Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC
NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI
TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Hà Nội, năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC
NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI
TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

ThS Phạm Thị Kim Dung

Hà Nội, năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới cô:
ThS Phạm Thị Kim Dung
Là người đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi những kiến thức quý giá
giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức để hoàn thành nội dung khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện nghiên cứu khoa Sinh đã tạo điều kiện
trang thiết bị cho tôi hoàn thành khóa luận, bên cạnh đó tôi cũng xin chân thành
cảm ơn Phòng Đào tạo và các thầy cô trong Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Tôi cũng không thể không gửi lời cảm ơn đến các cộng sự, những người
cùng trong nhóm làm khóa luận sát cánh nghiên cứu và thảo luận khắc phục
những sự cố và khó khăn.
Tôi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè những người tin yêu đã động viên tôi
cố gắng trong suốt thời gian qua.
Khóa luận tốt nghiệp này cũng là mốc đánh dấu những ngày chập chững
tôi nghiên cứu khoa học, vì vậy không thể tránh khỏi thiếu sót và hạn chế. Tôi
mong sẽ nhận được những sự góp ý quý báu từ thầy cô, bạn bè để tôi có những
hành trang cho quá trình nghiên cứu sau này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phương Thảo

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi nội dung trong khóa luận: “Nghiên cứu sự hấp thụ
thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus trong môi trường nước dừa già” hoàn toàn là công trình nghiên cứu
của tôi, dựa trên sự kế thừa và phát triển của các công trình nghiên cứu liên quan.
Tôi xin cam đoan những số liệu mà tôi thống kê là do xây dựng thực
nghiệm không trùng lặp với bất kì kết quả của nghiên cứu nào.
Trong đề tài của tôi có sử dụng những thông tin từ các tài liệu tham khảo
khác. Tôi xin phép trích dẫn và ghi nguồn gốc rõ ràng.
Tôi xin chịu trách nhiệm với nội dung đề tài của mình.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phương Thảo


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

KÍ HIỆU VIẾT TẮT

NỘI DUNG

1

G. xylinus

2

VLC

Vật liệu cellulose

3

OD

Mật độ quang phổ

4

MTD

Gluconacetobacter xylinus

Môi trường nước dừa già


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 8
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................ 8
2. Mục đích của nghiên cứu...............................................................................9
3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................9
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................11
1.1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG, LĨNH VỰC NGHIÊN
CỨU.................................................................................................................11
1.1.1. Tổng quan về Diclofenac natri...........................................................11
1.1.2. Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus......................................... 13
1.1.3. Tổng quan về Vật liệu cellulose (VLC).............................................14

1.2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
18
1.2.1. Trên thế giới.......................................................................................18
1.2.2. Tại Việt Nam......................................................................................19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....20
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................20
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu............................................................................20
2.1.3. Môi trường nghiên cứu...................................................................... 21
2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN........................22
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu........................................................................... 22
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu..........................................................................22
2.2.3. Thời gian nghiên cứu......................................................................... 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................22
2.3.1. Tạo màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già........................22
2.3.2. Xử lý VLC......................................................................................... 23


2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng VLC.............................................. 24
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri trong
dung dịch methanol......................................................................................24
2.3.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng VLC......................... 26
2.3.6. Phương pháp xử lý thống kê..............................................................29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................30
3.1. Tạo vật liệu VLC từ G. xylinus trong môi trường nước dừa già...............30
3.1.1. Thu màng VLC được lên men trong môi trường nước dừa già.........30
3.1.2. Đo bề dày của các loại vật liệu VLC................................................. 31
3.1.3. Kết quả trình xử lý VLC trước khi hấp thụ Diclofenac natri.............32
3.2. Kết quả sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già............................ 33

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................38
4.1. Kết luận.....................................................................................................38
4.2. Kiến nghị...................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 39


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng môi trường nước dừa già [10]...................... 21
Bảng 2.2. Môi trường dừa lên men tạo vật liệu VLC.......................................... 23
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n=3)..................................................................................... 25
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng VLC (n=3)..................................34
Mật độ quang OD (Abs 283nm).......................................................................... 34
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào màng VLC (mht) và tỉ lệ hấp thụ thuốc
(EE%) với độ dày màng khác nhau tại thời điểm 2 giờ.......................................35


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac natri...............................................11
Hình 1.2. Hình thái Gluconacetobacter xylinus...................................................13
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac natri tại λ =283nm...........26
Hình 2.2. Chuẩn bị dung dịch thuốc Diclofenac natri cần hấp thu......................27
Hình 2.3. Bình chứa màng chuẩn bị hấp thụ thuốc..............................................27
Hình 2.4. Màng VLC đang hấp thụ......................................................................28
Hình 3.1. Hình ảnh màng VLC được lên men từ môi trường nước dừa già........30
Hình 3.2. Màng VLC thu được có độ dày 0,5cm và 1cm....................................31
Hình 3.3. Màng VLC có độ dày 0,5cm (a) và màng VLC có độ dày 1cm (b).....32
Hình 3.4. Màng VLC sau khi được xử lí bởi NaOH............................................32
Hình 3.5. Màng VLC tinh khiết có d = 1 cm.......................................................33
Hình 3.6. Màng VLC sau khi ép 50% nước.........................................................33

Hình 3.7. Khối lượng thuốc hấp thụ trong cùng độ dày màng............................ 35
Hình 3.8. Tỉ lệ thuốc hấp thụ trong các độ dày màng khác nhau.........................36


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, trong xu thế hội nhập, kinh tế phát triển, con người có của ăn của
để, thì cũng là lúc người ta quan tâm nhiều đến sức khỏe. Công nghệ sinh học cũng
đang được đầu tư đẩy mạnh bởi những thành tựu của nó trong các ngành công
nghiệp thực phẩm, y học… Việc nghiên cứu làm tăng khả năng sử dụng của các loại
thuốc phục vụ nâng cao sức khỏe của con người đang là hướng đi có nhiều triển
vọng. Dựa trên cơ sở đó, tôi quyết định nghiên cứu một dạng thuốc chống viêm có
ứng dụng lớn là Diclofenac natri nhằm làm tăng cường những ưu điểm và giảm
thiểu những nhược điểm mà thuốc mang lại cho người sử dụng.

Diclofenac natri là một dẫn xuất của Diclofenac, là một loại thuốc giảm
đau trong thời gian ngắn, công dụng nhanh và mạnh. Chế phẩm thuốc không
chứa steroid, đặc biệt công dụng đối với các bệnh về xương khớp. Cơ chế tác
dụng của Diclofenac là làm ngăn cản sự tổng hợp của prostagladin (chất gây
viêm, đau và sốt). Bên cạnh đó, thuốc cũng có tác dụng làm giảm nhiễm trùng
sau phẫu thuật, làm giảm đau do vận động hay làm giảm đau bụng kinh [1,10].
Do Diclofenac natri có tác dụng ngắn và tức thì nên cần phải dùng nhắc lại
nhiều lần, vì vậy thuốc ảnh hưởng tương đối đến đường tiêu hóa. Thuốc chống
chỉ định với những người viêm loét dạ dày, hành tá tràng. Việc thuốc ngăn cản sự
tổng hợp prostaladin cũng gây viêm cầu thận, hội chứng thận hư, hoại tử nhú đặc
biệt đối với những có tiền sử suy tim và các bênh về thận [1,12].
Việc tôi lựa chọn nghiên cứu thuốc Diclofenac natri nhằm mong muốn kéo
dài tác dụng của thuốc. Sự hấp thụ của thuốc được tôi lựa chọn nghiên cứu trên một
loại vật liệu mang tính khả thi cao là vật liệu cellulose tạo ra từ G. xylinus.

Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, sống kị khí
bắt buộc dưới hình thức hóa dưỡng. Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn này trong môi
trường dịch lỏng, chúng hình thành nên một lớp màng VLC [2]. Màng VLC này
mang nhiều đặc tính ưu việt của một chất mang như: Có khả năng hút tốt nhờ cấu
trúc mạng lưới cellulose, có khả năng đàn hồi tốt, dễ dàng tương thích với các
thiết bị sinh học, có tính bền, có khả năng tái sử dụng lại nhiều lần [3].
8


Do màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus mang nhiều đặc điểm
thuận lợi để sử dụng làm vật liệu nghiên cứu, nên lựa chọn nuôi cấy
Gluconacetobacter xylinus trong môi trường dịch lỏng để thu màng VLC. Môi
trường đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn tôi lựa
chọn là môi trường nước dừa già.
Từ những tìm hiểu trên, tôi quyết định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sự
hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích của nghiên cứu
Thiết kế thí nghiệm thu được màng VLC được lên men từ môi trường
nước dừa già.
Nghiên cứu được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già.
3. Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo được vật liệu VLC, thu màng VLC và đánh giá được độ tinh
khiết của vật liệu.
- Xử lý vật liệu VLC trước và sau khi cho hấp thụ thuốc.
- Trong các khoảng thời gian xác định, tiến hành xác định khối lượng
thuốc hấp thụ vào vật liệu VLC.
- Khảo sát thời điểm hấp thụ Diclofenac natri tối ưu vào vật liệu VLC
trong môi trường nước dừa già.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
+ Tăng thêm hiểu biết về chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus, màng

VLC và những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực y học, thực phẩm và một số
ngành công nghiệp
+ Xây dựng được quy trình tạo màng VLC lên men môi trường nước dừa
già, từ đó tìm ra thời gian VLC có khả năng hấp thu thuốc tốt nhất.

9


- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Nâng cao khả năng hấp thụ diclofenac trên màng VLC nhằm tăng khả
năng tác dụng giảm đau, chống viêm của thuốc, khắc phụ việc sử dụng thuốc
nhắc lại nhiều lần của thuốc Diclofenac trong quá trình điều trị.

10


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG, LĨNH VỰC NGHIÊN
CỨU
1.1.1. Tổng quan về Diclofenac natri
1.1.1.1. Công thức
-

Công thức phân tử: : C14H10Cl2NNaO2
- Công thức cấu tạo: Hình 1.1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac natri

- Tên quốc tế: Diclofenac
- Tên biệt dược: Cambia, Cataflam, Voltaren-XR, Zipsor, Zorvolex,
Voltaren, Dyloject,… [1,8].
1.1.1.2. Tính chất và tác dụng
* Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong
methanol, tan trong ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton. [1].
* Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng:

Diclofenac natri là một dẫn xuất của Diclofenac, là một loại thuốc giảm
đau trong thời gian ngắn, công dụng nhanh và mạnh. Chế phẩm thuốc không
chứa steroid, đặc biệt công dụng đối với các bệnh về xương khớp. Cơ chế tác
dụng của Diclofenac là làm ngăn cản sự tổng hợp của prostagladin (chất gây
viêm, đau và sốt). Bên cạnh đó, thuốc cũng có tác dụng làm giảm nhiễm trùng
sau phẫu thuật, làm giảm đau do vận động hay làm giảm đau bụng kinh [1,13].
Do Diclofenac natri có tác dụng ngắn và tức thì nên cần phải dùng nhắc lại
nhiều lần, vì vậy, thuốc ảnh hưởng tương đối đến đường tiêu hóa. Thuốc chống

11


chỉ định với những người viêm loét dạ dày, hành tá tràng. Việc thuốc ngăn cản sự
tổng hợp prostaladin cũng gây viêm cầu thận, hội chứng thận hư, hoại tử nhú đặc
biệt đối với những có tiền sử suy tim và các bênh về thận [1,10].
Diclofenac natri hấp thụ nhanh khi uống đặc biệt uống lúc đói. Thuốc dạng
uống được chuyển hóa qua gan lần đầu khoảng 50%. Diclofenac natri gắn nhiều
với protein huyết tương, chủ yếu là albumin. Thuốc dạng tiêm sinh khả dụng
trong máu tuần hoàn khoảng 50%. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau 1-2 giờ sau
khi uống, sau 30-60 phút khi đặt thuốc vào trực tràng, vầ tác dụng nhanh nhất

dạng tiêm sau 20-30 phút.
* Tác dụng phụ:
Thường gặp các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa như táo bón, đau
thượng vị,... cũng có thể gây buồn nôn, choáng váng.
Một số trường hợp hiếm gây giảm bạch cầu, thiếu máu, suy tủy; hiếm thấy
nổi ban đỏ, sốc phản vệ; hiếm gây bệnh da mụn nước hay có những phản ứng
nhạy cảm với ánh sáng; hiếm bị hội chứng thận nhiễm mỡ, đái ra máu; hiếm gây
viêm gan, mất ngủ, viêm đại tràng, hạ huyết áp, rụng tóc [8].
1.1.1.3. Cách điều trị
* Dạng thuốc: Chế phẩm dưới nhiều dạng khác nhau. Dạng muối
diethylamoni và thuốc muối hydroxyethylpyrolidin được dùng bôi ngoài. Dạng
base và muối kali thường được dùng làm thuốc uống [10].
+ Viên nén: 25mg, 50mg, 100mg
+ Thuốc tiêm: 75mg/2ml, 75mg/3ml
+ Thuốc đạn: 25mg, 100mg
+ Thuốc tra mắt: 0,01%
+ Thuốc xoa ngoài: 10mg/g
* Chỉ định:
- Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp.
- Điều trị sau phẫu thuật hoặc đau do chấn thương.
- Điều trị đau bụng kinh [10].
* Chống chỉ định:
12


- Quá mẫn với các thành phần của thuốc: diclofenac, aspirin (hen, viêm
mũi, mày đay sau khi dùng aspirin).
- Người có tiền sử loét dạ dày, chảy máu hành tá tràng.
- Người có tiền sử bệnh về tim mạch, thận hoặc gan [10].
1.1.2. Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus

1.1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic. Sống hiếu khí bắt
buộc, đời sống hóa dưỡng [1].
Theo hệ thống phân loại của Berey, Gluconacetobacter xylinus thuộc:
+ Chi: Acetobacter
+ Họ: Pseudomonadaceae
+ Bộ: Pseudomonadales
+ Lớp: Schizommyceles.
Hiện nay họ Acetobacteraceae có 10 chi, trong đó Gluconacetobacter là
chi duy nhất có khả năng tổng hợp cellulose [4].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1.2. Hình thái Gluconacetobacter xylinus

Gluconacetobacter xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có khả
năng đứng riêng rẽ hoặc thành từng chuỗi.
Kích thước: 2 µm
13


Gluconacetobacter xylinus có khả năng thích ứng 4,5% acid acetic trong
môi trường [4]. Môi trường bất lợi (nồng độ acid cao), hoặc khi tế bào già, hình
dạng tế bào có thể bị biến dạng (dài hơn và phình to ra).
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí và sinh hóa
* Đặc điểm sinh lí
Tùy thuộc vào giống có đặc điểm nuôi cấy phát triển khác nhau. Nhiệt độ
thích hợp của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus là 25 – 30oC, pH tối ưu là 4-6.
Nếu nhiệt độ môi trường lên đến 37 0C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn ngay cả
trong môi trường tối ưu. [4]
Trong môi trường nuôi cấy rắn, khuẩn lạc Gluconacetobacter xylinus bắt

đầu phát triển sau khoảng 3-7 ngày, có màu kem, nhỏ và hơi trong suốt. Sau 1
khoảng 1 tuần, khuẩn lạc phát triển to dần, dạng đục, có màu cà phê sữa và khô
hơn.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, do đặc điểm vi khuẩn sống hóa dưỡng,
Gluconacetobacter xylinus có khả năng chuyển hóa đường tạo thành cellulose và
nổi trên bề mặt tạo màng, màng này chính là vật liệu cellulose cần nghiên cứu.
Sau 36 – 48h nuôi cấy, màng dần xuất hiện, và sau 7-10 ngày, màng đạt độ dày
nhất định.
* Đặc điểm sinh hóa
Theo Frateur (1950), ông đứa ra khóa phân loại Gluconacetobacter
xylinus dựa vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO 2 và H2O;
phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer… [9]
Gluconacetobacter xylinus có khả năng chịu được pH thấp, nên khi nuôi
cấy, người ta thưởng bổ sung thêm acid acetic để tránh sự nhiễm khuẩn lạ.
1.1.3. Tổng quan về Vật liệu cellulose (VLC)
1.1.3.1. Cấu trúc
- Vật liệu cellulose (VLC) do Gluconacetobacter xylinus tạo ra có cấu tạo
gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit, đặc điểm
này khiến VLC có đặc tính gần giống cellulose của tế bào thực vật. Điểm khác
14


nhau là VLC không chứa các hợp chất cao phân tử (peptin, hemicellulose, ligin
và sáp nến…) Chính điều này làm nên tính vượt trội của VLC [5].
- Theo AJ. Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi hemicellulose siêu nhỏ, có
đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, các bó tiếp tục liên kết với nhau
dài 100nm, rộng 3-8nm gọi là dãy.
- Trong tự nhiên cellulose có 2 dạng kết tinh phổ biến là I và II. Dạng
cellulose I có thể chuyển hóa thành cellulose II nhưng không có chiều ngược lại.
Cellulose I do Atalla và Vander tìm ra năm 1984, được tổng hợp từ thực vật và

Gluconacetobacter xylinus ở môi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4 glucozen xếp song
song nhau. Trong khi đó, cellulose II được tổng hợp từ môi trường lắc, có chứa
các chuỗi β-1,4 glucozen sắp xếp ngẫu nhiên bằng một lượng lớn liên kết
hydrogen, do vậy, chúng có độ bền về nhiệt. Cả 2 dạng cellulose đều có khả năng
tổng hợp trong tự nhiên, tuy nhiên điều kiện nuôi cấy quyết định dạng kết tinh
phổ biến [4].
1.1.3.2. Chức năng sinh lí của màng VLC đối với Gluconacetobacter xylinus

Tế bào Gluconacetobacter xylinus xen vào giữa mạng lưới cellulose. Các
mạng lưới cellulose giúp chống đỡ cho vi sinh vật luôn ở trạng thái tiếp giáp giữa
môi trường lỏng và không khí. Bên cạnh đó, cellulose còn là nguồn dữ trữ dinh
dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Enzim exo-glucanase và endo-glucanase xúc tác
cho sự phân hủy cellulose [5,6].
Nhờ khả năng thấm nước và tính dẻo của cellulose mà vi khuẩn ít chịu ảnh
hưởng từ những môi trường như giảm pH, mất nước, xuất hiện độc tố và vi sinh
vật gây bệnh. Bên cạnh đó, cellulose còn ngăn cản tia cực tím khiến
Gluconacetobacter xylinus có khả năng sống sót sau 1 giờ chiếu tia UV liên tục.
Khi vi khuẩn tách khỏi mạng lưới cellulose, khả năng sống sót của chúng chỉ còn
3% [5,6].
1.1.3.3. Tính chất độc đáo của màng VLC
Ngay từ đầu thế kỉ XIX, người ta đã tìm ra VLC và coi nó như một nguồn
nguyên liệu sinh học triển vọng với các đặc tính [3].
15


- Độ tinh khiết cao: VLC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không chứa ligin và hemicellulose, do đó, VLC có thể phân hủy hoàn toàn và trở
thành nguồn nguyên liệu tái sinh [10].
- Độ bền dai cơ học: Cellulose có trọng lượng nhẹ nhưng chịu được các
lực cơ học lớn, độ bền đáng kể [10].

- Khả năng hút nước cao: VLC có khả năng giữ nước rất lớn khi ở trạng
thái ẩm. Nó có khả năng giữ được lượng nước nặng gấp 60 – 100 lần trọng lượng
của nó [10].
- Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn hình thành trực tiếp màng VLC, do
đó, việc ứng dụng sản xuất giấy, sợi từ VCL không cần qua bước trung gian [3].
- Màng VLC được hình thành từ các sợi, các sợi này có khả năng biến
động, xếp với nhau thành dãy tạo độ bền theo trục. Theo Brown và White (1989)
tiến hành thí nghiệm dìm 1 khối đất xốp hình gang tay vào môi trường nuôi cấy
Gluconacetobacter xylinus, kết quả tế bào vi khuẩn tập hợp xung quanh khối đất
xốp và tạo thành màng cellulose có hình gang tay. Do đó, ta có thể tạo màng
cellulose theo hình mong muốn [3].
- Màng VLC có khả năng thay đổi tính chất. Ta có thể kiểm soát tính chất
vật lí của cellulose phù hợp với mục đích sử dụng bằng cách bổ sung thuốc
nhuộm vào môi trường nuôi cấy [3].
1.1.3.4. Các phương pháp sản xuất VLC từ Gluconacetobacter xylinus
* Lên men tĩnh
Đổ môi trường dinh dưỡng để lên men Gluconacetobacter xylinus vào các
khay lên men có mặt thoáng rộng. Đậy lên bề mặt khay các giấy báo có độ xốp, đảm
bảo giảm khả năng nhiễm khuẩn nhưng vẫn tạo sự thông khí giữa môi trường lên
men và môi trường bên ngoài. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 28

– 300C. Sau 3 – 7 ngày, bề mặt nuôi cấy xuất hiện lớp màng cellulose, phân cách
môi trường lỏng và môi trường không khí. Các sợi cellulose mới được tổng hợp
tiếp tục di chuyển lên phía trên bám và màng cellulose tạo nên độ dày màng. Sau
7 – 10 ngày có thể thu màng VLC [11].
Như vậy lên men tĩnh là quá trình lên men không chịu sự tác động của các
16


yếu tố vật lí như khấy từ, lắc… Trong nghiên cứu này, tôi tập trung chủ yếu sử

dụng phương pháp lên men tĩnh.
* Lên men động:
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường nuôi
cấy và được lắc thường xuyên trong máy lắc ổn nhiệt. Chuẩn bị dịch huyền phù
vi khuẩn đã được hoạt hóa, chuẩn bị các bình tam giác erlen đổ sẵn các môi
trường nuôi cấy. Sau đó cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào bình,
đem lắc trong các máy lắc ổn nhiệt 28 – 30 0C, 180 – 200 vòng/phút. VLC tạo ra
từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hình sao hoặc dạng sợi dài, do chịu ảnh
hưởng của môi trường lắc nên cellulose phân tán rất tốt và đều. Lượng Oxi hòa
tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp VLC, do vậy, để tăng hiệu
suất của quá trình lên men ta cần sục khí thường xuyên [11].
1.1.3.5. Ứng dụng của màng VLC
VLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như:
dùng màng VLC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm
chất mang,.. đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ
phẩm, công nghệ giấy ... Trong lĩnh vực y học, màng VLC đã được ứng dụng
làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân
tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Trường Đại
học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng VLC có
tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng
màng VLC giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm
trùng. Ngoài ra, màng VLC được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân
phối thuốc, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân
phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá
hủy trong môi trường acid [6,7,8].
Với những đặc tính nổi trội, VLC ngày càng được nghiên cứu nhiều và
có ứng dụng cụ thể trong bảng 1.1.

17

Bảng 1.1. Các ứng dụng của VLC [6]
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG

Thực phẩm

Y dược
Mỹ phẩm
Môi trường
Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

SẢN PHẨM

Tráng miệng (thạch dừa), ăn kiêng (kem), vỏ bao
xúc xích, thịt nhân tạo, nước uống siro không có
cholesterol, trà Kobucha
Tác nhân vật chuyển thuốc, màng trị bỏng, da nhân
tạo, chất làm co mạch
Móng nhân tạo
Hấp thụ chất độc, quần áo, giày dép tự phân hủy
Thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo, y phục quân đội
Lều lắp ráp

Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ, thùng

hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.2.1. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus và màng VLC đã thu hút được sự chú
ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và có nhiều giá trị ứng dụng. Các nghiên
cứu hiện nay tập trung vào nhiều lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu VLC từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus được nghiên cứu
trên nhiều quốc gia. Tác giả Brown dùng màng cellulose làm môi trường phân
tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang năng lượng cho pin và tế bào
[8]. Brown, Jonas và Farad dùng màng như một chất biến đổi độ nhớt, làm môi
trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm.
Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tìm ra phức chất (composite) từ
sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinyl. Các phức chất
này có ứng dụng lớn trong việc điều trị bỏng và vết loét dưới da.
18


Những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về chế tạo màng từ
vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng VLC, đồng thời, nghiên cứu sản xuất giấy
điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn; nghiên cứu về con đường hình thành
cellulose vi khuẩn, nghiên cứu về cấu trúc sợi cellulose và các đặc tính của màng
cellulose; mối quan hệ giữa khả năng hình thành màng cellulose và acid acetic
[13]. Trong khi đó, Alina Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điểm
sinh học phân tử của chủng Gluconacetobacter (có khả năng tổng hợp cellulose)

và chủng đột biến (không có khả năng tổng hợp cellulose). Tác giả Neelobon và
cộng sự (2007) nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh,
nuôi cấy lắc, nuôi cấy bioreactor) đến khả năng hình thành màng [14]. Năm
2008, Barbara Surma và cộng sự [15] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và
ảnh hưởng của nguồn carbon, glucose, manitol đến sự hình thành màng; nghiên
cứu đặc điểm, cấu trúc màng cellulose và ứng dụng của nó trong sản xuất giấy.
1.2.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu còn khá mới mẻ, mới chỉ quan tâm
đến quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc màng. Về ứng dụng thực tiễn mới chỉ
ứng dụng thực tiễn cho quá trình trị bỏng như đề tài của nhóm tác giả Nguyễn Văn
Thanh (2007) ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Năm 2011, có nghiên cứu của tác giả
Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh [5] đã công bố 12
công trình nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylium tạo màng
Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”. Gần đây, nhóm nghiên cứu của
tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan đã thu nhận màng từ vi khuẩn Gluconacetobacter
xylinus và ứng dụng nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái tới
quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn

Sprirulina” [5].
Hiện nay các nghiên cứu chủ yếu đi sâu về ứng dụng chế tạo màng sinh
học trong trị bỏng và ứng dụng sản xuất thạch dừa. Hiện nay, việc nghiên cứu
tìm môi trường tối ưu cho khả năng hấp thụ thuốc đối với màng VLC còn mới và
ít thành tựu.

19


CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già.
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
* Giống vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus dùng lên men thu nhận vật liệu
VLC được nhập từ Nhật Bản, được dự trữ bởi Phòng sạch Vi sinh – Động vật,
Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, khoa Sinh – KTNN, trường ĐH Sư
phạm Hà Nội 2.
* Nguyên liệu và hóa chất
- Nguyên liệu: Nước dừa già, nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
- Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và hóa chất thông
thường có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam.
+

Diclofenac

+

Pepton

+
+

Đường glucose
Diamonium hydrogen phosphate (NH4)2HPO4

+

Amoni sunfat (NH4)2SO4

+

NaOH

+

Nước cất
Acid acetic CH3COOH

+

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV – Nhật Bản
- Cân phân tích, cân kỹ thuật – Nhật Bản
- Nồi hấp khử trùng, buồng cấy vô trùng – Trung Quốc
- Tủ sấy, tủ ấm, máy khuấy từ gia nhiệt – Nhật Bản
20


- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.3. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường nuôi cấy G. xylinus là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sunfur và phospho, các yếu tố tăng
trưởng và vi lượng. Để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo màng cellulose từ
G. xylinus tôi lựa chọn môi trường dinh dưỡng nước dừa già để nuôi cấy.
- Nước dừa già là môi trường thích hợp để thu VLC từ Gluconacetobacter

xylinus. Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích sinh
trưởng như: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol,…
- Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản trong 3 ngày, tránh để lâu

khiến hàm lượng đường và chất dinh dưỡng suy giảm. Thành phần môi trường
nước dừa già được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng môi trường nước dừa già [10]
THÀNH PHẦN

TỈ LỆ

THÀNH PHẦN

TỈ LỆ

Nước (%)

94,99

Kẽm (mg/100g)

0,1

Protein (%)

0,72

Đồng (mg/100g)

0,04

Chất béo toàn phần (%)

0,2

Mangan (mg/100g)

0,142

Carbonhydrat (%)

3,17

Selenium (µg/100g)

1

Đường (%)

2,16

Vitamin C (mg/100g)

2,4

Thiamin (mg/100g)

0,03

Riboflavin (mg/100g)

0,057

Calcium (mg/100g)
Sắt (mg/100g)

24
0,29

Magiê (mg/100g)

25

Niacin (mg/100g)

0,08

Phosphorus (mg/100g)

20

Acid Pathenic (mg/100g)

0,043

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B6 (mg/100g)

0,032

Natri (mg/100g)

105

Folate (mg/100g)

21

3


2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật Khoa Sinh – KTNN, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2018 đến tháng 3/2019
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tạo màng VLC lên men từ môi trường nước dừa già
VLC được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus lên men trong
môi trường nước dừa già (MTD)
Bước 1: Chuẩn bị các bình và dụng cụ và cho vào sấy. Với dụng cụ vật
liệu từ thủy tinh, sấy ở nhiệt độ 2000C, với các dụng cụ vật liệu từ nhựa, sẩy ở
nhiệt độ 500C. Sấy xong lấy ra để nguội dụng cụ.
Bước 2: G. xylinus được nuôi cấy trong môi trường cải biến môi trường
chuẩn bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già và được trình bày theo
Bảng 2.2.

Lưu ý: pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH;
pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm
những vi khuẩn khác.

22


Bảng 2.2. Môi trường dừa lên men tạo vật liệu VLC

Thành phần

MTD

Glucose

20g

Pepton

10g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Acid acetic

2%

Nước dừa già

1000ml

Dịch giống

10%

Bước 3: Hấp khử trùng các môi trường ở nhiệt độ 1130C trong 15 phút
(phải bọc các bình bằng giấy bạc).
Bước 4: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.
Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong
dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trường và dịch giống không bị
nhiễm khuẩn).
Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu,
dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở 280C.
Bước 7: Thu vật liệu VLC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước (xả nước nhẹ).
2.3.2. Xử lý VLC
Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời, phá
hủy và trung hòa độc tố vi khuẩn.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, màng VLC nổi trên bề mặt môi
trường, thu màng loại bỏ môi trường.
- Trong vật liệu chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy, hấp vật liệu trong
NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113 0C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng
để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời
gian 1 giờ.

23