Nghiên cứu sự phân bố của các Trimer trong các trình tự Sense và Antisense của các nhiễm sắc thể vi khuẩn Burkholderia Lata

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN THỊ HƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC TRIMER TRONG
CÁC TRÌNH TỰ SENSE VÀ ANTISENSE CỦA CÁC
NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN BURKHOLDERIA LATA
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA -ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Phan Thị Huyền (Ghi rõ họ, tên, học hàm,
học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng (Ghi rõ họ, tên, học
hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trần Trung Hiếu (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học
vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 21
tháng 07 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2. Thư ký: TS. Hoàng Mỹ Dung
3. Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
4. Phản biện 2: TS. Trần Trung Hiếu
5. ủy viên: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Trần Thị Hương Thảo

MSHV: 1670262

Ngày, tháng, năm sinh: 09/12/1993

Nơi sinh: Kiên Giang

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 02 01

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense và
antisense của các nhiễm sắc thể vi khuẩn Burkholderia lata.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense
và antisense của các nhiễm sắc thể khác nhau của vi khuẩn Burkholderia lata 383.
NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :(Ghi theo trong QĐ giao đề tài) 10/07/2017.
NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:(Ghi theo trong QĐ giao đề tài) 03/12/2017. CÁN
Bộ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS. Phan Thị Huyền.
Tp. HCM, ngày 13 tháng 07 năm 2018
CÁN BỘ HƯỞNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TS. Phan Thị Huyền

PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam

LỜI CẢM ƠN
Đe hoàn thành đề tài luận vãn thạc sĩ này, em xin được gửi những lời cảm ơn sâu
sắc nhất tới:
Cô Phan Thị Huyền, người Cô đáng kỉnh với những chỉ dẫn khoa học quỷ báu, đã
luôn theo sát và dìu dẳt em hoàn thành đề tài luận vãn thạc sĩ này.
Thầy Phan Thanh Sơn Nam, cô Nguyễn Thúy Hương và các thầy cô Phòng Đào
tạo Sau Đại học đã tạo điều kiện vật chất lẫn tinh thần tốt nhất để em hoàn thành luận vãn
của mình.
Em xin cảm ơn tất cả Thầy, Cô trong Khoa Kỹ thuật Hóa học - Công nghệ sinh học
đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong suốt hai nãm em ngoi trên ghế giảng
đường.
Cảm ơn chị Ngân, anh Minh, chị Hân, chị Vi cùng tất cả anh chị lớp Cao học Khóa
2016 đã luôn quan tâm, giúp đỡ và cho em thật nhiều niềm vui và những kỉ niệm đáng quỷ
trong suốt thời gian chúng ta học tập dưới mái trường Đại học Bách Khoa thành phổ Hồ
Chỉ Minh.
Cảm ơn An, Đãng, Kha và Nguyên Khoa đã luôn sát cánh bên mình trong bất cứ
hoàn cảnh nào. Thật may man khi cuộc đời này có các bạn bên cạnh mình.
Và trên hết, con cảm ơn Mẹ, anh Hai và gia đình luôn tạo điều kiện tốt nhất đế con
được học tập, luôn bên cạnh, động viên và cố vũ con. Mọi người mãi là niềm yêu thương
vô bờ bến của con.
Cầu chúc cho mọi điều tốt đẹp nhất luôn đến với mọi người. Hy vọng ở đoạn đường
sap tới, sẽ luôn có mọi người bên cạnh. Xin chân thành cảm ơn tất cả!

Trần Thị Hương Thảo

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đa số vi khuẩn có một nhiễm sắc thể (NST) là sợi đôi DNA hình vòng tròn khép kín, có

một điểm khởi đầu sao chép và một điểm kết thúc sao chép, tạo thành hai replichore có
chiều dài gần bằng nhau. NST vi khuẩn chứa các đoạn trình tự mang thông tin mã hóa
protein, rRNA, tRNA và các trình tự không mã hóa. Trong sợi đơn của các đoạn trình tự
này, thành phần các nucleotide không giống nhau, tức là các đoạn trình tự này không đối
xứng. Tuy nhiên, trong toàn bộ sợi đơn của NST hoàn chỉnh, số luợng adenine (A) và số
luợng thymine (T) là gần nhu nhau, đồng thời số luợng cytosine (C) và số luợng guanine
(G) cũng gần nhu nhau, tức là nhiễm sắc thể đối xứng. Không những thế, các oligomer
kích thuớc ngắn và các oligomer bổ sung đảo nguợc (BSĐN) tuơng ứng, ví dụ GAT và
ATC, cũng có số luợng gần nhu nhau. Các vi khuẩn khác nhau có các NST có kích thuớc
khác nhau và trình tự nucleotide khác nhau, tuy nhiên đều giống nhau ở đặc điểm đối xứng.
Đặc điểm này có liên quan mật thiết với tốc độ sao chép và sự phân bố của nucleoid trong
tế bào, do đó việc can thiệp làm mất đi tính đối xứng của NST làm ảnh huởng nghiêm
trọng đến các quá trình tổng hợp DNA và phân chia tế bào. Vĩ thế, vấn đề các nucleotide
phân bố nhu thế nào trong các NST khác nhau sao cho các NST đều trở nên đối xứng cần
đuợc quan tâm tim hiểu. Đe tài này khảo sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự
protein sense và antisense, tức các trình tự mang thông tin mã hóa protein, của các NST
khác nhau của vi khuẩn Burkholderia lata 383. Ket quả khảo sát cho thấy rằng mật độ
phân bố của một trimer bất kỳ, tức số lần xuất hiện trung bĩnh của trimer đó trong 1 kbp,
trong nhóm các trình tự sense (hoặc antisense) trên một replichore của NST gần bằng mật
độ phân bố của trimer BSĐN tuơng ứng trong nhóm các trình tự antisense (hoặc sense)
trên replichore còn lại. Mật độ phân bố của các trimer trong các nhóm trĩnh tự sense hoặc
antisense trên hai replichore của cả 3 NST của vi khuấn này là nhu nhau. Tần suất xuất
hiện của các khoảng cách giữa các trimer cùng loại liền kề trong các trĩnh tự sense (hoặc
antisense) trên một replichore thì tuơng đồng với tần suất xuất hiện của các khoảng cách
giữa các trimer BSĐN tuơng ứng trong các trình tự antisense (hoặc sense) trên replichore
còn lại. Mặc dù ba NST khác nhau về kích thuớc và trình tự, các kiểu phân bố của
trimer/trimer BSĐN này giống nhau ở cả ba NST.

IV

SUMMARY
Most bacteria have only one circular chromosome, which is a double-stranded DNA
molecule, possessing an origin and a terminus of replication, forming two replichores
which are nearly equal in length. The bacterial chromosome contains DNA segments
which carry information for encoding proteins, rRNA, tRNA and those that are nonencoding. In these local single-stranded chromosomal segments, the nucleotide
composition is skewed, i.e. these segments are asymmetric. Nevertheless, in the whole
single-stranded chromosome, the numbers of adenine (A) and thymine (T) are similar, as
are those of cytosines and guanines, i.e. the whole chromosome is symmetric. Also, short
oligomers and their respective reverse complements, such as GAT and ATC, have similar
frequencies. Different bacteria have their chromosomes of different sizes and different
nucleotide sequences, however, they all have the same symmetric property. This property
has a close relationship with the replication rate and the distribution of nucleoid in the cell,
thus interfering to cause this property lost from the chromosome seriously affects the
processes of DNA synthesis and cell division. Therefore, how the nucleotides
asymmetrically distribute in different bacterial chromosomes to make these whole
chromosomes symmetric needs to be uncovered. This research investigates the distribution
of trimers in the protein sense and antisense sequences, i.e. sequences that carry
information for encoding proteins, of the Burkholderia lata 383. The investigation results
show that densities of trimers, i.e. the average trimer frequencies per 1 kbp, in the sense
(or antisense) sequences on the one replichore and those of their respective reverse
complements in the antisense (or sense) sequences on the other replichore are almost equal.
The trimer densities in the sense or antisense sequences on the two replichores of all the
three different chromosomes of this bacterium are similar. On the distribution of the trimer
and their respective reverse complements in the sense and antisense sequences on the
replichores of each of the three B. lata chromosomes, we found that the frequencies of
distance between the adjacent trimers in the sense (or antisense) sequences on the one
replichore were almost similar to those between the adjacent respective reverse
complements in the antisense (or sense) sequences on the other replichore. Although the
three chromosomes were different in size and nucleotide sequence, these patterns of the

V


distribution of the trimer/trimer reverse complement were observed to be similar in all
these three chromosomes.

VI


LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Trần Thị Hương Thảo, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Khóa 2016
đợt 1, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, xin
cam đoan công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, số liệu là kết quả nghiên cứu
thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phan Thị Huyền.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp của
mình.
Tp. Hồ Chỉ Minh, ngày 13 tháng 07 năm 2018
Học viên thực hiện

Trần Thị Hương Thảo

vii


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ ............................................................................. ii
CÁN Bộ HƯỚNG DẪN ............................................................................................... ii
CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO ............................................................................. ii
TRƯỞNG KHOA ......................................................................................................... ii

LỜI CẢM ON .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................. iv
SUMMARY ................................................................................................................. V
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... X
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ xi
DANH MỤC HÌNH PHỤ ............................................................................................... xii
DANH MỤC BẢNG PHỤ ............................................................................................. xiii
CÁC TỪ VIẾT TẮT....................................................................................................... xiv
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 15
CHƯONG 1 ..... TÔNG QUAN LÝ THUYẾT ................................................................ 17
1.1

NHIỄM SẮC THÊ VI KHUẨN ........................................................................ 17

1.2

TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............................... 18

1.3

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..................................................................... 20

1.4

LUẬN DIÊM MỚI CỦA ĐỀ TÀI .................................................................... 20

1.5

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .............................................................................. 21

1.6

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THựC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ................................. 21

1.6.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................ 21
1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................. 22
CHƯONG 2 ..... VẬT LIỆU VÀ PHƯONG PHÁP NGHIÊN cứu ................................. 23
2.1

VẬT LIỆU ......................................................................................................... 23

2.2

PHƯONG PHÁP NGHIÊN cứu ........................................................................ 24

2.2.1. Xác định nucleotide skew ............................................................................... 24
2.2.2. Trích xuất các trình tự sense và antisense ....................................................... 24
2.2.3. Xác định số lần xuất hiện của trimer trong trình tự ........................................ 24
2.2.4. Xác định mật độ phân bố của trimer trong trình tự......................................... 24
2.2.5. Khảo sát sự phân bố của các trimer trên các replichore của NST .................. 25

viii


CHƯƠNG 3 ..... KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ BÀN LUẬN .........................................26
3.1. Số lượng các trimer trong các trình tự sense và antisense của NST .................26
3.2. Vị trí khởi đầu và kết thúc sao chép trong NST ................................................29
3.3.. .. Số lượng trimer trong các nhóm trình tự sense và antisense trên các replichore

7

.................... .............................. . ............................................................................ ! .........31

3.4. Mật độ phân bố trimer trong các nhóm trình tự sense và antisense trên các
replichore ................................................................................................................33
3.5. Sự phân bố của trimer và trimer BSĐN trong các trình tự sense và antisense
35
trên các replichore ..........................................
CHƯƠNG 4 ..... KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

42

4.1. KẾT LUẬN ..........................................

42

4.2. KIẾN NGHỊ .........................................

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................

42

PHỤ LỤC ...........................................................

45

IX

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Số lượng trimer trong tổng số các trình tự sense và antisense của NST ........ 25
Hình 3.2. Số lượng trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các trình tự
antisense của NST .......................................................................................................... 26
Hình 3.3. Các vị trí khởi đầu và kết thúc sao chép của NST ......................................... 28
Hình 3.4. Số lượng trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các antisense
trên mỗi replichore của NST .......................................................................................... 30
Hình 3.5. Mật độ phân bố của trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các
trình tự antisense trên mỗi replichore của NST .............................................................. 32
Hình 3.6. Sự phân bố của GCG và CGC trong các trình tự sense và antisense trên các
replichore ........................................................................................................................ 35

X


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Kích thước và hàm lượng GC của các NST .................................................. 21
Bảng 2.2. Số lượng và thành phần nucleotide của các NST .......................................... 21
Bảng 2.3. Số lượng và thành phần nucleotide của các trình tự sense and antisense
trong các NST ................................................................................................................. 21
Bảng 3.1. Các trimer và các trimer BSĐN tương ứng ................................................... 24
Bảng 3.2. 9 vị trí đầu tiên và các khoảng cách tương ứng giữa các GCG trong Rl_s
và giữa các CGC trong R2_AS của NST 1 ..................................................................... 33
Bảng 3.3. Khoảng cách giữa các GCG có (hoặc không có) trong Rl_s nhưng không
có (hoặc có) giữa các CGC trong R2_AS của NST 1 ..................................................... 36
Bảng 3.4. Hai mươi giá trị tần suất xuất hiện cao nhất của các khoảng cách D giữa các
GCG trong Rl_s và giữa các CGC trong R2_AS của NST1 ........................................ 37

XI

DANH MỤC HÌNH PHỤ
Hình phụ 1. Mật độ phân bố các trimer trong nhóm các trình tự sense và nhóm các
trình tự antisense trên các replichore của các NST vi khuẩn giàu hàm luợng AT ......... 34
Hình phụ 2. Mật độ phân bố các trimer trong nhóm các trình tự sense và nhóm các trình
tự antisense trên các replichore của các NST vi khuẩn có hàm luợng GC trung
bình ................................................................................................................................. 35
Hình phụ 3. Mật độ phân bố các trimer trong nhóm các trình tự sense và nhóm các trình
tự antisense trên các replichore của các NST vi khuẩn có hàm luợng GC cao ....36

xii


DANH MỤC BẢNG PHỤ
Bảng phụ 1. số lượng trimer trong tổng số các trình tự sense và antisense của NST 1
...................... ....... ... .................... .. ............................. ... .......................................... ..43
Bảng phụ 2. số lượng trimer trong tổng số các trình tự sense và antisense của NST 2
...................... ....... ... .................... .. ............................. ... .......................................... ..44
Bảng phụ 3. số lượng trimer trong tổng số các trình tự sense và antisense của NST 3
....................................................................................................................................... 45
Bảng phụ 4. số lượng trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các
antisense trên mỗi replichore của NST 1 ....................................................................... 46
Bảng phụ 5. số lượng trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các
antisense trên mỗi replichore của NST 2 ....................................................................... 47
Bảng phụ 6. số lượng trimer trong nhóm các trình tự sense và trong nhóm các
antisense trên mỗi replichore của NST 3 ....................................................................... 48
Bảng phụ 7. Mật độ phân bố của trimer trong nhóm các trĩnh tự sense và trong nhóm
các trình tự antisense trên mỗi replichore của NST 1.................................................... 49
Bảng phụ 8. Mật độ phân bố của trimer trong nhóm các trĩnh tự sense và trong nhóm

các trình tự antisense trên mỗi replichore của NST 2.................................................... 50
Bảng phụ 9. Mật độ phân bố của trimer trong nhóm các trĩnh tự sense và trong nhóm
các trình tự antisense trên mỗi replichore của NST 3.................................................... 51
Bảng phụ 10. Các NST của các vi khuẩn có các hàm lượng GC khác nhau ................ 52

xiii


CÁC TỪ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

A

Adenine

c

Cytosine

G

Guanine

T

Thymine

NST

Nhiễm sắc thể

BSĐN

Bổ sung đảo ngược

bp

Base pair

kbp

Kilo base pair

rRNA

ribosomal RNA

mRNA

RNA thông tin

tRNA

RNA vận chuyển

NCBI

National Center for Biotechnology Information


MỞ ĐẦU
Trong công nghệ gene, việc tạo ra được những chủng, loài vi sinh vật với bộ gene
cho những sản phẩm trao đổi chất mong muốn là thực sự cần thiết. Tuy nhiên, sự thành
công trong việc này lại phụ thuộc vào những hiểu biết của con người về các trình tự bộ
gene và những quá trình sinh học liên quan đến trật tự sắp xếp của các nucleotide trong
phân tử DNA nhiễm sắc thể. Các mối liên hệ giữa cấu trúc bộ gene và các quá trình sinh
học xảy ra trong tế bào có thể được xác định thông qua việc thay đổi hoặc xóa bỏ các trình
tự nucleotide trong bộ gene. Tuy nhiên, các kỹ thuật trong sinh học phân tử hiện nay chưa
đủ để việc thay đổi hoặc xóa bỏ các trình tự nucleotide trong bộ gene luôn được thành
công. Trong những năm gần đây, sự phát triển của tin học trong sinh học đã cung cấp
nguồn thông tin quí giá hỗ trợ cho các kỹ thuật trong sinh học phân tử, đặc biệt là việc tim
hiểu cấu trúc bộ gene và các quá trình sinh học xảy ra trong tế bào sinh vật. Các nghiên
cứu mới đây đã tiết lộ mối liên hệ giữa sự sắp xếp của các nucleotide trong bộ gene đến
các quá trình sinh học xảy ra trong tế bào. Mặc dù các sinh vật khác nhau có các bộ gene
với các trình tự nucleotide khác nhau nhưng các phân tử DNA nhiễm sắc thể của chúng
đều có chung một đặc điểm, đó là tính đối xứng. Tuy vậy, các nucleotide được sắp xếp
như thế nào để các phân tử DNA nhiễm sắc thể trở nên đối xứng thi chưa được biết đến.
Do đó, việc xác định được qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm
sắc thế sẽ là cơ sở đế định hướng cho việc tạo ra những vi sinh vật mong muốn.
Nghiên cứu gần đây trên NST vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 10987 cho thấy số
lần xuất hiện của các trimer và của các trimer BSĐN tương ứng trong toàn bộ các trĩnh tự
sense và antisense trong mỗi NST là tương đương nhau. Bên cạnh đó, các trimer trong các
trĩnh tự sense của một replichore và các trimer BSĐN tương ứng của chúng trong các trĩnh
tự antisense của replichore còn lại cũng được tìm thấy là phân bố với mật độ tương đương
nhau. Tuy nhiên, sự phân bố này có mang tính quy luật ở các vi khuẩn khác hay không
vẫn chưa được làm rõ. Te bào vi khuẩn Burkholderia lata 383

15


có ba NST hình vòng tròn khép kín, có trình tự và kích thước hoàn toàn khác nhau. Giống
như ở vi khuẩn B. cereus ATCC 10987, số lần xuất hiện của các trimer và của các trimer
BSĐN tương ứng trong toàn bộ các trình tự sense và antisense của mỗi NST cũng tương
đương nhau. Đe tài này khảo sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense và
antisense của các NST khác nhau của vi khuẩn B. ỉata 383 nhằm tìm hiểu xem liệu mật độ
phân bố của các trimer và các trimer BSĐN tương ứng ở các NST khác nhau của vi khuẩn
này có như nhau hay không, và có giống như ở vi khuẩn B. cereus ATCC hay không. Neu
sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense và antisense của các NST vi khuẩn mang
tính qui luật, việc tạo thành công các chủng vi khuẩn cho sản phẩm trao đổi chất mong
muốn là hoàn toàn có thể nhờ công đoạn thiết kế bộ gene in siỉico.

16


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1 NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN
Nhiễm sắc thể (NST) tế bào vi khuẩn đa số là một sợi đôi DNA có hình vòng tròn,
hình thành từ hai sợi đcm DNA khép kín. Mỗi sợi đon DNA là một polynucleotide đuợc
cấu tạo bởi các mắt xích nucleotide adenine (A), cytosine (C), thymine (T) và guanine (G).
Các nucleotide này đuợc nối với nhau thông qua các liên kết phosphodiester, trong đó một
nhóm phosphate đuợc nối với hai nhóm đuờng (deoxyribose) của hai nucleotide. Ở một
đầu của polynucleotide có nhóm phosphate gắn vào nguyên tử carbon số 5 và đầu kia có
nhóm hydroxyl gắn vào nguyên tử carbon số 3 của đuờng deoxyribose. Các đầu này lần
luợt đuợc gọi là đầu 5’ và đầu 3’. Hai sợi đơn polynucleotide của nhiễm sắc thể kết hợp

với nhau nhờ các liên kết hydrogen theo mô hình kết cặp nucleotide của Watson và Crick
[1], Mỗi sợi đơn hoàn chỉnh của nhiễm sắc thể chứa các trình tự mang thông tin mã hóa
cho protein, các RNA ribosome (rRNA), các RNA vận chuyển (tRNA) và các trình tự
không mã hóa.
Ở hầu hết các vi khuẩn, phân tử DNA nhiễm sắc thể chỉ có một điểm khởi đầu và
một điểm kết thúc sao chép DNA. Rất nhiều nghiên cứu truớc đây đã sử dụng nucleotide
skew để nhận biết vị trí điểm khởi đầu sao chép ở một số nhiễm sắc thể vi khuẩn, nhung
sự phân bố của các oligomer trong phân tử DNA nhiễm sắc thể thi không đuợc công bố
nhiều. Khi kích thuớc oligomer càng lớn, nghiên cứu sẽ càng trở nên phức tạp vĩ số luợng
oligomer tăng lên. Có lẽ vĩ thế mà chỉ có sụ phân bố của vài oligomer trong phân tử DNA
nhiễm sắc thế đã đuợc nghiên cứu mà thôi. Nhu đã biết, ở mỗi phía của điểm khởi đầu sao
chép, hai sợi DNA bổ sung tuơng ứng đuợc sử dụng làm khuôn đế sao chép mạch truớc
(leading strand) và mạch sau (lagging trand) bởi hai cấu trúc khác nhau của bộ máy sao
chép. Các nucleotide cũng nhu một số các oligomer đuợc tìm thấy là phân bố không cân
đối ở hai phía của điếm khởi đầu sao chép của các phân tử DNA nhiễm sắc thế.

17


1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Ở các NST vi khuẩn, các đoạn trình tự cục bộ (tức các đoạn mang thông tin mã hóa
cho protein, các rRNA, các tRNA và các trình tự không mã hóa) mang tính bất đối xứng
(asymmetric), tức là thành phần các nucleotide trong sợi đơn của các đoạn này không
giống nhau [2, 3, 4]. Tính bất đối xứng của các đoạn này có liên quan đến quá trình sao
chép và phiên mã DNA trong tế bào [5, 6]. Mặt khác, các nucleotide trong các đoạn nằm
rất xa nhau trong NST có mối liên hệ với nhau [7, 8, 9]. Tuy nhiên, trình tự hoàn chỉnh
của NST thi đối xứng (symmetric) [10, 11], tức là số luợng A gần bằng số luợng T, và số
luợng c gần bằng số luợng G; đồng thời, số luợng mỗi oligonucleotide (hay oligomer, tức
dimer, trimer, tetramer, ...) trong sợi đơn nhiễm sắc thể hoàn chỉnh tính theo chiều 5’ —>
3’ và trong sợi bổ sung cũng theo chiều 5’ —> 3 ’ cũng gần bằng nhau. Điều này cũng có

nghĩa là số luợng mỗi oligomer, ví dụ nhu ATC, trong một sợi đơn hoàn chỉnh của NST
theo chiều 5’ —> 3’ gần bằng với số luợng của oligomer bổ sung đảo nguợc (BSĐN)
tuơng ứng của nó, chẳng hạn GAT là trimer BSĐN của ATC, trong sợi đơn hoàn chỉnh
này theo chiều 5’ —> 3’. Tính đối xứng này đuợc cho là do đảo đoạn NST tạo ra [12, 13],
làm hĩnh thành nên kiểu phân bố mang tính phổ biến của các trimer trong các nhiễm sắc
thể [14]. Tuy nhiên, các trimer đuợc phân bố nhu thế nào để các NST trở đối xứng thi chua
đuợc biết đến. Trên thực tế, sự phân bố của các nucleotide trong nhiễm sắc thể có ý nghĩa
rất quan trọng đối với ngành công nghệ biến đổi DNA. Phá vỡ sự phân bố tự nhiên của
các nucleotide trong NST bằng cách đảo đoạn bên trong mỗi replichore có thế làm phá vỡ
sụ phân bố của nucleoid trong tế bào, làm chậm tốc độ phân chia tế bào [15, 16]. Tuy
nhiên, đảo đoạn xảy ra quanh vùng tiếp giáp của hai replichore của vi khuẩn với các điếm
cuối của đoạn DNA bị đảo có khoảng cách nhu nhau đối với điếm khởi đầu sao chép lại
là một hiện tuợng phố biến trong tụ nhiên [17, 18]. Nhu vậy, đảo đoạn [12] chỉ có thế là
cơ chế nhằm duy trì đặc tính đối xứng vốn có của các phân tử DNA NST chứ không phải
đế tạo ra đặc tính này. Trong khi đó, các nghiên cứu in vivo khác lại tiết lộ rằng sụ đối
xứng của DNA NST qua trục nối điểm khởi đầu và điểm kết thúc sao chép có liên quan
đến tốc độ sao chép và sụ ổn định của NST [19, 20, 21]. Thay

18


đổi vị trí điểm khởi đầu sao chép ở vi khuẩn bằng cách đảo đoạn vùng DNA chứa điểm
này làm giảm tốc độ sao chép DNA của tế bào [19, 20]. Chèn toàn bộ phân tử DNA NST
của một vi khuẩn vào một điểm trên NST của một vi khuẩn khác là điều không thể. Itaya
và cộng sự đã thất bại khi đua phân tử DNA NST vi khuẩn Synechocystis sp. PCC6803
vào NST vi khuẩn B. subtỉlỉs bằng cách chèn toàn bộ DNA NST của Synechocystis vào
một điểm trên phân tử DNA NST của Bacillus. Thí nghiệm chỉ thành công khi phân tử
DNA NST tạo thành đối xứng qua các điểm khởi đầu và kết thúc sao chép của phân tử
DNA NST vi khuẩn B. subtilis [21]. Mặt khác, việc tạo NST vi khuẩn nhân tạo chỉ thành
công khi vị trí tuơng đối của các đoạn nucleotide tổng hợp mã hóa cho các RNA thông tin

(mRNA) trong NST nhân tạo đuợc duy trĩ nhu trong NST vi khuẩn tự nhiên [22]. Tốc độ
sao chép và tính ổn định của NST vĩ thế là những yếu tố cần đuợc duy trĩ sau khi trình tự
DNA NST bị thay đổi.
Trên NST vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 10987, các trình tự protein sense và
antisense chiếm 83,3% [23]. Trình tự sense và antisense là các trình tự nucleotide mang
thông tin mã hóa cho các mRNA. Trình tự sense có các nucleotide nằm theo thứ tự y hệt
nhu trong trình tự mRNA, còn trình tự antisense là trình tự bổ sung của trình tự mRNA.
Số lần xuất hiện của các trimer và của các trimer BSĐN tuơng ứng trong toàn bộ các trình
tự sense và antisense trong mỗi NST là tuơng đuơng nhau [23]. Các trimer trong các trình
tự sense của một replichore và các trimer BSĐN tuơng ứng của chúng trong các trình tự
antisense của replichore còn lại cũng đuợc tim thấy là phân bố với mật độ tuơng đuơng
nhau, với mật độ phân bố của một trimer bất kỳ trong các trình tụ sense và antisense đuợc
định nghĩa là số lần xuất hiện trung bĩnh của trimer đó trên mỗi kilobase pair các trình tụ
này [23].
Liệu sụ phân bố của các trimer và các trimer BSĐN tuơng ứng ở vi khuẩn B. cereus
có mang tính qui luật, tức cũng đuợc tìm thấy ở các NST vi khuẩn khác? Te bào vi khuẩn
Burkholderia lata 383 có ba NST hình vòng tròn khép kín, có trình tụ và kích thuớc hoàn
toàn khác nhau. Giống nhu ở vi khuẩn B. cereus ATCC 10987 [23], số lần xuất hiện của
các trimer và của các trimer BSĐN tuơng ứng trong toàn bộ các trình tụ sense và antisense
của mỗi NST cũng tuơng đuơng nhau [24], Đe tài này khảo
19


sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense và antisense của các NST khác nhau
của vi khuẩn B. ỉata 383 nhằm tìm hiểu xem liệu mật độ phân bố của các trimer và các
trimer BSĐN tưcmg ứng ở các NST khác nhau của vi khuẩn này có nhu nhau hay không,
và có giống nhu ở vi khuẩn B. cereus ATCC [23] hay không.
1.3 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Theo nhu trình bày trong Mục 1.2 thi công việc biến đổi DNA cần đuợc định huớng
và thiết kế kỹ càng truớc khi đuợc thực hiện để đạt hiệu quả biến đổi cao. Cũng theo nhu

trình bày trong Mục 1.2, nếu tất cả các NST vi khuẩn đều có chung đặc tính đối xứng [10,
11] và sự phân bố của các nucleotide trong NST có mối quan hệ mật thiết với tốc độ sao
chép, sự phân bố nucleoid và tốc độ phân chia tế bào [15, 16, 19, 20] thi các trimer phân
bố nhu thế nào trong các trình tự sense và antisense để góp phần tạo nên tính đối xứng,
trong khi các trình tự NST hoàn toàn khác nhau, là một vấn đề đáng đuợc tim hiểu. Tim
ra đuợc qui luật phân bố của các nucleotide trong nhiễm sắc thể nhằm giúp việc thực hiện
thay đổi các trình tự DNA trong NST theo huớng điều tiết các quá trình sinh học của tế
bào theo ý muốn là điều có ý nghĩa thực tiễn quan trọng.
Đe tài này khảo sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự sense và antisense
của các NST vi khuẩn B. ỉata 383, nhằm tim hiểu xem liệu phân bố trimer trong các trình
tự sense và antisense của các NST khác nhau của vi khuẩn này có nhu đã tìm thấy ở NST
vi khuẩn B. cereus ATCC 10987 [23]. Nếu sụ phân bố của các trimer trong các trình tụ
sense và antisense của các NST vi khuẩn mang tính qui luật, việc tạo thành công các chủng
vi khuẩn cho sản phấm trao đối chất mong muốn là hoàn toàn có thế nhờ công đoạn thiết
kế bộ gene in silico.

1.4 LUẬN ĐIÉM MỚI CỦA ĐÈ TÀI
Sụ phân bố của các trimer trong các trình tụ sense và antisense chỉ mới đuợc nghiên
cứu khá kỹ trên NST vi khuẩn B. cereus ATCC 10987 [23]. Sụ phân bố của các trimer
trong các trình tụ sense và antisense của các NST B. lata chỉ mới đuợc nghiên

20


cứu ở bước đầu [24], cho thấy cũng như ở vi khuẩn B. cereus, số lần xuất hiện của các
trimer và các trimer BSĐN tưcmg ứng trong toàn bộ các trình tự sense và antisense của
mỗi NST là tương đương. Đe tài này khảo sát sự phân bố của các trimer trong các trình tự
sense và antisense của các replichore của từng NST của vi khuẩn B. lata 383.
Ket quả của luận văn này cho kết quả mang tính so sánh về cách phân bố của các
nucleotide trong ba NST khác nhau của cùng một vi khuẩn, và cũng để so sánh với sự

phân bố của các nucleotide trong NST vi khuẩn đã nghiên cứu [23]. Các kết quả này góp
phần cung cấp thông tin cần thiết trong việc chuẩn bị (in sỉlỉco) cho các nghiên cứu biến
đổi hoặc tạo mới DNA NST.

1.5

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Luận văn nhằm mục tiêu nghiên cứu sự phân bố của các trimer trong các trình tự

sense và antisense trên các replichore của ba NST khác nhau của vi khuẩn B. lata 383.

1.6

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THựC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.6.1. Ý nghĩa khoa học
Luận văn cung cấp thông tin về cách phân bố của các nucleotide trong NST vi khuẩn
trong mối quan hệ vói tầm quan trọng của sự phân bố này, bởi vì phá vỡ cách phân bố này
bằng cách thay đổi vị trí khởi đầu sao chép làm chậm tốc độ sao chép [19, 20], thay đổi sự
sắp xếp tự nhiên của các nucleotide trong NST vi khuẩn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sự phân bố của các nucleoid vào tế bào mới sau quá trình sao chép và làm chậm sự phân
chia của tế bào [15, 16], hay không thể thực hiện chèn một NST vi khuẩn vào một vị trí
trên một NST khác [21], hay việc tạo NST vi khuẩn nhân tạo cần các nucleotide tổng hợp
có trình tự phải giống như trĩnh tự nucleotide trong NST tự nhiên [22], Những đặc điểm
tương đồng trong cách phân bố các trimer trong ba NST khác nhau của cùng một vi khuẩn
góp phần làm sáng tỏ các qui luật phân bố tự nhiên chưa được biết đến của các nucleotide
trong các NST vi khuẩn.

21

1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sự hiểu biết về sự phân bố mang tính qui luật của các nucleotide trong các NST vi
khuẩn sẽ giúp chúng ta can thiệp có định hướng vào việc thay đổi có hiệu quả các trình tự
nucleotide trong NST bằng các kỹ thuật biến đổi DNA hoặc tạo ra được các NST vi khuẩn
nhân tạo theo ý muốn.

22


VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

CHƯƠNG 2
2.1

VẬT LIỆU
Đối tượng nghiên cứu là ba trình tự NST hoàn chỉnh của vi khuẩn B. lata 383,

được tải về dưới dạng các tập tin có đuôi .fna từ cơ sở dữ liệu NCBI
( />d58073). Kích thước và hàm lượng GC của các NST vi khuẩn B. lata 383 được trình bày
trong Bảng 2.1; số lượng và thành phần các nucleotide của chúng được trình bày trong
Bảng 2.2. số lượng và thành phần nucleotide của các trình tự sense and antisense trong
các NST được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.1. Kích thước và hàm lượng GC của các NST.
NST
NST1
NST 2
(RefSeq*)
(NC_007510.1)
(NC_007511.1)

Kích thước NST (bp)
3694126
3587082
Hàm lượng GC (%) ___________ 662 _____________ 66.7
^ RefSeq: số hiệu trình tự NST trên cơ sở dữ liệu NCBI.

NST 3
(NCL007509.1)
1395069
65.3

Bảng 2.2. Số lượng và thành phần nucleotide của các NST.
NST 1

NST 2

Nucleotide

Số lượng

Thành
phần(%)

A

624915
1219309
1226389
623513

16.92
33.01
33.2

c
G
T

Số
lượng
595420
1194580
1199074
598008

16.88

NST 3

Thành
phần(%)
16.6
33.3
33.43
16.67

Số lượng Thành phần
(%)
242199
455715

454914
242241

17.36
32.67
32.61
17.36

Bảng 2.3. Số lượng và thành phần nucleotide của các trình tự protein sense and
antisense trong các NST.
NST
1

Số lượng (bp)
3241389

Thành phần (%)
87.74

2
3

3143436
1195317

87.63
85.68

23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định nucleotide skew
Điểm khởi đầu và kết thúc sao chép trong mỗi NST được định vị bằng cách xác
định mức độ khác nhau về tần suất xuất hiện của G và c trong từng đoạn cục bộ dọc theo
trình tự DNA NST, bằng cách sử dụng phương pháp đã được xây dựng trước đây [25].
Sau khi điểm khởi đầu sao chép được xác định, replichore thứ nhất ( Rl) sẽ bắt đầu
từ điểm khởi đầu cho tới điểm kết thúc sao chép, và replichore thứ hai (R2) sẽ bắt đầu từ
điểm kết thúc cho tới điểm khởi đầu sao chép của NST.
2.2.2. Trích xuất các trình tự sense và antisense
Các trình tự protein sense và antisense được trích xuất từ các trình tự NST hoàn
chỉnh nhờ chương trình extractseq của gói EMBOSS [26], trên cơ sở các vị trí đã được
xác định của chúng dọc theo chiều dài NST trong các tập tin có đuôi .ptt trên cơ sở dữ liệu
NCBI nói trên.
2.2.3. Xác định số lần xuất hiện của trimer trong trình tự
Số lần xuất hiện của một trimer trong trình tự là số lần trimer đó xuất hiện dọc theo
trình tự mà không chồng lên nhau, theo hướng từ 5' đến 3', được xác định thông qua một
phần mềm đã sử dụng trong một nghiên cứu trước đây [27].
2.2.4. Xác định mật độ phân bố của trimer trong trình tự
Đe xác định mật độ phân bố của một trimer trong trình tự, số lần xuất hiện của trimer
đó trước hết được xác định như trên (Mục 2.2.3). Sau đó, các giá trị số lần xuất hiện của
64 trimer được chuyến vào bảng tính Excel. Mật độ phân bố của một trimer được tính theo
công thức sau:
Mật độ phân bố = X X 1000 / L
Trong đó X là số lần xuất hiện của mỗi trimer, và L (tính bằng bp) là tống chiều dài
của tất cả các trình tự được sử dụng để xác định số lần xuất hiện của trimer. Mật độ phân
bố trimer trong trình tự là một bộ gồm 64 giá trị cho 64 trimer.

24