Phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang

Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

MỞ ĐẦU
Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh.
Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại
thực phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và
vitamin tan trong nước. Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng
nhưng chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người. Vitamin
thúc đẩy quá trình trao đổi chất và là thành phần không thể thiếu được trong
cấu tạo của nhiều loại enzyme. Do đó vitamin đóng vai trò như những chất
xúc tác.Trong các loại vitamin thì vitamin B
2
(Riboflavin) giữ vai trò quan
trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể. Vitamin B
2
có nhiều trong các sản
phẩm từ sữa, men bia, thịt, gan, trứng, rau xanh và các sản phẩm từ cá.
Các phương pháp định lượng vitamin B
2
hầu hết chỉ tiến hành bằng
phương pháp hóa học, vì phương pháp sinh học phụ thuộc một cách đáng kể
vào tính chất của động vật và tương đối ít chính xác. Trong các phương pháp
lý học có thể dùng chủ yếu là phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tử
ngoại và phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B
2
.
Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự phân công của giáo viên
hướng dẫn, em đã tiến hành tìm hiểu “ Phương pháp xác định hàm lượng
vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang”.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
1

Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Phần I
Tổng quan
1.1. Giới thiệu chung về vitamin
1.1.1. Định nghiã
Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với số
lượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể người
cũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyển
hóa khác nhau.
1.1.2. Phân loại
Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm:
- Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C
- Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E,
vitaminK
1.1.3. Vai trò của vitamin
Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơ
thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin. Các động vật cũng như con
người không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồng
hóa. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn. Do vậy, cơ thể có thể thừa
hay thiếu vitamin. Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì
sẽ mắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh…
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
2
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Ngược lại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào
thải ra ngoài.
1. 2. Vài nét về vitamin B
2

1.2.1. Lịch sử
Vitamin B2 được khám phá vào năm 1920 và lần đầu tiên vitamin B2
được tách từ trứng vào năm 1933. Lúc đầu, nó có tên là ovoflavin, sau đó
được các nhà khoa học Booher, Elliger, Koschara tách được viboflavin từ
casein. Vì vậy nó mang tên là lactoflavin. Tới năm 1935 Karrer và các cộng
tác viên đã tổng hợp được hàng loạt các dẫn xuất có cấu tạo 6,7 dimetyl-9-
isoaloxazin tương ứng đúng với lactoflavin tách được từ các nguyên liệu
thiên nhiên.
1.2.2. Cấu tạo và tính chất
1.2.2.1. Cấu tạo
Trong cấu tạo của vitamin B2, có 2 phần tách biệt : một hợp chất
đường Ribose và một công thức 3 vòng nhân.
Công thức thô của riboflavin : C
17
H
20
N
4
O
6

Tên khoa học là : 6,7 di metyl-9-isoaloxazin
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
3
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.2.2.2. Tính chất
- Phân tử khối : 367,4
- Nhiệt độ nóng chảy : 274-282

o
C
- Độ hòa tan : Trong nước ở 25
o
C : 0,012g trong 100ml. Trong cồn
etylic tuyệt đối : 0,045g trong 100ml. Không tan trong ete, benzen, hexan.
- Vitamin B
2
tồn tại dạng tinh thể hình kim, màu vàng da cam, có
huỳnh quang màu vàng xanh khi chiếu tia tử ngoại vào.
- Tinh thể khô, có vị đắng, bền với nhiệt và dung dịch axit.
- Vitamin B
2
rất quan trọng đối với cơ thể , trong cơ thể vitamin B
2
dễ
bị phosphoryl hóa tạo nên nhóm hoạt động của các enzym xúc tác cho các
quá trình oxi hóa - khử.
- Vitamin B
2
không bền với ánh sáng. Khi tiếp xúc với ánh sáng làm
mất hoạt tính, nên bảo quản vitamin B
2
hạn chế tiếp xúc ánh sáng, dùng lọ
màu nâu để bảo quản.
- Riboflavin tương đối bền trong môi trường axit, nhưng lại dễ bị phá
hủy nhanh trong môi trường kiềm, thuốc thử KMnO
4
.
- Các chất khử như H hoạt tính, NaHSO

4
, TiCl khử nó một cách thuận
nghịch thành hợp chất leuco.
- Môi trường kiềm phần lớn tạo ra lumiflavin, môi trường axit tạo ra
lumicrom.
- Vitamin B
2
được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
4
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.2.3. Vai trò của vitamin B
2
đối với sức khoẻ con người
- Vitamin B2 tham gia vào cấu trúc của enzym dehydrogenase hiếu
khí (men vàng) ở dạng flavinmononucleotid (FMN) và flavin
adenozindinucleotid ( FAD). Hai dẫn xuất này chính là xúc tác cho phản ứng
chuyển vị hydro trong quá trình hô hấp của tế bào. Vì vậy thiếu vitamin B2
thì khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào biểu bì ruột bị rối loạn dẫn
đến chảy máu đường ruột. Các quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể xấu đi
và xuất hiện các triệu chứng rối loạn dẫn đến tình trạng nở miệng, long
móng, thiếu máu, rụng tóc.
- Vitamin B2 cần thiết để nâng cao sức đề kháng cơ thể sống đối với
bệnh nhiễm trùng, để làm tăng tốc độ tái tạo máu cũng như ảnh
hưởng đến sự phát triển của bào thai.
- Ngoài ra, cùng với vitamin PP, vitamin A, vitamin B2 tham gia
quá trình cảm nhận ánh sáng của mắt.
1.2.4. Nhu cầu
Nhu cầu vitamin B

2
phụ thuộc vào điều kiện nghề nghiệp, vào trạng
thái sinh lý của cơ thể, vào lứa tuổi. Trung bình người lớn cần 1,8-
2,0mg/24h ; trẻ em cần 0,5-1,5mg/24h ; phụ nữ mang thai cần : 2,0-
4,0mg/24h. . Người và động vật không có sừng không tổng hợp được B
2
mà
phải nhận từ nguồn thức ăn. Động vật có sừng có thể tự tổng hợp được
vitamin B2 ở ruột của chúng nhờ các vi sinh vật và cung cấp cho động vật
chủ.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
5
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.2.5. Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B
2

Vitamin B2 có nhiều trong các sản phẩm từ sữa, rau cải , nấm men,
bánh mì, men bia, thịt, gan, trứng và các sản phẩm từ cá. Trong rau xanh
cũng có nhiều vitamin B2, nó được tổng hợp từ các tế bào thực vật và vi sinh
vật.
Bảng 1.2.1: Nguồn vitamin B2 trong thực phẩm
Thực phẩm Hàm lượng (mg/100g)
Gan 1,5 – 13
Trứng 0,34 – 0,6
Nấm 0,26 – 0,44
Sữa chua 0,13 – 0,27
Thịt 0,05 – 0,47
Bánh mì 0,06 – 0,16
1.3. Các phương pháp xác định riboflavin

Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B
1
là một lĩnh vực rất quan
trọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu về
phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
. Dưới đây là một số phương
pháp đã được ứng dụng rộng rãi.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
6
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
7
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.3.3.Phương pháp cực phổ
Phương pháp cực phổ được dùng có hiệu quả để định lượng riboflavin
trong dược phẩm. R.Brdicka và E.Kno-bloch là người đầu tiên đã nghiên
cứu phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2 và nghiên cứu sự phụ
thuộc của vitamin B2 vào pH. Sóng cực phổ của riboflavin có tính khuếch
tán, chiều cao của sóng phụ thuộc theo đường thẳng vào nồng độ, vì thế
sóng này rất phù hợp để định lượng.
Để định lượng riboflavin, trước tiên ta lập đường chuẩn của mẫu chuẩn
với các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5mg trong 10ml dung dịch đệm
phosphat 0,1M, pH =6,8. Sau đó ta hút các thể tích tương ứng 0,25; 0,5;
0,75; 1,0; 1,25 ml dung dịch riboflavin chuẩn và đổ đầy dung dịch đệm
phosphate đến thể tích 10ml. Ta tiến hành đo cực phổ và ghi đường chuẩn.
Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 2ml mẫu thử và 8ml dung dịch đệm

phosphate 0,1M, pH = 6,8 vào bình định mức 10ml. Ta sục dung dịch bằng
khí Nito khoảng 15 phút và ghi đường cong trong cùng điều kiện với dung
dich mẫu chuẩn, dùng acquy 2V. Ta được hình cực phổ và xác định
riboflavin theo đường chuẩn.
Phương pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lượng riboflavin
trong các chế phẩm dược và có thể định lượng thẳng hỗn hợp vitamin nhóm
B. Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp để định lượng riboflavin
trong các nguyên liệu sinh vật học vì riboflavin tồn tại trong các nguyên liệu
sinh vật học dạng kết hợp nên phương pháp cực phổ không xác định được.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
8
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.3.4.Phương pháp huỳnh quang
Đo huỳnh quang màu xanh của riboflavin được coi như một phương
pháp cơ bản hay dùng nhất để định lượng chất này trong các nguyên liệu
thiên nhiên. Nồng độ của huỳnh quang phụ thuộc vào pH của dung dịch,
nồng độ cực đại nằm ở vùng pH = 6-7. Huỳnh quang giảm mạnh nhất ở pH
dưới 3,8 và pH trên 7,7. Độ chính xác của phương pháp đo huỳnh quang
dựa trên cơ sở điều kiện triết và loại trừ các huỳnh quang phụ có ảnh hưởng
khi đo.
Cách tiến hành định lượng sau khi chuẩn bị mẫu thử, dụng cụ và các
thuốc thử hóa học : Nhỏ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 10ml dung dịch chiết
của mẫu thử, cho vào trong hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch mẫu
chuẩn riboflavin và hai ống kia mỗi ống 1ml nước. Trong mỗi một ống
nghiệm lại cho thêm 1ml axit axetic kết tinh, lắc đều và cho thêm 0,5ml
dung dịch Kali pemanganat và để yên trong 2 phút. Sau đó cho thêm vào cả
4 ống nghiệm mỗi ống 0,5ml dung dịch nước oxy già và lắc đều. Màu của
kali pemanganat mất trong 5 giây. Cho tiếp vài giọt cồn caprylic hoặc
axeton. Điều chỉnh máy so màu huỳnh quang ở độ nhạy thích hợp. Sau đó

tiến hành tính cả mẫu thử có cho thêm mẫu chuẩn và mẫu thử chính không
cho thêm mẫu chuẩn. Tính trung bình cả hai lần đo. Định lượng mẫu trắng
sau khi cho 20mg natri hidro sunfit vào từng ống nghiệm.Từ đó tính ra nồng
độ của riboflavin trong mẫu thử.
Phương pháp huỳnh quang có nhược điểm là sự phân tích bằng ánh
sang không xảy ra hoàn toàn được và các sản phẩm phân tích lumicrom và
lumiflavin sẽ bị phân hủy tiếp khi tiếp xúc với ánh sáng.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
9
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

1.3.5.Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Kuhn và đồng nghiệp là người đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ của
riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nước riboflavin bốn cực đại hấp thụ ở
các bước sóng 223nm ; 375nm ; 267nm ; 444nm. C.Daglish, M.Baxter xác
định rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc đáng
kể vào pH. Và khi xác định về định lượng cần phải đo quang phổ hấp thụ
của mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm như nhau.
Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng. Cân chính xác
một lượng bột viên tương ứng với khoảng 10mg riboflavin, thêm hỗn hợp
gồm 5ml axit axetic kết tinh và 100ml nước. Đun cách thủy 1 giờ, lắc liên
tục. Thêm 500ml nước, để nguội, thêm 30ml dung dịch natri hidroxyd 1N và
lắc liên tục, pha loãng với nước thành 1000,0ml, lắc đều. Lọc loại bỏ dung
dịch đầu. Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở bước song 444nm, trong cốc
dày 1cm, so với mẫu trắng là nước. Tình hàm lượng riboflavin trong mẫu
theo giá trị A(1%,1cm) ở 444nm là 328.
Phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại được dùng như một
phương pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu riboflavin và dược
phẩm.
Theo sự phân công của giáo viên hướng dẫn, em xin trình bày về

phương pháp định lượn vitamin B2 bằng phương pháp quang phổ hấp thụ
phân tử.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
10
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Phần II
Phân tích Vitamin B2 bằng phương pháp
quang phổ hấp thụ phân tử
2.1.Cơ sở lý thuyết của phương pháp
2.1.1Nguyên tắc
Muốn xác định một cấu tử X nào đó, người ta chuyển nó thành những chất
mà có khả năng hấp thụ ánh sáng, sau đó đo sự hấp thụ ánh sáng của nó. Từ
đó suy ra hàm lượng của chất cần phân tích.
Phản ứng thực hiện trong phép so màu có phản ứng trực tiếp và gián tiếp.
Phản ứng trực tiếp : X + R = XR
Phản ứng gián tiếp : X + MR = MX + R
Trong đó : X là chất cần xác định
R là thuốc thử
XR là phức màu ( có khả năng hấp thụ ánh sáng )
Sự hấp thụ bức xạ đơn sắc càng mạnh khi dung dịch có nồng độ lớn  màu
càng đậm  cơ sở của phương pháp so màu, đo quang và máy UV-VIS .
2.1.2. Các định luật cơ bản về sự hấp thụ bức xạ đơn sắc
Định luật Bugơ-Lambe : I
0
=I+I
a
+I
r
Trong đó: I

a
là phần cường độ bị hấp thụ
I
r
là phần cường độ bị phản xạ
I là cường độ ló ra
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
11
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Định luật hấp thụ ánh sáng :
Nếu chiều một chùm sáng đơn sắc có cường độ I
o
qua một dung dịch có
bề dày là b(cm) thì sau khi ra khỏi dung dịch nó bị hấp thụ một phần, nên
cường độ chỉ còn lại là I
t
với điều kiện I
t
< I
o
.
Biểu thức : T = I
t
/I
o
= 10
-
ε
bC

A = lg(1/T) =lg(Io/It) = εbC
Trong đó : ε là hệ số hấp thụ phân tử g
B là chiều dày cuvet (cm)
C là nồng độ dung dịch ( mol/l)
T là độ truyền qua
Io là cường độ ánh sáng tới
It là cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dd
A là mật độ quang phụ thuộc tuyến tính vào C
Ý nghĩa của hệ số hấp thụ phân tử ε
- Trường hợp C tính bằng mol/l và bằng 1mol/l, b tính bằng cm và bằng
1cm thì : A = ε
ε đặc trưng cho bản chất của chất tan trong dung dịch, nó chỉ phụ thuộc vào
bước sóng. Định luật Lambert – Beer chỉ đúng khi dùng bức xạ đơn sắc.
- Trường hợp nồng độ C tính theo % và bằng 1%, b = 1cm thì E(1%,1cm)
là hệ số hấp thụ riêng, nó đăc trưng cho mỗi chất. Trong phân tích kiểm
nghiệm hay dùng E(1%,1cm).
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
12
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.1.3.Tính chất cộng tính của mật độ quang
n
n
n
n
noo
DDDDD
I
I
I

I
I
I
I
I
D
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
D
++++=
++++=








++++==
−
−

lg lglglg
lglg
321
1
3
2
2
1
1
0
1
3
2
2
1
1
2.1.4.Điều kiện áp dụng định luật Lambert_beer
- Ánh sáng phải đơn sắc.
- Khoảng nồng độ phải thích hợp : định luật L-B chỉ đúng trong một khoảng
giới hạn nhất định của nồng độ.
- Dung dịch phải trong suốt.
- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sang UV-
VIS.
2.2.Chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng
Để xây dựng quy trình định lượng , chúng ta cần khảo sát để chọn các
điều kiện thích hợp.
2.2.1Chọn bước sóng ứng với các cực đại hấp thụ
Bước sóng cực đại là tại đó giá trị mật độ quang A là lớn nhất. Cách xác
định : cho một lượng chất dung dịch chuẩn của chất cần xác định X tạo phức

màu với thuốc thử R. Sau đó tiến hành khảo sát mật độ quang của dung dịch
ở các bước sóng khác nhau từ 380 – 800nm. Đo bước sóng từ 380 – 600nm,
khoảng cách mỗi lần đo là 10nm. Từ giá trị mật độ quang lớn nhất thu được
ta suy ra bước sóng cực đại.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
13
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.2.2.Chọn pH tối ưu
Nếu thuốc thử là một axit yếu thì nồng độ H
+
có ảnh hưởng lớn tới sự
tạo phức, làm ảnh hưởng đến giá trị mật độ quang . Vì vậy trước khi phân
tích ta cần phải khảo sát lại giá trị pH tối ưu. Cách xác định : Lấy một lượng
tiêu chuẩn chất cần phân tích chế hóa với các thuốc thử để tạo màu. Sau đó
thay đổi các giá trị pH của phức màu bằng cách thêm axit hoặc bazo. Tiến
hành đo giá trị mật độ quang của dung dịch phức màu. Tại giá trị pH nào mà
giá trị mật độ quang lớn nhất chính là giá trị pH tối ưu.
2.2.3.Chọn khoảng thời gian tối ưu
Thời gian tối ưu được xác định đối với phức, là khoảng thời gian mà mật
độ quang đạt giá trị lớn nhất và ổn định. Các xác định : Cho một lượng chất
tiêu chuẩn cần phân tích được chế hóa với thuốc thử để tạo phức màu, sau
đó khảo sát giá trị mật độ quang của phức trong khoảng thời gian khác nhau
(1p,3p,5p,10p ). Tại khoảng thời gian nào mà phức đạt giá trị mật độ quang
ổn định và lớn nhất thí đó là khoảng thời gian tối ưu.
2.2.4.Chọn các điều kiện khác
- Chọn kính lọc : màu của kính lọc và màu của dung dịch phải phụ
nhau
- Chọn khoảng nồng độ thích hợp : Khoảng nồng độ có quan hệ
tuyến tính với độ hấp thụ.

- Loại trừ ảnh hưởng của các chất lạ : Chiết chất cần định lượng ra
khỏi hỗn hợp phức tạp( các dạng bào chế). Dùng mẫu trắng có thành phần
như dung dịch thử nhưng không có chất cần định lượng
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
14
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

- Chọn tỉ lệ thuốc thử : Sự hấp thụ của các chất lạ, thuốc thử cũng có
thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng
tạo màu phải chú ý đến điều kiện và các thành phần tham gia phản ứng.
2.3 Máy quang phổ UV-VIS:

2.3.1 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
1. Nguồn sáng 5. Cuvet mẫu
2. Bộ phận đơn sắc 6 Dung dịch so sánh
3, Bán gương 7,8 Tế bào Quang- Điện
4 Gương 9 Xử lý tín hiệu
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
15
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.3.2.Các bộ phận chính của máy đo phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
Không phụ thuộc vào vùng phổ, các máy đo độ truyền quang và độ hấp thụ
(mật độ quang) của dd bao gồm 5 bộ phận cơ bản sau :
- Nguồn bức xạ có năng lượng ổn định, hiện nay trang bị 2 loại đèn:
W-Lamp(vùng khả kiến),D-Lamp(vùng tử ngoại)
- Bộ phận tạo bức xạ có bước sóng thích hợp với chất nghiên cứu gồm :
hệ lăng kính, cách tử
- Ngăn đựng mẫu gồm các cuvet chứa đựng dd đo, thường sử dụng cuvet
thủy tinh cho vùng khả kiến, nếu đo trong vùng tử ngoại thì phải dùng cuvet

thạch anh.
- Đêtectơ là loại thiết bị có khả năng thu những thông tin : cơ, điện,
quang thành những tín hiệu, thường là tín hiệu điện. Trong máy UV-VIS thì
đêtectơ là các tế bào quang điện với hiệu ứng quang điện ngoài hay các nhân
quang điện.
- Bộ phận chỉ thị kết quả :là một máy tính hoặc bộ phjận giống máy tính
có chức năng thu nhân và hiển thị kết quả phân tích(các dãy phổ phân tích)
2.4.Các phương pháp định lượng trong quang phổ hấp thụ phân
tử.
2.4.1.Phương pháp tỉ lệ so sánh
Theo định luật Lambert-Beer, sau khi đo độ hấp thụ của dung dịch
chuẩn so sánh (S) và dung dịch mẫu thử (X) ta có:
A
s
= ε.b.C
s
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
16
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

A
x
= ε.b.Cx
Trong đó : A
s
: là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ C
s
A
x
: là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ C

x
Vì hệ số hấp thụ ε và bề dày của cuvet b là như nhau nên ta có :
A
x
/A
s
= C
x
/C
s
→ C
x
= C
s
. A
x
/A
s
Chú ý : Nồng độ của dung dịch thử C
x
và dung dịch chuẩn C
s
không được
chênh lệch nhau quá nhiều. Các nồng độ này càng gần nhau kết quả càng
chính xác.
Ưu điểm: Độ chính xác tương đối cao
Nhược điểm: - Không thể xác định được hàng loạt mẫu
- Sai số do mắt quan sát
- Mắc sai số do thành phần hóa học chất phân tích có thể lẫn
các tạp chất hóa học khác.

2.4.2.Phương pháp thêm chuẩn so sánh
Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai
số cho quá trình định lượng : Xử lý mẫu ( chiết xuất), sai lệch do thiết bị và
hóa chất thuốc thử , người ta đã áp dụng phương pháp thêm.
Nguyên tắc tiến hành: Lấy hai lượng giống nhau của một mẫu thử. Thêm
một lượng chất chuẩn đã biết vào một mẫu. Tiến hành xử lý cá hai mẫu
trong cùng điều kiện, thu được 2 dung dịch: dung dịch thử và dung dịch thử
đã thêm chuẩn. Đo độ hấp thụ của cả 2 dung dịch thu được :
A
x
: Độ hấp thụ của dung dịch thử
A’
x
: Độ hấp thụ của dung dịch thử đã thêm chuẩn
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
17
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Với C
s
là nồng độ của dung dịch chuẩn, ta tính được nồng độ C
x
theo
phương trình :
A
x
/A’
x
= C
x

/ (C
s
+ C
x
) → C
x
= C
s
. A
x
/( A’
x
– A
x
)
2.4.3. Phương pháp đường chuẩn :
Bước 1 :Xây dựng đường chuẩn D=f(C) (D=aC+b)
- Pha dung dịch chuẩn gốc ban đầu (thường đặc) khoảng 10
-3
M(10
-
3
N) .Khi cần dung dịch có nồng độ nhỏ hơn thì ta pha loãng ra gọi là dung
dịch làm việc.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn C
1
,C
2
,C
3

,C
4
,C
5,
C
6
và 1 mẫu trống,
pha vào bình định mức, đánh số thứ tự từ 1 dến 7. Dùng thuốc thử thích hợp
để đưa về dạng phức màu.
- Đo mật độ quang các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã khảo
sát(đã xác định λmax,đã xác định khoảng tuyến tính )
- Tương ứng với D
1
,D
2
,D
3
,D
4
,D
5
,D
6
dựng đường chuẩn D=f(C), xác
định được đường thẳng D=aC+b.
Bước 2:Chuẩn bị mẫu phân tích :
-Chuẩn bị như dãy chuẩn,trong cùng điều kiện như dung dịch
chuẩn.
Bước 3:Xử lý mẫu:
-Đo mật độ quang Dx

-Xây dựng đường chuẩn dựa trên D đo được ,từ đó xác định nồng
độ Cx
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
18
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Mật độ quang
D
1
D
2
D
3

D
4
D
5
D
6
C
1
C
2
C
3
C
4
C
5

C
6
Nồng độ



Ưu điểm :
- Đường chuẩn được dùng trong thời gian dài, khi dùng có thể điều chỉnh
lại.
- Xác định hàng loạt mẫu.
- Chính xác,dễ thực hiện.
Nhược điểm
- Sự hấp thụ ánh sáng phải tuân thủ theo định luật Lambert-Beer
- Thành phần mẫu phức tạp (ta có thể loại bỏ nhưng không thể hoàn
toàn…) đường chuẩn bị sai số.
- Điều kiện mẫu chuẩn không thể giống hoàn toàn mẫu phân tích. Dễ dẫn
đến sai số.
- Kết quả chính xác của phép đo phụ thuộc vào máy.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
19
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.4.4 Phương pháp thêm chuẩn :
* Nguyên tắc chung:
- Lấy ngay dung dịch phân tích làm dung dịch nền
- Có 2 phương pháp thêm chuẩn :
+ Thêm một mẫu chuẩn
+ Thêm một dãy chuẩn
a.Thêm một mẫu chuẩn:
- Pha dung dịch chất phân tích với nồng độ Cx, thêm thuốc thử, môi

trường …định múc tới vạch
- Do mật dộ quang tại λmax đã khảo sát xác định giá trị Dx (D=k.Cx)
- Thêm vào dung dịch lượng chính xác Ca.
- Đo mật độ quang D (D=k.(Cx+C
(x+a)
))
- Xác định nồng độ mẫu Cx:

D
C
D
C
X
a
X
X
D −
=
.
b.Thêm dãy chuẩn:
- Cho vào 6 bình định mức một thể tích chính xác dung dịch phân tích
nồng đọ Cx
- Thêm lần lượt vào mỗi bình lượng chính xác nồng độ
C1,C2,C3,C4,C5,C6 sao cho nồng độ tăng theo cấp số cộng,thêm thuốc
thử ,môi trường …định mức tới vạch .
- Tiến hành đo mật độ quang thu được D1,D2,D3,D4,D5,D6
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
20
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

- Vẽ đồ thị D=f(C),từ đó xác định Cx
 So với phương pháp thêm 1 mẫu thì phương pháp thêm dãy chuẩn độ
chính xác cao hơn ,song đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian.Vì thế khi yêu cầu
độ chính xác cao thì ta nên dung phương pháp thêm dãy chuẩn.
Ưu điểm :
- Quá trình lấy mẫu dễ dàng ,không cần phải dùng hóa chât tinh
khiết cao để chuẩn bị mẫu chuẩn.
- Không chú ý đến ảnh hưởng về thành phần hay cấu trúc vật lý
của các chất.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
21
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

2.4.5. Kỹ thuật đo vi sai theo bước sóng
Trong kiểm nghiệm các dạng thuốc bào chế, trước hết ta phải qua công
đoạn chiết hoạt chất ra khỏi tá dược. Dịch chiết khó tránh khỏi mang theo
tạp chất. Tạp chất này có thể gây sai số cho quá trình định lượng bằng
phương pháp đo quang.
Để loại trừ sai số này, người ta thường sử dụng kỹ thuật đo quang vi sai :
Trên phổ của chất nghiên cứu, chọn hai bước sóng λ
1
và λ
2
. Ở đó hiệu số độ
hấp thụ ∆A là lớn nhất.
∆A
max
= A
λ

1
- A
λ
2
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau và đo độ
hấp thụ A ở 2 bước sóng λ
1
và λ
2
. Khảo sát khoảng nồng độ tuân theo định
luật Lambert-Beer của ∆A , vẽ đồ thị quan hệ ∆A – C. Đo độ hấp thụ A của
chất thử ở 2 bước sóng trên . Dựa vào đồ thị ∆A – C suy ra nồng độ chất thử
trong mẫu.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
22
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

PHẦN III
Quy trình phân tích

3.1. Đối tượng, thiết bị, hóa chất
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là các chế phẩm dược chứa riboflavin ở dạng
viên nén, thuốc tiêm đang được sử dụng trên thị trường thuốc.
- Địa điểm lấy mẫu là ở các hiệu thuốc trên địa bàn Hà Nội.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ.
- Cân phân tích độ chính xác 0,001g
- Máy chỉnh pH
- Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml
- Bình nón 250ml

- Các loại pipet thủy tinh có dung tích 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 50ml
- Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng tử ngoại và khả
kiến bao gồm một hệ quang học có khả năng tạo ánh sáng trong
vùng từ 200 đến 800nm và một thiết bị thích hợp để đo độ hấp thụ.
+ Nguồn sáng cho vùng tử ngoại : đèn dotecti hoặc hidro
+ Nguồn sáng đo vùng khả kiến : đèn tungsten
+ Hai cốc đo (cuvet) dùng chứa dung dịch thử và dung dịch so
sánh phải có đặc tính quang học như nhau
+ Cuvet thạch anh : dùng đo vùng tử ngoại và khả kiến
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
23
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

+ Cuvet thủy tinh : chỉ đo ở vùng khả kiến.
Hiệu chỉnh máy quang phổ
Trong định tính và định lượng các chất bằng phương pháp quang phổ
UV-VIS, việc chuẩn hóa máy đóng vai trò quan trọng, đặc biệt là trong kỹ
thuật định lượng bằng đo phổ trực tiếp. Sau đây là 6 yêu cầu kiểm tra chỉ
tiêu kỹ thuật của máy quang phổ tử ngoại khả kiến:
 Kiệm tra độ dài sóng:bằng cách sử dụng cực đại hấp thụ của dung
dịch holmium perchlorate, vạch phổ của đèn nguồn hydro, đèn deuteri
hoặc vạch phổ của đèn hơi thủy ngân được chỉ ra dưới đây với dung
sai cho phép ở vùng tử ngoại là ± 1nm, ở vùng khả kiến là ±3nm :
Các cực đại hấp thụ của dung dịch holmium perchlorat khi dùng
- Đèn hydro : 379,79; 456,13 và 625,28nm.
- Đèn deuteri : 486,02 nm ; 656,10 nm.
- Kính holmium : 279,4 ; 287,5 ; 333,7 ; 360,9 ; 460,0 ; 484,5 ;
536,2 ; 637,5nm.
 Kiểm tra độ hấp thụ : để kiểm tra độ hấp thụ ta dùng dung dịch
kalidicromat trong acid sulfuric. Đo độ hấp thụ của dung dịch kali

dicromat ở các độ dài sóng chỉ định ở bảng 1. Trong bảng, ở mỗi độ
dài sóng có một giá trị chính xác của độ hấp thụ riêng E(1%;1cm) và
các giới hạn cho phép.
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
24
Đồ án chuyên ngành GVHD: Trần Quang Hải

Bảng 3.1.1 . Độ hấp thụ riêng của dung dịch kali dicromat
Độ dài sóng(nm) E(1%;1cm) Giới hạn cho phép
235 124,5 122,9 – 126,2
257 144,0 142,4 – 145,7
313 48,6 47,6 – 50,3
350 106,6 104,9 – 109,2
Pha chế dung dịch kali dicromat : hòa tan 57,0 – 63,0 mg kali dicromat
đã sấy khô đến khối lượng không đổi ở 1300
o
C trong acid sunfuric 0,005m/l
với thể tích vừa đủ là 1000ml.
 Giới hạn ánh sáng lạc: Ánh sáng lạc là ánh sáng không đi vào mẫu
thử mà đi thẳng vào detector. Ánh sáng lạc có thể được phát hiện ở độ
dài sóng đã cho với kính lọc hoặc các dung dịch thích hợp.
 Độ rộng dải phổ nguồn : Để tránh sai số gây ra do độ rộng dải phổ
nguồn, khi sử dụng máy có độ rộng dải phổ thay đổi ở độ dài sóng đã
chọn thì độ rộng của dải phổ phải nhỏ so với nửa độ rộng của băng
hấp thụ. Song độ rộng này phải đủ lớn để thu được giá trị cao của
cường độ ánh sáng I
o
và việc thu hẹp độ rộng giải phổ phải không làm
cho độ hấp thụ tăng lên.
 Cuvet : Dung sai của chiều dày lớp dung dịch của các cuvet là

±0,005cm. Khi được nạp đầy với cùng một dung môi, các cuvet có ý
định để chứa dung dịch thử và dung dịch so sánh phải có độ truyền
qua như nhau. Nếu điều này không được đáp ứng thì phải có sự hiệu
chỉnh thích hợp. Các cuvet phải được làm sạch và chăm sóc cẩn thận
SVTH : Vi Thị Minh Tân Lớp ĐH Hóa 3_k3
25