Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen matk ITS của một số mẫu cây thuộc chi dương đồng (adinandra)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY
THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY
THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, năm 2019

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019
Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang
XÁC NHẬN

XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

TS. Nguyễn Hữu Quân

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn
Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái
Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Phạm Văn Khang, giảng viên
Khoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên
phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật
viên phòng thí nghiệm Thực vật học và các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thí
nghiệm Khoa Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại
học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt quá
trình nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và
Giáo dục sinh học, bộ phận sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và
giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài KH&CN Quỹ NAFOSTED “Phân
tích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung
thư và kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở
Việt Nam” mã số 106.02-2018.338.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019
Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................... ii
MỤC LỤC............................................................................................................. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... vi
MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1
1. Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................1
3. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................3
1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng ( Adinandra ).............................3
1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra)...................................5
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học..................Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học....................................................................................... 8
1.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật......................... 11
1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc..................14
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro............................... 16
1.6. Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol...............18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 21
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu..................................................... 21
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất, thiết bị.......................................................................................... 21
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................ 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 22
2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái................................................................. 22
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật.................................................................. 22
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 24
iii


2.2.4. Phương pháp hóa sinh................................................................................. 26
2.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết............................... 28

2.2.6. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả...................................................... 29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................... 30
3.1. Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii..................... 30
3.2. Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii................................................... 31
3.2.1. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây....................................................... 31
3.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây................................................. 32
3.3. Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii....................34
3.4. Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây Adinandra
lienii....................................................................................................................... 39
3.4.1. Định tính polyphenol................................................................................... 39
3.4.2. Định tính các flavonoid............................................................................... 40
3.4.3. Định tính các coumarin................................................................................ 40
3.4.4. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A. lienii...........41
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii........................ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 46
1. KẾT LUẬN....................................................................................................... 46
2. KIẾN NGHỊ...................................................................................................... 46
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN...............47
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 48


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt

Tên tiếng Anh

Nghĩa tiếng việt

APG II

An update of the Angiosperm Hệ thống phân loại thực vật
Phylogeny Group classification for the ordors and families of
flowering plants

Bp

Cặp bazơ nitơ

DMSO
DNA

Base pair
Dimethyl sulfoxide
Deoxyribonucleic acid

EC50

Effective dose 50%

Liều hiệu quả đáp ứng 50%

EDTA

Ethylene diamine tetraa acid cetic

Etylen diamin tetraxetic Axit

ELISA

Enzyme linked
immunosorbentassay

Thử nghiệm miễn dịch gắn
enzyme

EtOH

Ethyl acetatae

Hep G2

Hepatocellular carcinoma human

Ung thư gan ở người

IC50

Inhibitory concentration 50%

ISSR

Inter Simple Sequence Repea

Nồng độ ức chế 50% cá thể
Đánh giá sự sai khác di truyền
ở thực vật.

ITS

Internal transcribed space
Luria Bertani

Vùng gen ITS
Môi trường nuôi cấy chủng vi

matK

matK maturase

sinh vật
Gen matK

MCF-7

Ardeno carcinoma

Ung thư vú

MeOH
MIC
MS/MS

Methanol
Minimalinhibitory concentration
Mass spectrometry

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

RAPD

Random Amplification

Đa hình DNA nhân bản ngẫu

RNA

of Polymorphic DNA
Ribonucleic acid

nhiên
Ribonucleic Axit

rRNA

RNA ribosome

Riboxom RNA

TTC

Triphenyl tetrazolium Chloride

Chỉ thị màu

LB

Deoxyribonucleic Axit (DNA)

iv

Nồng độ tối thiểu ức chế
Phương pháp khối phổ


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam.............................3
Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên
2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7.......................................................................... 10
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm................................................. 21
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm......................................................... 22
Bảng 2.3. Thông tin về cặp mồi nhân gen matK................................................... 25
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK.......................................... 25
Bảng 3.1. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích...36
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen
matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra............................ 38
Bảng 3.3. Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A. lienii................................. 42

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra).......................4
Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida....................6
Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida.........................................7
Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida........................................................8

Hình 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro..................17
Hình 1.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký........18
Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A. lienii..............................26
Hình 3.1. Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai,
tháng 3, năm 2018)................................................................................................ 30
Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. lienii................................................... 32
Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A. lienii............................................. 33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A. lienii......34
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii thu tại Lào Cai .. 35

Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài
A. lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI 36
Hình 3.7. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A. lienii thu tại
Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank..................37
Hình 3.8. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK
39
Hình 3.9. Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b)..........39
Hình 3.10. Định tính các flavonoid....................................................................... 40
Hình 3.11. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b)..............41
Hình 3.12. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi
n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1...................................................................................... 41
Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi
dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1....................................................................... 41
Hình 3.14. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis.................43
Hình 3.15. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L. plantarum............43

vi


Hình 3.16. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. aureus..................44

Hình 3.17. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli........................ 44
Hình 3.18. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens...........45
Hình 3.19. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea.....................45


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vấn đề sức khỏe của con người ngày nay đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng
trước các biến đổi của khí hậu, ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm dẫn tới
xuất hiện các bệnh hiểm nghèo như ung thư. Do đó, việc tìm ra phương pháp hiệu
quả để điều trị các bệnh liên quan tới ung thư là vấn đề cấp bách và đặt ra nhiều
thách thức lớn cho các nhà khoa học. Trước thực trạng đó, những nghiên cứu để
phát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật để sử dụng làm
thuốc chữa bệnh cho người là cần thiết. Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh học
của thực vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng
(Adinandra), họ Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư.
Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụng
sinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tính
kháng viêm, chống độc và giảm đau, chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống
ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh. Ở Việt Nam, những
nghiên cứu về chi Adinandra mới chỉ tập trung ở việc thống kê danh sách thành
phần loài. Còn về đặc tính sinh học cũng như thành phần hóa học của chúng chưa
được nghiên cứu.
Hiện nay, một số loài thuộc chi Dương đồng như Adinandra bockiana,
Adinandra glischroloma và Adinandra lienii bước đầu được nghiên cứu về vị trí
phân bố địa lý. Những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học cũng
như trình tự vùng gen matK/ITS của các loài trên chưa được tác giả nào thực hiện.
Vì vậy, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như xây dựng mã vạch DNA từ
một số loài thuộc chi Adinandra, trong đó có loài A. lienii là rất cần thiết. Xuất
phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi
Dương đồng (Adinandra)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giải
phẫu, hình thái.
- Xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi
Dương đồng (Adinandra).

1


3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra lienii.
- Phân lập và giải trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài A. lienii.
- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính
kháng khuẩn từ cao chiết của loài A. lienii.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra )
Chi Adinandra (thuộc họ Chè Theaceae) thường là cây bụi hay cây nhỡ, có
khoảng 85 loài phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,
Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [39]. Ở Việt Nam, chi
Adinandra đã được tìm thấy có 13 loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng,
Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1)
[9]. Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986
nhưng mới được công nhận vào năm 2012. Loài Sum Hòn Giao Adinandra

hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [34].
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam
TT

Tên l ài

Tên thường gọi

Phân bố

1
2

Adinandra annaenzymesis
Adinandra caudata

Sum đỏ
Sum đuôi

Quảng trị
Bạch Mã

3

Adinandra donnaiensis

Sum đồng nai

Đồng Nai

4

Adinandra glischochroma

Sum lông

Sapa

5

Adinandra hainanensis

Sum Hải Nam

Hải Ninh

6

Adinandra integerrima

Sum nguyên

Miền Trung

7

Adinandra microcarpa

Sum trái nhỏ

Hòn Bà

8

Adinandra millettii

Sum millett

Sapa, Tam Đảo

9

Adinandra petelotii

Sum petelot

Sa a

10

Adinandra poilanei

Sum poilan

Lâm Đồng

11

Adinandra rubropunctata

Sum điểm đỏ

Tiên Yên, Quảng Trị

12

Adinandra lienii

Sum Liên

Lào Cai

13

Adinandra hongiaoensis

Sum Hòn Giao

Lâm Đồng

Chi Dương đồng Adinandra thuộc họ Theaceae, bộ Theales, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [40].
Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm. Các
hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng chữa bệnh như giảm
huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau. Đặc biệt, flavonoid đã được

3


tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ

các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại
một số loài vi khuẩn gây bệnh.
Ngoài ra, trong các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai
trò quan trọng trong lĩnh vực y học. Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học
cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung
thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn,.... Cây Sum millett (A. millettii) được sử dụng

điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A. integerrima được dùng để trị bong gân,
rắn cắn. Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A. Hainanensis (A.
rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [5].

A

B

C

D

Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)
A: A. hongiaoensis, B: A. millettii, C: A. dumosa, D: A. glischroloma

4


Chi Adinandra là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung. Lá đơn,
mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn. Hoa mọc đơn ở nách lá, lưỡng tính,
hoa mẫu 5. Lá đài có lông mềm hoặc lông ráp. Cánh hoa không lông hay chỉ có
lông ở mặt ngoài. Nhị nhiều, có khoảng 25 nhị. Bao phấn có lông ngắn hoặc dài và
có mũi nhọn. Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều. Quả khô không

tự mở; hạt nhiều, nhỏ (Hình 1.1) [40].
1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra)
Ở Việt Nam hiện nay chưa có công bố nào về các loài thuộc chi Adinandra.
Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc các nghiên cứu về chi Adinandra thường tập
trung ở loài Andinandra nitida. Loài A. nitida là cây thuộc vùng nam Trung Quốc,
lá cây được sử dụng lâu năm làm chè uống (Shiyacha) và thuốc dược liệu tốt cho
sức khỏe. Loài A. nitida có nhiều tác dụng điều trị như kháng khuẩn, giảm đau,
giảm huyết áp. Ở Trung Quốc, loài A. nitida còn được sử dụng trong nhiều công
thức bào chế, thang thuốc để điều trị ung thư, chống oxy hóa. Các nghiên cứu về
chi Adinandra tập trung vào 02 hướng: (1) Nghiên cứu về thành phần hóa học, (2)
Nghiên cứu về hoạt tính sinh học.
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Lá của cây A. nitida được sử dụng lâu năm làm chè uống và thuốc dược liệu
tốt cho sức khỏe, tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu khoa học về thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của loài A. nitida. Các nghiên cứu cho thấy thành
phần hóa học của loài A. nitida được phát hiện thuộc nhóm là flavonoid, flavonoid
glycoside và triterpene saponin [29], [30], [35], [37].
Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố phân lập được 6 hợp chất apigenin
(1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4), nigaichigoside F2 (5),
và peduncloside (6) trên tạp chí Trung Quốc (Hình 1.2) [35].
Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại
camellianin A từ lá của loài A. nitida Merr. ex Li bằng phương pháp HPLC và
chứng minh được khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng
phương pháp làm sạch DPPH và các gốc tự do [28]. Cùng hướng nghiên cứu này,

5


Liu và cộng sự (2013) đã phân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và
thu được camellianin A từ lá của loài A. nitida; đồng thời chứng minh được khả

năng chống oxy hóa của flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml [27]. Như vậy, một số
nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin A
và camellianin B có hoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa.

Apigenin (1)

Camellianin A (2)

Quercitrin (3)

Kajiichigoside F1 (4)

Nigaichigoside F2 (5)

Peduncloside (6)

Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida
Bằng một số phương pháp sắc ký cột, thành phần hóa học của loài A. nitida đã
được Wang và cộng sự (2008) phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chất
saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12 en-28-oic
acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin (7); sericoside (8); glucosyl tormentate
(9); nigaichigoside F1 (10) và arjunglucoside I (11). Trong đó chất 2alpha, 3alpha,

6


19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D glucopyranoside là hợp
chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện trong loài A. nitida [36].

Arjunetin (7)

Sericoside (8)

Nigaichigoside F1 (9)

Glucosyl torenzymetate (10)

Arjunglucoside I (11)
Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida
Bên cạnh các nghiên cứu của Wang về thành phần hóa học, một số nhóm
nghiên cứu ở Trung Quốc như Liu B và cộng sự (2010), Zhang J và cộng sự
(2006) lại tập trung vào phân tích thành phần flavonoid, thành phần chiếm hàm
lượng lớn (> 20%) có trong lá A. nitida với camellianin A là thành phần chính
[30], [37]. Theo nghiên cứu của Liu B và cộng sự (2010) , hàm lượng camellianin
A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ
41,98; 2,67 và 1,73% tương ứng [30]. Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong
dịch chiết EtOH.

7


Sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích thành
phần hóa học đã có hơn 57 chất đã được phát hiện trong dịch chiết MeOH lá A.
nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13),
camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối
lượng phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.4) [37].

Camellianin A (2)

Rhoifolin (13)

Camellianin B (14)

Epicatechin (12)

Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida
Một nghiên cứu khác từ Liu năm 2008 về phân tích thành phần hóa học bằng
phương pháp GCMS của dịch chiết siêu tới hạn CO 2 lá của cây A. nitida và phát
hiện được 16 hợp chất với γ-sitosterol là thành phần chính (47,56%). Một số hợp
chất khác 3, 7, 11, 15-tetramethyl -2-hexadecen-1-ol, nonacosane, 9, 12octadecadienal, vitamin E, γ-tocopherol, stigmasterol được phát hiện với hàm
lượng từ 2,16-16,98%. Tuy nhiên dịch chiết MeOH thì tương tự như các nghiên
cứu khác, chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14)
và aglycon apigenin (1) [29].
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Loài A. nitida đã được nghiên cứu các tác dụng sinh học khác nhau như
chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp) và chống ung thư
[24], [25], [29], [30].

8


Năm 2010, Liu và cộng sự đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chế
enzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B
và apigenin. Trong tác dụng chống oxy, kết quả cho thấy IC 50 của dịch chiết
EtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 14,74 μg/ml, 1,62
mg/ml, 1,8 mg/ml, và 0,95 mg/ml. Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất
flavonoid kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH và
Rancimat (khoảng 100 lần). Kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá cây
A. nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác [30].
Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin converting

enzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin có
tác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH. Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzyme
chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenin
tương ứng là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27%. Hoạt tính ức chế enzyme chuyển của
dịch chiết EtOH có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [30].
Do lá cây A. nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung thư,
hợp chất chính camellianin A (hàm lượng được xác định chiếm 19,25% bằng HPLC
được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư Hep-G2 và ung
thư vú MCF-7. Ở nồng độ 200 μM, camellianin A ức chế 33,8% và 8,7% tế bào ung
thư MCF-7 và Hep-G2. Có thể thấy tác dụng độc tế bào của camellianin A là khá yếu.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tế bào ở
giai đoạn G0/G1. Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai đoạn đầu
của quá trình chết tế bào được phát hiện. Như vậy, camellianin A không chỉ ảnh
hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào đi vào
chu trình chết tế bào (apoptosis) [25].

Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự (2015) khi so sánh thành phần phenolic
của 4 loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A. nitida, A. glischroloma var.
jubata, A. millettii và A. latifolia về tác dụng chống oxy hóa và so sánh chống ung
thư của 4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 [24].
Hàm lượng các hợp chất phenolic trong A. nitida cao nhất là 140,54±1,04
mg/g, tiếp đến loài A. millettii (125,96±3,19 mg/g), loài A. glischroloma var.
9


jubata (84,14±2,97 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất (71,29 ±
2,69 mg/g). Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A. nitida là cao nhất
88,72±2,13 mg/g, tiếp đến là loài A. glischroloma var. jubata (44,74±1,79 mg/g)
và loài A. millettii (43,54±1,48 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng flavonoid ít
nhất (19,13 ± 0,54 mg/g). Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu,

tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A. nitida và A. millettii có tác
dụng tốt hơn so với loài A. jubata và A. latifolia. Điều này có thể được giải thích
là phù hợp với hàm lượng các hợp chất phenolic có trong các loài này. Dịch chiết
của các loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá
trình nhân lên của tế bào ung thư. Các dịch chiết có thể ức chế với EC 50 từ 1,056,44 mg/ml trên tế bào ung thư gan Hep-G2 và EC 50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên tế
bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2).
Thành phần hợp chất flavonoid của loài A. nitida có chứa camellianin A,
camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài A.
milettii chưa được phát hiện [24].
Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên
2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7
Loài

EC50 (mg/ml)
Hep G2

MCF-7

A. nitida

1,49 ± 0,023

2,26 ± 0,19

A. millettii

1,05 ± 0,089

2,43 ± 0,23

A. jubata

1,85 ± 0,056

8,02 ± 0,32

A. latifolia

6,44 ± 0,46

4,01 ± 0,12

Như vậy, tác dụng sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi
Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu. Việc tiến hành nghiên
cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm hiểu biết thêm về thành phần
hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Dựa trên phương pháp hoạt tính dẫn đường,
kết hợp với phương pháp sắc kí phổ hiện đại, các hợp chất mới có tác dụng chống
ung thư trong chi Adinandra sẽ được phát hiện.

10


1.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật
Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ
yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ
vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp phân loại truyền thống này
trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều sinh vật
có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân
loại (hệ gen rất khác nhau). Ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau
nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác,

phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân
biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật
có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái như là những mẫu sinh vật đã
chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không
thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoa
học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép
các nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền
giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có
thể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá
thể, quần thể hay xuất xứ. Việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử
DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật
khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công
cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã
vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối
quan hệ di truyền giữa các loài [38].
Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của
sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau.

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên
cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen matK mã hóa cho
tRNALys (UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong
intron của gen trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen

11


matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn
những gen khác có trong lục lạp. Do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan
trọng để giúp phân loại thực vật [33].
Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã

vạch DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu
tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một
ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực
vật, vi sinh vật,...) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản
lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.
Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm đầu tiên về mã vạch DNA nhằm
giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm
trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh
vật với nhau [26].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sở
nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đối
tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở
dữ liệu về mã vạch DNA. Vũ Thị Thu Hiền và Đinh Thị Phòng (2011) đã sử dụng
kỹ thuật DNA vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ trắc đỏ
(Dalbergia cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả
nghiên cứu đã cho thấy, trong số 51 chỉ thị phân tử (28 chỉ thị RAPD và 23 chỉ thị
ISSR) phân tích cho 35 mẫu D. cochinchinensis thì có 31/51 chỉ thị (12/28 RAPD
và 19/23 ISSR) cho tính đa hình. Tổng số có 163 phân đoạn DNA được nhân bản
thì có 99 phân đoạn đa hình (chiếm 60,74%), số lượng các phân đoạn nhân bản
dao động từ 1 đến 8 với kích thước nhân bản trong khoảng 250 bp đến 2000 bp.
Mối quan hệ di truyền của 35 mẫu D. cochinchinensis được thể hiện trên sơ đồ
hình cây, đã phân ra làm 02 nhánh và có hệ số sai khác di truyền dao động trong
khoảng 5,1% (1-0,949) đến 29,3% (1-0,707). Nhánh chính I duy nhất là mẫu DC9
với hệ số sai khác di truyền với các mẫu còn lại khoảng 29,3% (1-0,707). Nhánh
chính II bao gồm 34 mẫu còn lại và có hệ số sai khác di truyền dao động trong
khoảng từ 5,1% (1-0,949) đến 26,0% (1-0,740) [7].

12

Năm 2013, Trần Thu Hoa và cộng sự đã tiến hành “khảo sát đặc tính dược
liệu và bước đầu định danh bằng trình tự gen ITS và matK cho một mẫu Ngải mới
tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang” nhằm hướng đến ứng dụng trong việc điều
chế các thuốc chữa bệnh, nhóm nghiên cứu đã thu thập được hơn 20 mẫu cây họ
Gừng có tên bắt đầu bằng chữ “Ngải” tại vùng núi Cấm. Đặc điểm chung của các
mẫu này là hình thái của chúng khá giống nhau. Trong đó, loài “Ngải sậy củ lớn”
(tên phổ thông thường gọi ở vùng núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang) đã được chứng
minh là cây thuốc có tiềm năng trị ung thư. Nhóm nghiên cứu đã xây dựng cây
phát sinh loài [8].
Hà Văn Huân (2014) đã lựa chọn gen matK để làm mã vạch phục vụ cho các
nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng cao
hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam. Trên cơ sở các
thông tin của gen matK đã công bố, một cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế để
nhân dòng gen matK từ DNA tổng số của 3 mẫu Sến mật trồng tại Thanh Hóa (S1,
S2 và S3). Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Trình tự nucleotit của gen matK
phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 dài 1521 nucleotit, trong đó, trình tự nucleotit của
gen matK ở mẫu S1 và S3 giống nhau 100%, trình tự nucleotit của mẫu S2 có sai
khác với hai mẫu S1 và S3 duy nhất 1 nucleotit ở vị trí 877 (C được thay thế bằng
G). Trình tự nucleotit của gen matK phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 (được ký hiệu
là Senthanhh) có sự tương đồng đến 98,43% so với trình tự nucleotit của gen
matK ở cây Sến lá to (Madhuca macrophyll) đã công bố trên GenBank (mã số:
DQ924091.1). “Senthanhh” có thể được sử dụng là cơ sở dữ liệu quan trọng phục
vụ cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần
nâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam [10].
Năm 2015, Hà Văn Huân và cộng sự đã tiến hành “ Xác định đoạn mã vạch
DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) loài cây đặc hữu của
Việt Nam”. Nghiên cứu đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn DNA
tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR. Đã xác định được trình tự
nucleotide của đoạn gen matK của các mẫu sản phẩm PCR có kích thước 951 bp.
So sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matK

ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Kết quả so sánh cho thấy trình tự
nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo so với ở cây Trà vàng

13


lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng
petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613. Trình tự đoạn gen
matK phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài Trà
hoa vàng của Việt Nam [11].
Lê Thanh Hương và cộng sự (2017) đã nghiên cứu “ Ứng dụng mã vạch DNA
hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm (Panax L.)”. Trong nghiên
cứu này, 5 mã vạch phân tử tiềm năng là 18S, ITS, matK, psbA - trnH và rbcL được
sử dụng để đánh giá khả năng phân biệt loài của 11 mẫu sâm nghiên cứu. Phân tích so
sánh các trình tự nhận được với 41 trình tự của 9 loài thuộc chi Nhân sâm (Panax L.)
đã được công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế cho thấy vùng 18S có độ tương đồng
giữa các cặp trình tự cao nhất, trình tự của các loài tương đồng trung bình đạt 99,87
%. Tiếp đến là vùng rbcL, matK và psbA - trnH với tỷ lệ tương đồng trung bình lần
lượt là 99,27 %, 98,66 % và 96,82 %. Mức độ đa hình thể hiện rõ trên vùng ITS với tỷ
lệ tương đồng trung bình thấp nhất, chỉ đạt 96,50 %. Các biểu đồ hình cây về mối
quan hệ phát sinh loài cho thấy có 4 trong 11 mẫu sâm là Sâm Ngọc Linh ( Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) và 3 mẫu là Tam thất hoang (Panax stipuleanatus). Kết
quả nghiên cứu cũng cho thấy 4 mẫu có hình thái của Sâm Vũ diệp (Panax
bipinnatifidus) được nhận dạng phân tử là loài Tam thất hoang. Ngoài ra nghiên cứu
cũng cho thấy, chỉ thị ITS và psbA - trnH là hai chỉ thị tiềm năng, hỗ trợ định danh
Sâm Ngọc Linh và Tam thất hoang [12].

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng
dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền,
bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.

1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc
Năm 1992, Nakatomi và cộng sự đã nghiên cứu về các hợp chất alkaloid có mùi
hăng của cây Cúc áo. Nghiên cứu nhận thấy cặn chiết từ cây Cúc áo có khả năng ức chế
được nhiều loại vi sinh vật: Staphylococcus albus, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Salmonella gallinarum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris và nấm
enzyme Candida albicans [31]. Năm 2006, Mai Sỹ Tuấn và cộng sự đã nuôi cấy in vitro
thành công được cây Cúc áo. Bước đầu công bố khả năng kháng tế bào ung thư

14


biểu mô vòm họng, tế bào ung thư vú ở người và kháng vi sinh vật kiểm định của
cặn chiết thô từ chồi cây Cúc áo nuôi trên môi trường thạch [22].
Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu dịch chiết
của quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) đều có khả năng kháng với 4 loại vi sinh vật
kiểm định gồm S. aureus, Salmonella typhi, E. coli và Bacillus pumilus. Trong đó,
loài S. aureu là chủng nhạy cảm nhất với dịch chiết [13]. Năm 2015, Bùi Thị Lê
Minh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tỏi (Allium sativum L.)
trên vi khuẩn E. coli và ảnh hưởng của tỏi lên sự sinh trưởng của gà được bổ sung
tỏi tươi vào khẩu phần thức ăn tại Đại học Cần Thơ. Kết quả nghiên cứu cho thấy
các khuẩn E.coli nhạy cảm với dịch chiết tỏi tươi với giá trị MIC 12,5-35 µg/ml;
sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn ở các khẩu phần ăn có bổ sung thêm tỏi
và không bổ sung thêm là khác nhau, việc bổ sung thêm tỏi tươi vào khẩu phần
thức ăn của gà phòng được bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra [18].
Năm 2017, Bùi Kim Anh và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của Củ ngải đen. Từ dịch chiết methanol của thân rễ ngải
đen (Kaempferia parviflora) nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất
tectochrysin (1), apigenin 7,4'-dimethyl ether (2) 3,5,7-trimethoxyflavon (3), 5,7dimethoxyflavon (4), β-sitosterol (5) và daucosterol (6). Cấu trúc của các hợp chất
được xác định bằng việc phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với số liệu đã công
bố. Cặn chiết MeOH và hợp chất 4 thể hiện hoạt tính độc tế bào ở dòng ung thư

biểu mô-KB với giá trị IC50 lần lượt là 55,21 và 14,95 μg/ml [1].
Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự (2017) đã phân lập các hợp chất phenolic
từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương. Từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương, 4
hợp chất đã được phân lập bao gồm epoxyconiferyl alcohol (1), salicifoliol (2), 5(hydroxymethyl)-2-furaldehyd (3) và ethyl caffeat (4). Cấu trúc của các hợp chất
này được xác định bằng các phương pháp phổ như 1D - NMR, ESI - MS và so
sánh với các dữ liệu đã công bố. Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên
từ cây Tỏa dương. Hợp chất 1, 2 và 3 được công bố lần đầu tiên từ chi
Balanophora [2].

15