc huỳnh quang nên glyphosate và dẫn xuất của nó cần được
tạo dẫn xuất với 9-flourenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) để tạo ra hợp chất
huỳnh quang đồng thời làm giảm độ phân cực của nó để có thể phân tích được bằng
phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS.

23


Hình 1.6. Dẫn xuất hóa của glyphosate và FMOC-Cl

Hình 1.7. Dẫn xuất hóa của AMPA và FMOC-Cl

Hình 1.8. Dẫn xuất hóa của glufosinate và FMOC-Cl
Thực hiện thí nghiệm phân tích nhóm chất diệt cỏ glyphosate trên nền mẫu
nước môi trường [17] bằng cách tạo dẫn xuất hóa với FMOC-Cl sau đó đem phân
tích bằng hệ thống sắc ký lỏng kết hợp đầu dò huỳnh quang LC-FLD.
Phương pháp sử dụng cột sắc ký có thông số 200mm x 4,6mm, pha động sử
dụng dung môi gồm 85% KH2PO4 và 1,5% NaOH 3M, 15% acetonitril, tốc độ dòng

0,5ml/phút, thời gian chạy cho một lần phân tích là 16 phút. Đầu dò huỳnh quang có
bước sóng kích thích Ex là 265 nm, bước sóng phát xạ Em là 310 nm.
Khoảng tuyến tính của phương pháp là 0,00075-0,0125 g/ml, giới hạn phát
hiện đối với glyphosate và AMPA là 0,03 g/L. Các kết quả thử nghiệm cho thấy khả
năng loại bỏ nhiễu nền của AMPA nằm trong khoảng 68,33-73,66%, của glyphosate
là 28,65-31,85%. Điều này được giải thích do AMPA có một nguyên tủ nitơ chính

24


và nó sẽ phản ứng dễ dàng với hợp chất huỳnh quang FMOC-Cl, do đó khả năng
khử hóa sẽ cao hơn so với glyphosate.
1.2.2.3.Phương pháp sắc ký lỏng dùng detector huỳnh quang kết hợp khối phổ
LC-FLD-MS
Nhóm các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích
nhóm chất glyphosate và AMPA trong mẫu huyết tương chuột sử dụng hệ thống
ghép nối LC-FLD-MS [21]. Mẫu huyết tương sau khi kết tủa protein với
acetonitrile, 100 µL lớp dịch phía trên được tạo dẫn xuất trước cột với 100 µL
FMOC-Cl 10 mM và 100 µL đêm borac (1,25 mM, pH=9) tại nhiệt độ phòng trong
30 phút, sau đó được phân tích trên cột pha đảo có kích thước 250 mm x 4,6 mm.
Hệ thống LC-FLD-MS được sử dụng bao gồm bộ khử khí chân không, máy bơm
dung môi, bộ lấy mẫu tự động, một máy huỳnh quang FLD và một bộ phân tích
khối phổ MS tứ cực với buồng hóa hơi chế độ quét ion điện tử ESI. Nghiên cứu tối
ưu hóa pha động gồm kênh A chứa ammonium formate trong nước (HCOONH 4 20
mM, pH=8,5) và kênh B chứa acetonitrile, tốc độ dòng là 1 ml/phút ở chế độ
gradient như sau: từ 0-5 phút (A-B, 85:15, v:v); từ 5-10 phút (A-B, 78:22,v:v); từ
10-13 phút (A-B, 76:24, v:v); từ 13-18 phút (A-B, 50:50, v:v); từ 18-22 phút (A-B,
0:100, v:v); từ 22-30 phút (A-B, 85:15, v:v), thời gian tách chất là 5 phút. Thể tích
bơm mẫu là 30 µL (tốc độ hút mẫu là 50 µL/ phút), nhiệt độ được chọn là 45oC.Đối
với glyphosate và AMPA, bước sóng kích thích tương ứng lần lượt là là 240 nm và

250 nm, bước sóng phát xạ tương ứng lần lượt là 320 nm và 620 nm.
Phương pháp này đạt độ chính xác cho phân tích glyphosate và AMPA trong
ngày và phân tích mẫu liên ngày lớn hơn 9% đối với cả hai máy dò FLD và MS.
Đối với cả hai hợp chất glyphosate và AMPA, độ chính xác dao động từ 2,1% đến
7,8% cho các giá trị phân tích trong cùng một ngày, từ 4,1% đến 8,6% cho các giá
trị phân tích liên ngày. Hiệu quả chiết (độ thu hồi) của glyphosate đạt từ 87%-93%,
của AMPA đạt từ 76%-88%. Giới hạn định lượng cho glyphosate và AMPA lần lượt
là 5 ng/ml và 10 ng/ml với đầu dò FLD; 0,4 ng/ml và 2 ng/ml với đầu dò ESI-MS.

25