Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi
để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong
quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp
mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự
tin.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Kim Dung – giảng
viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được
nhiều thành công trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu và giảng
dạy.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Giáo viên hướng dẫn
TS. Vũ Kim Dung

123doc : Tài Liệu IT

Sinh viên thực hiện
Tài Liệu IT

1


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

MỤC LỤC

123doc : Tài Liệu IT

2


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

DANH MỤC CÁC BẢNG

123doc : Tài Liệu IT

3


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

DANH MỤC CÁC HÌNH

123doc : Tài Liệu IT

4


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

ĐẶT VẤN ĐỀ
Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư

polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tử
pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện
trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt phải
kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trên
đối tượng cà rốt.
Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích
khá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ. Trước đây
nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta
đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và
mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme
này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển
nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọn
hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành,
tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công
nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009).
Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích
hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên
cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất
quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sản
xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp.

5


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về enzyme pectinase

1.1.1. Cơ chất pectin
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid
galacturonic bằng liên kết α-1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà
pectin có khối lượng phân tử 80.000 ÷200.000 Da.
Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri,
glycerine nóng.
Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết
với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không
tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thành
các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid,
vì vậy các pectin tan này không đồng dạng vớinhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng:
-

Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự nhiên có
khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng
methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và
trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên các
hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không
đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là α-D-galacturonan hay α-Dgalacturoglycan,

mạch

thẳng

có

cấu

tạo

từ

các

đơn

vị

D-

galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α-1,4). Mặt khác, mức độ oxy
hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định
các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường
hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa các nhóm
carboxyl và các nhóm acetyl.

6


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

-

Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid
là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic
acid. Pectate là muối của pectic acid.

-

Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo
hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân tử
cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường.
Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòa tan.
1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase
1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer
pectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose,
arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự
nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai trò
hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin
1.1.2.2. Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng như
bảng 1.1.
- Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.
Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate
7


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH 3)
đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic
và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối
ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+.
Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase

STT
1

Enzym (tên gọi theo
hệ thống)
Pectinpectinhydrolase

2

Poly-α-1,4
galacturonid-glycano
hydrolase-PG

3

Poly-α-1,4-Dgalacturonidgalacturo
n-hydrolase

4

Poly-α-1,4-Dgalacturonidmetilester
-glycanohydrolase

5

Poly-α-1,4-Dgalacturonid
digalacturonoliase

6

Poly-α-1,4-Dgalacturonid
glicanoliase

7

Poly-α-1,4-Dgalacturonid
metylester
glicanoliase

Enzym(tên
thường gọi)

Phản ứng xúc tác

Pectin + H2O = n metanol +
pectic acid
Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopoly
galacturonid trong
galacturonase
galacturonid không theo một
(endo-PG)
trật tự nào
Thủy phân liên kết α-1,4-DExopoly
galacturonid trong pectat,
galacturonase
trong galacturonic với sự
(exo-PG)
đứt mạch của acid
galacturonic
Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopolymetilgalacturonid trong pectin

galacturonase
không theo một trật tự nhất
(Endo-PMG)
định.
Thủy phân liên kết α-1,4-Dgalacturonid trong pectat với
Exo-pectatliase
sự tạo thành α-4,5
(exo-PKTE)
aciddegalacturonic không
theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopectatlias galacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự tạo
e (PETE)
thành nối đôi không theo
một trật tự nhất định
Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopectinlias galacturonid trong pectin
với sự tạo thành nối đôi
e (Endo-PTE)
không theo một trật tự nhất
định
pectinesterase

8


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

-

Polygalacturonase

(PG):

còn

có

tên

gọi

khác

là

poly

1,4-

galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α-1,4glycoside. Các exo-PG (exo-poly α-1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase,
phân cắt từ đầu không khử, và endo-PG (endo- poly α-1,4-D-galacturonide)
glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase
là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối
-

với cơ chất.
Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không
không bị ester hóa. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4-α-Dgalacturonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly (1,4-α-D-galacturonic) lyase)
đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp
cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa

nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase
không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các
enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình
gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và
làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:

- Pectin-transeliminase (poly 1,4-α-galaturonid-methylesteglucanolise) là enzyme
tác dụng lên pectin và pectinic acid.
-

Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4-α- galaturonid–glucanoliase)

-

là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester
hóa. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme.
1.1.2.3. Ứng dụng của enzyme pectinase

- Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase duới
dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm

9


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế
biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%.

- Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước
uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ tác
dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ dàng,
do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền
quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có
pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị đục và
lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme pectinase còn góp phần chiết rút
được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăng thêm
chất lượng thành phẩm.
-

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong

•

sáu nhóm enzyme sau:
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích sử dụng
nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được luợng

•

sản phẩm lớn.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa
pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và thuỷ
phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu

•

nguyên nhân làm đục nước quả.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và

•

thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm

•

tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở
sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu

•

vang.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong sản suất
siro thành phẩm.

10


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên
cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái
cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản
phẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được
màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cách
điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây
được chia làm hai loại:




Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi…
Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận



đen, dâu…
Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các

-

enzyme sau:
Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả.
Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly
Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc.
1.1.2.3.1. Làm trong nước quả

- Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào
năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rất phổ biến ở
nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu
bằng phương pháp ép. Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm lượng
pectine đáng kể. Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như sau:
•Syrup mơ: 0,107%
•Syrup mận: 0,153%
•Nước mận: 0,452%
Lượng pectin này làm cho syrup quả bị keo và đục, có độ nhớt cao,
nhất là khi quả có độ acid và hàm lượng đường cao như các lọai syrup kể trên
-

Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì pectinase phải
có enzym endo và exo-polygalacturonase, enzym pectinestenase. Trong chế
phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu
quả của chế phẩm. Vì endo và exo-polygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt
của dịch quả, còn enzyme PE cũng góp phần vào tác dụng của enzym này.
11


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh
tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của
cellulase và hemicellulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc.
Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép
có enzyme pectinaseliminase và enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn
các tế bào riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm
tăng độ nhớt của dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược
lại, khi sử dụng cho các loại quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế
phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho
tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm
xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả
trong cũng không được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase,
poliphenoloxydase).
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase và
cellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế
phẩm.Trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ
protopectin của mô quả. Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho
độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm không chứa enzym

oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không chứa
enzym phá huỷ các chất này.
Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase,
người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhanh được đem
xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử
dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho
tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá
trình ép sau này.
Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm
trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ
tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn
12


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

toàn. Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một
phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất
hoà tan.
Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại
trừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn.
Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn
toàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn.
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể
chia làm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một
cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ”
+ Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi
kết tủa hoàn toàn.
+ Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các

pectin kết tủa bởi ion canxi
- Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt độ 1,950
đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768 đvhđ/1g canh
trường (theo phương pháp so màu). Dưới tác dụng của pectinase, pectine một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử
acid galacturonic (C6H10O7) mà một phần đã được este hoá với rượu metylic
(CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic. Pectine là 1 chất
điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc theo chiều dài của
mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (-COO-) nên mạch
có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong toàn bộ dung dịch
có chứa pectin. Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó phần tử thịt quả có
kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn nên không bền
vững về mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng là những phân tử tích điện nên
dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành những phân tử
lớn dễ dàng lắng xuống. Trong nước quả, sự có mặt của hợp chất polyphenol
(đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa không tan v.v... Sự có mặt
13


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên. Xác định giá trị
mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thời gian để so sánh
tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu.
- Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó
ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Khi ta cho
pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép
tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,030,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ
phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ. Dịch quả thu được bằng
pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ.
1.1.2.3.2. Trong sản xuất rượu vang

Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ. Enzyme
Môi được
trường
Dụngkhi
cụ nuôi
cấy các men rượu trong
pectin
thêm vào các loại trái cây trước
bổ sung

quá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục. Rượu vang
đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang không
Hấp khử trùng

Hấp khử trùng

được bổ sung enzyme. Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn
so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme.
1.1.2.4. Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase
Để nguội

Để nguội

1.1.2.4.1. Nguồn gốc thu nhận

•

Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi
sinh vật là một loại enzyme rất phong phú. Vi sinh vật phân giải pectine hầu





cụnấm men, vi khuẩn như:
như có mặt ở các đại Phối
diệnvào
nấmdụng
mốc,
Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…
Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …
Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum…
CấyPhương
vào môi trường
giống
1.1.2.4.2.
pháp nuôi cấyNhân
bề mặt



Quy trình sản xuất

Nuôi cấy trong 36 giờ

14

Thu nhận enzyme thô

Giống vi sinhvật

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

15


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2


•

Thuyết minh quy trình:
Môi trường nuôi cấy
Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô
mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng
nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng
và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra
nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải
đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao.
Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí
tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy
gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác
(mầm mạ, nước khoai tây… để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali…).
Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì
nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi
trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh.

•

Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có

•

sẵn các giá.
Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 1210C/1atm/30 phút

•

để tránh tạp nhiễm.
Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được
thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30 0C thì tiến hành

•

cấy giống.
Giống
Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh
nhiễm tạp. Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi
trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để
cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo
phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín.

16


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào
10kg môi trường.

•

Nuôi cấy
Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn
các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.
Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32 0C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C
thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy
sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3
giai đoạn:



Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau:
Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.
Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm



thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ.
Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay

•

đổi.
Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ: giai đoạn này có những thay đổi sau:

•


Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt
thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi
trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng trong
môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế
bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ.
Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 400 - 450C. Thời kì này cần phải thông khí
mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O 2 cho mốc thở và
đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt
độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 30 0 C và độ ẩm trong phòng
khoảng 90%.
Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được
hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.

17


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

•

Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này có những biến
đổi
Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí
không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng
nuôi duy trì ở 300C.
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy
có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn được
hình thành ở giai đoạn này.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền

nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế
phẩm enzyme thô.
1.1.2.4.3. Thu nhận enzyme
a. Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có
phương pháp tách và thu nhận riêng:

•

Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường
nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh

•

sạch.
Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và
không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi
được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải
phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu
được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn
enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh
sạch.
Enzyme nội bào
Khó tách

Enzyme ngoại bào
Dễ tách
18

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Phải phá vỡ thành tế bào
Không cần phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung với các chất khác của tế Không lẫn chung với các thành
bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất phần nội bào, nếu có chỉ là một
nguyên sinh, lipid…)
vài enzyme ngoại bào khac
Chỉ bền vững trong môi trường nội bào
Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ
trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt

hơn

+ Từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch
muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho
thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong
sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme
trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường
dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28 0C. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một
ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá
trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C.
Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện
nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và
axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Như
ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì vậy, các enzyme,
các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung
môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.

Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ
cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh
mất hoạt tính của enzyme dịch phải được làm lạnh xuống 3 – 5 oC. Khi trộn phải
khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa, lắng xuống dưới cần tách ly ngay.

19


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc
•

+ Từ môi trường nuôi cấy bề sâu
Phương pháp hiếu khí
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của
vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi
lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy
thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp
sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả
khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh
hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm
lượng từ 2-10%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm
20


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào

tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy
thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi
trường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô
đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi
sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi
vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC. Thời gian lưu của chế phẩm
enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm
sau khi sấy phải không quá 40oC. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín
để tránh hút ẩm.
•

Phương pháp yếm khí
Môi trường: bã củ cải 2%; (NH 4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3
0.3%; nước chiết ngô 0.5%
Clostridium pectinofermentants15 có khả năng tổng hợp pectinase một
cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời
với sự tích luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn
định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi trường dinh
dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh
trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi
cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC.
C.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành
phần môi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH 4)2HPO40,4%;
K2HPO4 0,7%; KH2PO4 0,3%; NaCl 0,1%; MgSO4 0,025%; FeSO4 dạng vết;
CaCO3 0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid 0,5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết
tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết
tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa
21

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với
hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu được
chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là
0,9-1,0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và
exopolygalacturonase.
1.1.2.5. Đặc điểm của enzyme pectinase
 Pectinesterase:
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu
khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn
của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0
đến6,5. Trái lại pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật là từ 6 đến 7,5
– 8.
Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45 0C. Từ 55
đến 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme
pectinesterase từ thực vật cao hơn: từ 55 – 600C.
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có
nhiệt độ tối ưu là 30 – 45 oC, pHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62 oC và từ
thực vật (pHopt=7,5-8, toopt= 55-60oC). Khả năng hoạt động của chúng phụ
thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt
là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ
nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger. Trái lại các cation hóa trị 3
và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác
dụng của pectinesterase
 Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn

vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại
bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces
22


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

fragilis, Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum,
neurosrora crassa, các loàiAscomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium
oxysrorum.
pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào
nguồn

thu

và

cơ

chất.

Chẳng

hạn

polygalacturonase

dịch

hóa

(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằm
trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì
lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi
tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid
pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6.
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6.
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa
bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5.
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40
-450C. Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô
hoạt khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C.
1.1.2.6. Trung tâm hoạt động của pectinase
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với
2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và
Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả
năng xúc tác của enzyme.
1.1.2.7. Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới
Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme loài
người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong công
nghiệp. Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme
được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Các enzyme quan

23


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày qua bảng

sau:
Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp

Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme

1.1.3. Tổng quan về Aspergillus niger
1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
A. niger đã là chủ đề được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp
trong nhiều thập kỷ qua. Năm 1919, A. niger được sử dụng để sinh tổng hợp
citric acid và đánh dấu tầm quan trọng trong sản xuất citric acid trong quy mô
công nghiệp. Ngoài ra, A. niger còn có khả năng sinh tổng hợp acid gluconic,
24


Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

acid fumaric. Tuy nhiên, kể từ năm 1960, A. niger đã trở thành nguồn sinh
tổng hợp một loạt các enzyme tham gia vào kỹ thuật chế biến hoa quả, bánh
và trong các ngành công nghệ tinh bột và thực phẩm. Công nghệ gen đã áp
dụng thành công để cải thiện quy trình sản xuất và sử dụng các chủng A.
niger như một hệ thống biểu hiện các protein ngoại lai. Các nghiên cứu đẩy
mạnh trong thập kỷ qua đã mang lại nhiều thành công và các sản phẩm mới
(E. Shuster và cs,2002).
A. niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi
trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều
vùng trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong công
nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase,
protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản
xuất một số acid hữu cơ như citric acid, acid gluconic,…(Pansear và cs,2010).
1.1.3.2. Đặc điểm, phân bố

A. niger là một loại nấm sợi và một trong những loài phổ biến của chi
Aspergillus có nhiều công dụng trong công nghệ sinh học, A. niger phát triển
ở nhiệt độ tối ưu 35–37oC, pH từ 1,4–9,0.
Cơ quan sinh sản của A. niger có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào
tử đính phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các
đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi
cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình
cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể
bình màu nâu, dài 10÷15 µm là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một tầng
hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể
bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể
bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già. Bào tử
đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4 – 5µm nhưng thường nhỏ hơn

25