NGHIÊN cứu VI KHUẨN điện hóa – hóa DƯỠNG vô cơ TRONG PIN NHIÊN LIỆU VI SINH vật được vận HÀNH với các NỒNG độ sắt KHÁC NHAU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN ĐIỆN HÓA – HÓA DƢỠNG VÔ CƠ
TRONG PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT ĐƢỢC VẬN HÀNH VỚI
CÁC NỒNG ĐỘ SẮT KHÁC NHAU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chƣơng trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN ĐIỆN HÓA – HÓA DƢỠNG VÔ CƠ
TRONG PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT ĐƢỢC VẬN HÀNH VỚI
CÁC NỒNG ĐỘ SẮT KHÁC NHAU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chƣơng trình đào tạo chuẩn)

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội – 2019

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp
đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân.
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Phạm Thế
Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ
bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của ThS. Nguyễn
Thu Thủy và CN. Vũ Hà Phƣơng cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí
nghiệm GREENLAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống và phòng thí
nghiệm Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học trong suốt thời gian làm khóa
luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh
vật học cũng nhƣ các thầy cô thuộc khoa Sinh học – trƣờng Đại học Khoa học tự
nhiên, ĐHQGHN đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên môn
và tạo điều kiện hết sức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại
trƣờng.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia
đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về mặt thể chất và tinh
thần để tôi có thể hoàn thành bản khóa luận này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp
đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Từ

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

MFC

Microbial fuel cell

Pin nhiên liệu vi sinh vật

BOD

Biochemical oxigen demand

Nhu cầu oxy sinh hóa

Denaturing gradient gel electrophoresis

Điện di gel biến tính

P

Power

Công suất

R

Resistance

Điện trở

DGGE


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT .............................................................
MỤC LỤC .....................................................................................................
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...........................................................................
MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................... 2
1.1.

Pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell - MFC) ................. 2

1.1.1. Lịch sử phát triển của MFC ..................................................... 2
1.1.2. Cấu tạo và nguyên lí hoạt động của MFC ............................... 3
1.1.3. Ứng dụng của MFC ................................................................. 4
1.1.4. Vi khuẩn điện hóa- hóa dƣỡng vô cơ trong khoang anode của
pin nhiên liệu vi sinh vật ...................................................................... 7
1.2.

Vi khuẩn oxy hóa sắt..................................................................... 8

1.2.1

Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sắt................................................ 8

1.2.2

Phân bố vi khuẩn oxy hóa sắt .................................................. 9

1.2.3

Phân loại vi khuẩn oxy hóa sắt ................................................ 9

1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng và và sự biến đổi
của quần xã vi sinh vật trong khoang anode của MFC...................... 11
1.3.

Các phƣơng pháp nghiên cứu vi khuẩn điện hóa oxi hóa sắt ..... 12

1.3.1. Phƣơng pháp truyền thống....................................................... 12
1.3.2.Phƣơng pháp điện di trên gel biến tính gradient (denaturing
gradient gel electrophoresis, DGGE) ................................................. 12
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP....................................... 14
2.1.

Vật liệu ........................................................................................ 14


2.1.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ................................................. 14
2.1.1.1. Hóa chất – vật liệu .......................................................... 14
2.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ ......................................................... 15
2.1.2. Nguồn làm giàu vi khuẩn oxy hóa sắt ................................... 15
2.2.

Phƣơng pháp ............................................................................... 16

2.2.2. Xây dựng và vận hành MFC.................................................. 16
2.2.2.1. Cấu trúc MFC đƣợc sử dụng .......................................... 16
2.2.2.2. Vận hành thiết bị............................................................. 17
2.2.3. Phƣơng pháp lấy mẫu từ MFC đã làm giàu........................... 20
2.2.4. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa sắt ở mẫu dịch anode
và điện cực anode ở hai nồng độ sắt 1mM và 20mM ........................ 21
2.2.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu dịch đơn chủng để bổ sung vào
MFC ............................................................................................... 22
2.2.6. Phƣơng pháp nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ..... 22
2.2.8. Phƣơng pháp PCR ................................................................. 23
2.2.9. Phƣơng pháp DGGE .............................................................. 25
2.2.10. Phƣơng pháp giải và phân tích trình tự gen 16s rARN ......... 26
2.2.11. Phƣơng pháp đo đạc và xử lý số liệu..................................... 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 28
`3.1. Sự tăng sinh dòng điện ở các MFC – bƣớc đầu làm giàu thành
công quần xã vi sinh vật oxi hóa sắt ...................................................... 28
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn sắt từ điện cực và dịch trong khoang
anode của các MFC................................................................................ 28
3.3. Kết quả phân tích trình tự các đơn chủng thu đƣợc bằng phƣơng
pháp nuôi cấy truyền thống .................................................................... 32


3.4. Kết quả phân tích hệ vi khuẩn trong khoang anode MFC bằng
phƣơng pháp PCR – DGGE ................................................................... 33
3.5. Thăm dò khả năng sinh điện của đơn chủng A1 ............................ 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 40
PHỤ LỤC................................................................................................... 44

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Cấu tạo phổ biến và nguyên lí của một pin nhiên liệu [5] ....................... 3
Hình 2: Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa cƣờng độ dòng điện với nồng độ Fe(II)
trong dịch anode của MFC cảm biến sắt [20] ........................................................ 7
Hình 3: Cây phát sinh của loài vi khuẩn oxi hóa[33] .......................................... 11
Hình 4:Mô hình MFC sử dụng làm cảm biến sắt................................................. 17
Hình 5: Mô hình vận hành MFC đƣợc sử dụng ................................................... 20
Hình 6: Đồ thị thể hiện sự phát sinh dòng điện của các MFC trong giai đoạn làm
giàu vi khuẩn điện hóa sử dụng Fe(II) là chất cho điện tử .................................. 28
Hình 7: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
trong các mẫu nghiên cứu .................................................................................... 30
Hình 8: Thống kê tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ điện cực của các
MFC vận hành với các nồng độ sắt khác nhau .................................................... 30
Hình 9: Thống kê tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ dịch anode của các
MFC vận hành với các nồng độ sắt khác nhau .................................................... 31
Hình 10: Kết quả khuếch đại gen 16S rRNA với mồi p63F & p1378R .............. 32
Hình 11: Kết quả khuếch đại 16S rDNA ............................................................. 34
Hình 12: Kết quả DGGE phân tích so sánh quần xã anode của các MFC vận
hành với nồng độ sắt khác nhau ........................................................................... 35
Hình 13: Đồ thị thể hiện sự phát sinh dòng điện khi bổ sung chủng A1 vào pin
nhiên liệu vi sinh vật ............................................................................................ 37


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1:Một số MFC hoạt động với các chất cho điện tử là các chất vô cơ [23]... 8
Bảng 2: Hỗn hợp vi lƣợng (Dung dịch Trace element) ....................................... 18
Bảng 3: Môi trƣờng M9 cải tiến cho khoang anode ............................................ 19
Bảng 4: Dung dịch đệm cho khoang cathode ...................................................... 19
Bảng 5: Môi trƣờng Winograsky ......................................................................... 21

Bảng 6: Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn 1400bp........... 24
Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn 550bp............. 25
Bảng 8: Thành phần dung dịch chất biến tính 0% và 60% .................................. 26
Bảng 9: Thành phần “Working solutions” ........................................................... 26
Bảng 10: Phân tích trình tự đoạn 16S rRNA từ các chủng phân lập đƣợc (sử
dụng dữ liệu giải trình tự DNA trên NCBI) ......................................................... 32


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam cũng nhƣ một số nƣớc trên thế giới, nguồn nƣớc sạch
đƣợc khai thác chủ yếu từ nguồn nƣớc ngầm. Tuy nhiên, nguồn nƣớc ngầm
đang bị ô nhiễm bởi các chất thải công nghiệp và nƣớc thải sinh hoạt không
qua xử lí hoặc xử lí không đạt yêu cầu đã xả thẳng ra ngoài môi trƣờng. Hiện
tƣợng này gặp phổ biến ở các khu vực đô thị và các khu công nghiệp. Vì vậy,
nguồn nƣớc ngầm dễ bị ô nhiễm các kim loại nặng nhƣ sắt, asen, mangan,
thủy ngân,… Những kim loại này theo chuỗi thức ăn thâm nhập vào cơ thể
con ngƣời để lại những hậu quả nghiêm trọng.
Xuất phát từ mục đích phát hiện tại chỗ sự có mặt của các kim loại này
trong nƣớc ngầm với chi phí không cao, pin nhiên liệu vi sinh vật(MFC) sử
dụng làm cảm biến phát hiện sắt đã đƣợc nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Vi
sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo
thành công và bƣớc đầu thể hiện tiềm năng ứng dụng. Để hƣớng tới có thể
triển khai ứng dụng thiết bị này trong thực tế, cần có thêm những nghiên cứu
cải tiến hiệu quả hoạt động của thiết bị, đặc biệt về vi sinh vật điện hóa trong
thiết bị và khả năng hoạt động của chúng trong các điều kiện nồng độ sắt khác
nhau.

Với mục đích trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu vi khuẩn
điện hóa – hóa dưỡng vô cơ trong pin nhiên liệu vi sinh vật được vận hành
với các nồng độ sắt khác nhau ”

1


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell - MFC)
1.1.1. Lịch sử phát triển của MFC
Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) đƣợc xem là một công nghệ tiềm
năng, hứa hẹn mang lại nhiều thành công trong lĩnh vực tái tạo năng lƣợng và
xử lí nƣớc thải. Năm 1911, những nghiên cứu đầu tiên về thiết bị này đƣợc
thực hiện bởi MC.Potter với ý tƣởng sản xuất điện từ vi khuẩn E.coli. Ông đã
phát hiện ra rằng, quá trình vi sinh vật phân hủy các hợp chất hữu cơ đã giải
phóng ra năng lƣợng điện. Hiệu điện thế tối đa đƣợc ghi lại (0,3V - 0,5V) và
chƣa có một nghiên cứu nào thu đƣợc một dòng điện nhƣ thế khi nghiên cứu
với vi sinh vật[30].
Năm 1931, Barnet Cohen đã thu hút nhiều sự chú ý hơn khi ông tạo ra
một số pin nhiên liệu bán vi sinh vật mà khi mắc nối tiếp với nhau có khả
năng sản sinh trên 35 vol mặc dù chỉ với dòng điện 2 miliamp [39].
Đến những năm 1980, xuất phát từ ý tƣởng mong muốn cung cấp
nguồn năng lƣợng giá rẻ và chất lƣợng cho các nƣớc đang phát triển MJ Allen
và H.Peter Bennetto đã thực hiện một cuộc cách mạng thiết kế pin nhiên liệu
vi sinh đầu tiên. Với những sự hiểu biết về chuỗi vận chuyển điện tử và tiến

bộ trong công nghệ Allen và Bennetoo đã tạo ra thiết kế cơ bản về MFC mà
vẫn đƣợc sử dụng cho tới ngày nay[4].
Làm thế nào để các electron từ chuỗi vận chuyển electron của vi sinh
vật đến đƣợc cực âm (anode)? Đây là một câu hỏi lớn đối với các nhà nghiên
cứu về MFC. Khi nghiên cứu những vấn đề này, vào những năm 1990 B-H.
Kim – một nhà nghiên cứu thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc đã
phát hiện ra rằng một số loài vi khuẩn hoạt động điện hóa không cần sử dụng
chất trung gian để vận chuyển điện tử đến các điện cực [30]. Nhƣ vậy, pin
nhiên liệu vi sinh vật mới đƣợc tạo ra không cần sử dụng đến các chất trung
gian tốn kém và có khi độc hại.
2


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

Cấu tạo MFC điển hình bao gồm hai khoang: khoang anode (cực âm)
và khoang cathode (cực dƣơng). Hai khoang này đƣợc ngăn cách với nhau bởi
một màng có khả năng trao đổi ion. Màng ngăn cách sẽ thực hiện nhiệm vụ
chỉ cho các ion đặc biệt đi qua (H+ hoặc OH-) đồng thời ngăn cách các phản
ứng sinh học và hóa học xảy ra trong anode – nơi vi khuẩn phát triển và
cathode – nơi các electron phản ứng với các chất nhận điện tử. Hai cực này sẽ
đƣợc nối với nhau thông qua một bộ góp điện bao gồm dây điện và điện trở
có giá trị nhất định để tạo thành một mạch điện khép kín. Electron đƣợc tạo
trong anode sẽ qua điện trở ngoài và sang cathode. Tại cathode, electron sẽ
đƣợc nhận bởi các chất nhận điện tử cuối cùng để hoàn thành quá trình tạo
điện sinh học. Các chất nhận điện tử cuối cùng thƣờng đƣợc dùng nhƣ oxi,
sulfate, nitrate… nhƣng hiệu quả và rẻ tiền nhất vẫn là oxi bởi vì thế oxy hóa
khử của cặp O2/H2O (+820mV) có giá trị cao nhất so với các cặp oxy hóa khử

khác đƣợc dùng để nhận điện tử trong MFC.
1.1.3. Ứng dụng của MFC
Trong những năm gần đây, hoạt động nghiên cứu và phát triển mạnh
mẽ của các nhà nghiên cứu khoa học đã đƣa MFC ngày càng trở nên hoàn
thiện hơn – mang lại nhiều tiềm năng và ứng dụng trong các lĩnh vực công
nghệ [7]. Với những đặc tính độc đáo của nó, công nghệ MFC có những ứng
dụng chính nhƣ: sản xuất điện năng, sản xuất hydro sinh học, xử lí nƣớc thải
và cảm biến sinh học … [8] Nhiều ứng dụng đã bắt đầu đƣợc thử nghiệm và
có thể đi vào sử dụng rộng rãi trong tƣơng lai không xa.
Xử lí nước thải và tái tạo năng lượng: MFC đƣợc đƣa vào để xử lí
nƣớc thải vào đầu năm 1991[9]. Nƣớc thải chứa vô số các hợp chất hữu cơ có
thể làm nhiên liệu đầu vào cho MFC. Các MFC sau khi làm giàu có thể loại
bỏ tới 80% các hợp chất hữu cơ trong nƣớc thải[10]. Nƣớc thải nhà máy bia
và các nhà máy sản xuất thực phẩm có lẽ là hợp lí nhất để xử lí bằng MFC vì
những loại nƣớc thải này rất giàu các hợp chất hữu cơ cho các vi sinh vật. Đặc
biệt nƣớc thải nhà máy bia rất lí tƣởng cho việc xử lí bằng MFC bởi các thành

4


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

phần nƣớc thải, lƣu lƣợng nƣớc thải luôn giống nhau, sự liên tục đó tạo điều
kiện cho vi khuẩn thích nghi và hoạt động hiệu quả hơn[4]. Quá trình xử lí
nƣớc thải bằng MFC là một phƣơng pháp tiên tiến có giá cả phải chăng, phù
hợp với các nƣớc đang phát triển và công nghiệp hóa[11].
Hơn nữa, vi sinh vật oxi hóa các chất hữu cơ trong chất thải có thể tạo
ra điện năng với một nguồn điện ổn định[7]. Sản xuất điện năng bằng MFC đã

mang lại nhiều ƣu điểm vƣợt trội so với các công nghệ sản xuất điện khác
nhƣ: hiệu suất chuyển hóa cao, năng lƣợng điện thu từ MFC ổn định và thân
thiện với môi trƣờng[7, 12, 13].
Sản xuất hydro sinh học: các MFC có thể đƣợc dùng để tạo ra khí
hydro để sử dụng nhƣ một nguồn nhiên liệu thay thế. Khi đƣợc sử dụng dùng
để sản xuất hydro, MFC cần đƣợc bổ sung nguồn năng lƣợng bên ngoài để
chuyển hóa tất cả các vật liệu hữu cơ thành carbon dioxide và khí hydro.
MFC tiêu chuẩn đƣợc thay đổi để sản xuất hydro bằng cách giữ cho cả hai
khoang anode, cathode đều kỵ khí và cấp cho MFC một nguồn điện 0,25 volt.
Các bóng khí hydro tạo ra ở cực âm đƣợc thu lại và sử dụng nhƣ một nguồn
nhiên liệu [14].
Phƣơng pháp sản xuất hydro này rất hiệu quả, vì hơn 90% các proton
và electron do vi khuẩn đƣợc chuyển thành khí hydro.Trong khi sản xuất
hydro thông thƣờng đòi hỏi năng lƣợng cao gấp 10 lần so với sản xuất bằng
MFC. Bên cạnh đó, sử dụng MFC rất thân thiện với môi trƣờng. Tuy nhiên,
việc tinh sạch khí hydro sinh ra vẫn còn là một vấn đề đáng quan tâm [14].
Cảm biến sinh học: Ngoài những ứng dụng nói trên, một ứng dụng
khác - ứng dụng tiềm năng của công nghệ MFC là sử dụng nó nhƣ một cảm
biển sinh học để phân tích chất ô nhiễm, giám sát và kiểm soát quá trình tại
chỗ [15, 16].
 Cảm biến sinh học đo chỉ số BOD (BODsensor): Đề xuất sử dụng MFC
nhƣ một thiết bị cảm biến sinh học đƣợc đƣa ra lần đầu tiên bởi Kim và cộng
sự [17]. Nhu cầu oxy sinh học( BOD) là lƣợng oxy hòa tan cần thiết để đáp
5


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

ứng nhu cầu trao đổi của các sinh vật hiếu khí trong nƣớc giàu chất hữu
cơ.Mối tƣơng quan tỉ lệ thuận giữa năng suất Coulombic của MFC và nồng
độ các chất ô nhiễm hữu cơ có thể đồng hóa trong nƣớc thải là đặc điểm của
MFC để khai thác sử dụng làm cảm biến BOD.Cảm biến BOD sử dụng MFC
có thể duy trì hoạt động trong hơn 5 năm mà không cần bảo trì thêm, thời gian
sử dụng lâu hơn nhiều so với các loại cảm biến BOD khác [18]. Tại Hàn
Quốc, MFC đã đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm để làm cảm biến sinh đánh giá
chỉ số BOD (BOD sensor) từ đó đánh giá chất lƣợng nƣớc thải [17].
 Cảm biến phát hiện sắt: Ở nhiều vùng nông thôn Việt Nam, vì không
có điều kiện sử dụng nƣớc sạch, ngƣời dân phải dựa vào các nguồn nƣớc
ngầm mà phần nhiều bị ô nhiễm bởi các kim loại nhƣ sắt, man-gan và a-sen.
Hiện tại, việc phát hiện các kim loại này trong các mẫu nƣớc cần thực hiện
trong phòng thí nghiệm và khá mất thời gian hoặc tốn kém. Vì vậy, dựa trên
những lợi thế của MFC một thiết bị cảm biến sinh học có thể dùng nhiều lần
và có thể phát hiện tại chỗ sự có mặt của các kim loại này trong nƣớc ngầm,
Phạm Thế Hải và cộng sự đã nghiên cứu và phát triển thành công MFC sử
dụng làm cảm biến phát hiện sự có mặt của sắt trong môi trƣờng nƣớc. Trong
nghiên cứu này, các MFC có thể tạo ra điện khi sử dụng Fe(II) nhƣ chất cho
điện tử và cƣờng độ dòng điện sinh ra tỉ lệ thuận với nồng độ Fe(II) trong môi
trƣờng đầu vào theo quan hệ tuyến tính.(Hình 2) [19].
Nguyên tắc của cảm biến phát hiện sắt: sắt có thể đƣợc phát hiện dựa
trên đặc tính đặc biệt của vi khuẩn oxi hóa sắt. Vi khuẩn oxi hóa sắt đa số
thuộc nhóm vi khuẩn hóa dƣỡng vô cơ, có khả năng thu năng lƣợng cho hoạt
động sống và trao đổi chất của chúng thông qua việc oxi hóa ion Fe(II) thành
Fe(III) [20]. Dựa trên nguyên tắc này, nhóm nghiên cứu Phạm Thế Hải và
cộng sự đã bƣớc đầu làm giàu thành công vi khuẩn sắt trong thiết bị pin nhiên
liệu vi sinh vật. Thiết bị bƣớc đầu đã thể hiện đặc điểm của một cảm biến sinh
học phát hiện nhanh Fe(II) có mặt trong mẫu dịch anode [1].

6

Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

Hình 2: Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa cƣờng độ dòng điện với nồng độ
Fe(II) trong dịch anode của MFC cảm biến sắt [1]
1.1.4. Vi khuẩn điện hóa- hóa dƣỡng vô cơ trong khoang anode của pin
nhiên liệu vi sinh vật
Nguyên tắc hoạt động của MFC dựa trên quá trình trao đổi chất của vi
sinh vật nên quần xã vi sinh vật trong khoang anode là một yếu tố quan trọng
ảnh hƣởng đến hoạt động của MFC. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, nhiều
vi sinh vật có khả năng truyền điện tử đến anode thông qua chuyển hóa chất
vô cơ và hữu cơ trong trầm tích biển, đất, nƣớc thải,…[21]. Vi khuẩn điện hóa
– hóa dƣỡng vô cơ sử dụng các hợp chất cô vơ làm chất cho điện tử để sinh
trƣởng. Nhóm này bao gồm các vi khuẩn oxi hóa sulfide, lƣu huỳnh, kim loại,
amoni và nitrit [22].

7


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

Bảng 1:Một số MFC hoạt động với các chất cho điện tử là các chất vô cơ
[23]
Dạng MFC
Loại bỏ sulfide

Chất cho điện tử

Các nghiên cứu

Sulfide kết hợp với MFC để loại bỏ sulfide [24]
acetate

Loại bỏ các hợp chất chứa Tetrathionate
lƣu huỳnh

Sản xuất điện sinh học ổn
định với tetrathionate[25]

Loại bỏ ammonia

Ammonium

Sản xuất điện từ ammonium
trong MFC[26]

Oxi hóa sắt

Ferrous iron Fe2+
Manganese
Mn2+

Sử dụng MFC oxi hóa sắt
(II) làm chất cảm biến sinh học
để phát hiện sắt và mangan

trong nƣớc[27]

Nhiều nghiên cứu đã sàng lọc và định danh những vi sinh vật trong
quần xã ở khoang anode MFC có khả năng tạo ra dòng điện dựa trên chuyển
hóa các chất vô cơ [28]. Trong trƣờng hợp MFC vận hành với chất điện tử là
Fe(II) bằng phƣơng pháp phân tích DNA và phân tích lai huỳnh quang tại chỗ
(FISH) Phạm Thế Hải và cộng sự đã chứng minh rằng quần xã vi khuẩn oxy
hóa sắt có liên quan đến quá trình vận hành MFC. Geobacter sp., Bacillus sp.,
Pseudomonas sp. là những loài chiếm ƣu thế trong quần xã vi sinh vật trong
khoang anode, là nhân tố chính trong hoạt động điện hóa của hệ thống [23].
Đối với chất nhận điện tử là nitrat bằng phƣơng pháp phân lập nhóm nghiên
cứu Đại học Ghent – Bỉ đã chỉ ra rằng sự tham gia của vi khuẩn trong anode
liên quan đến các vi sinh vật oxi hóa sulfide. Các loài Paracoccus đóng vai
trò quan trọng trong hệ thống điện hóa này [24].
1.2. Vi khuẩn oxy hóa sắt
1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sắt
8


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

Vi khuẩn oxy hóa sắt (iron bacteria) thuộc nhóm sinh vật nhân sơ đầu
tiên đƣợc quan sát và ghi lại bởi nhà vi sinh vật Ehrenberg và Winogradsky
vào thể kỉ XIX và vẫn đƣợc tiếp tục nghiên cứu cho đến nay.
Vi khuẩn oxi hóa sắt là nhóm vi khuẩn có khả năng oxi hóa ion sắt (II)
hoặc mangan có số oxi hóa thấp trong môi trƣờng nhƣ một phần thiết yếu
trong chức năng trao đổi chất của chúng [29].
Vi khuẩn oxi hóa sắt là nhân tố sinh học xúc tác cho quá trình oxi hóa

sắt(II) ( Fe2+,ferrous iron) thành sắt(III) (Fe3+, ferric iron) thông qua sản sinh
enzyme xúc tác cho phản ứng oxi hóa Fe2+ thành Fe3+ hoặc tƣơng tác tƣơng tự
với Mn có số oxi hóa thấp thành Mn số oxi hóa cao theo phản ứng.
Fe2+ + H+ + ¼ O2

Fe3+ + ½ H2O

Fe3+ sau đó phản ứng với nƣớc để hình thành nên một hidroxit sắt không hòa
tan theo phản ứng:
Fe3+ + 3H2O

Fe(OH)3 + 3H+

Do có sự hình thành các hidroxit sắt không tan trên bề mặt tế bào mà ta
thƣờng thấy các khối vi khuẩn oxi hóa sắt có màu nâu đỏ khá đặc trƣng của
Fe3+[2].
1.2.2 Phân bố vi khuẩn oxy hóa sắt
Vi khuẩn sắt có ở hầu hết mọi nơi trên Trái Đất. Nơi đâu có nƣớc, oxi
và sắt đều là nơi tiềm năng cho vi khuẩn oxi hóa sắt phát triển, mỗi loài vi
khuẩn oxi hóa sắt có môi trƣờng sống đặc trƣng riêng [2].
1.2.3 Phân loại vi khuẩn oxy hóa sắt
Sự đa dạng và phân bố của nhóm vi khuẩn oxi hóa sắt bị ảnh hƣởng
mạnh mẽ bởi pH và O2. Ở điều kiện có O2 và pH >7 quá trình oxi hóa Fe2+ tạo
thành các kết tủa không tan, nhƣng trong điều kiện thiếu O2 hoặc kị khí và pH
<4 thì quá trình oxi hóa sắt hòa tan đơn giản hơn. Dựa trên các đặc điểm sinh
lí cơ bản các vi khuẩn oxi hóa sắt có thể chia thành bốn nhóm:

9

Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

 Vi khuẩn hiếu khí oxi hóa sắt ƣa axit
Loại vi khuẩn này thƣờng có nhiều trong nƣớc thoát ra ở mỏ axit đƣợc tạo
ra từ các mỏ than, mỏ sắt và khu vực núi lửa,… Trong các môi trƣờng này,
lƣu huỳnh thƣờng có mặt cùng Fe2+.Vì vậy, nhiều vi khuẩn oxi hóa sắt hiếu
khí ƣa axit có khả năng oxi hóa cả S và Fe2+. Các loài có thể tự dƣỡng hoặc dị
dƣỡng và các chi phổ biến bao gồm Acidithiobacillus (Gammaprotebacteria),
Leptospirillum (Nitrospirae) và Ferroplasma (Euryachaeota) [31].
 Vi khuẩn hiếu khí oxi hóa sắt trung tính
Chi phổ biển là Proteobacteria [31]. Trong nhóm này không thể không kể
đến một số Pseudomonas sp. Năm 2009, Sudek và cộng sự đã báo cáo
Pseudomonas/Pseudoaltermonas cũng có thể xúc tác trong quá trình oxi hóa
sắt(II) trong điều kiện vi hiếu khí [32].
 Vi khuẩn oxi hóa sắt kị khí quang dƣỡng
Nhóm này gặp phổ biến ở một số loài vi khuẩn tía không lƣu huỳnh của
Alphaproteobacteria [20]. Nhóm này sử dụng Fe2+ để khử CO2 nên nhóm vi
khuẩn này đƣợc coi là nhóm góp phần hình thành các lớp trầm tích trong lòng
đất trƣớc kỉ Cambri khi các hành tinh vẫn chƣa có oxi [33].
 Vi khuẩn oxi hóa sắt kị khí hóa dƣỡng
Các vi khuẩn nhóm này có khả năng kết hợp với quá trình oxi hóa Fe2+
thành khử nitrat tạo thành khí NO2- hoặc N2 ( khử nitrat). Các loài vi khuẩn
đặc trƣng của nhóm này nhƣ Marinobacter aquaeolei và Thiobacillus
denitrificans [31].
Các nhóm vi khuẩn oxi hóa sắt có mối quan hệ với nhau, thể hiện qua cây
phát sinh loài (Hình 3)

10

Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

khuẩn chiếm ƣu thế trong quần xã vi sinh vật trong khoang anode là yếu tố
quyết định [35].
Việc nghiên cứu tính đa dạng và sự biến đổi của quần xã sinh vật trong
khoang anode sẽ giúp đƣa ra cái nhìn chính xác hơn về hiệu quả hoạt động
của hệ thống. Từ đó có những sự điều chỉnh hợp lí phù hợp với mục đích sử
dụng.
1.3.

Các phƣơng pháp nghiên cứu vi khuẩn điện hóa oxi hóa sắt

Để nghiên cứu thành phần quần xã vi sinh vật có rất nhiều phƣơng
pháp. Tuy nhiên có hai phƣơng pháp sau thƣờng sử dụng khi nghiên cứu quần
xã vi khuẩn oxi hóa sắt trong MFC: phƣơng pháp truyền thống dựa trên nuôi
cấy và phƣơng pháp điện di trên gel biến tính gradient [2].
1.3.1. Phƣơng pháp truyền thống
Việc sử dụng các phƣơng pháp truyền thống để nghiên cứu một quần
xã vi sinh vật bao gồm thu mẫu, nuôi cấy làm giàu, phân lập, đếm vi khuẩn
(bằng cách đếm trực tiếp qua kính hiển vi), đếm khuẩn lạc, đếm bằng phƣơng
pháp giá trị xác suất cực đại (phƣơng pháp MPN),…và phân tích các đặc
điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật.
Tuy nhiên, các phƣơng pháp truyền thống chỉ có thể xác định đƣợc sự
có mặt và số lƣợng của những vi sinh vật có thể nuôi cấy đƣợc, mà đa số vi
sinh vật trong tự nhiên hiện nay chƣa thể nuôi đƣợc trong phòng thí nghiệm
(Pace, 1996) – số lƣợng các vi sinh vật có thể nuôi cấy đƣợc có thể chỉ đạt 1%

tổng số vi sinh vật có trong tự nhiên [36]. Vì vậy, để nghiên cứu hệ vi sinh vật
chính xác và hiệu quả, ngoài các phƣơng pháp truyền thống cần phải sử dụng
các phƣơng pháp sinh học phân tử.
1.3.2.Phƣơng pháp điện di trên gel biến tính gradient (denaturing
gradient gel electrophoresis, DGGE)
Điện di gel gradient biến tính (DGGE) là một phƣơng pháp sử dụng
phổ biến trong sinh học phân tử và trở thành kỹ thuật chính trong nghiên cứu
12


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

đặc điểm và thành phần quần xã vi sinh vật trong môi trƣờng [37]. Đây là
phƣơng pháp kỹ thuật không quá phức tạp và cho kết quả phân tích khá hiệu
quả.
Kỹ thuật DGGE là một dạng kỹ thuật “ dấu vân tay” (fingerprinting)
phân tử cho phép phân biệt các trình tự DNA khác nhau dựa trên sự khác
nhau về tỉ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự, đƣợc Myuzer là ngƣời đầu tiên
sử dụng trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật [38]. Một hỗn hợp là sản
phẩm của phản ứng PCR bao gồm các đoạn DNA có chiều dài bằng nhau
đƣợc điện di trên một gel acryamide không đồng nhất về thành phần hóa học,
có chứa chất làm biến tính DNA (chất biến tính là một hỗn hợp ure và
formamit) với gradient nồng độ tăng dần từ thấp đến cao [38]. Khi điện di,
các phân tử DNA có tỉ lệ GC thấp hơn sẽ dừng lại trƣớc, phân tử DNA có tỉ lệ
GC cao sẽ tiếp tục di chuyển và dừng lại ở vị trí có nồng độ chất làm biến tính
cao hơn trên gel. DNA sợi đôi có thể di chuyển dễ dàng trên gel acrymide còn
các phân tử DNA biến tính sẽ di chuyển chậm và dừng lại trên gel nhờ có
GC-clamp (kẹp GC). Do đó, các đoạn DNA có trình tự khác nhau có thể đƣợc

tách ra ở các vị trí khác nhau trên gel acryamide [3]. Vì vậy, vị trí khác nhau
trên điện di DGGE phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn DNA
đƣợc phân tích. Trong từng trƣờng hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trƣng cho
một trình tự DNA và phản ánh sự có mặt của một loài hay cá thể trong quần
xã đƣợc phân tích. DGGE tỏ ra hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh
trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn [40]. Đặc điểm của đoạn gen này giúp nó
thƣờng đƣợc lựa chọn trong DGGE là: có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn, có
tính bảo thủ cao, không có sự trao đổi giữa các loài và mang tính đặc trƣng
cho loài.

13


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện tại phòng GREENLAB – Trung tâm
Nghiên cứu Khoa học Sự sống và phòng thí nghiệm của Bộ môn Vi sinh vật
học – Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các hóa chất,
máy móc và thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, sinh
học phân tử đạt tiêu chuẩn.
2.1.1.1. Hóa chất – vật liệu
 Hóa chất sử dụng làm giàu, nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:
FeCl2.4H2O, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl4, NaHCO3,
FeSO4.7H2O, ZnCl2, MnCl2.4H2O, H3BO3, CaCl2.6H2O, CuCl2.2H2O,

NiCl2.6H2O, Na2MO4, CoCl2.6H2O, NaNO3, NH4NO3, FeC6H5O7NH4OH,
thạch agar. Các hóa chất trên đều đƣợc mua từ các hãng đảm bảo tin cậy nhƣ
Affymetrix (Hoa Kỳ) hoặc Xilong (Trung Quốc).
 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử:
Bộ hóa chất sử dụng tách DNA (Glycogen 20mg/l, Ethanol 100%, Amonium
acetate); phản ứng PCR (USB Tag PCR Master Mix 2x); điện di kiểm tra sản
phẩm PCR ( HydraGreen Safe AND Stain 20 000x, Loading Dye 6x, Gene
Ruler 1kb AND Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product
Cleanup). Tất cả đƣợc cung cấp bới Affymetrix USB, Merck và Fermentas
(Mỹ).
 Hóa chất sử dụng cho phƣơng pháp điện di gel biến tính DGGE:
Acryamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl
ethylenediamine), APS (Amonium Persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ)
cung cấp

14


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

 Vật liệu:
- Điện trở: 10Ω (Trung Quốc)
- Vật liệu điện cực: vải than chì (Nhật Bản), bột than chì (Trung Quốc), que
than chì (Trung Quốc)
2.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ
 Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong quá trình vận hành MFC
- Đồng hồ vạn năng Extech (Hoa Kỳ)
- Máy đo điện tự động KEITHLEY 2700 (Hoa Kỳ)

- Máy tính và phần mềm Excel phục vụ cho ghi chép, lƣu trữ và xử lý số liệu
từ máy đo tự động.
- Sục khí SL-2800 (Trung Quốc)
Ngoài ra một số thiết bị cần thiết đƣợc sử dụng trong quá trình vận hành của
pin nhiên liệu vi sinh vật nhƣ bình nito, bình duran nút cao su, hệ thống dây
dẫn silicon,…
 Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật và sinh
học phân tử.
- Máy PCR 5417R (Eppendorf , Đức)
- Máy ly tâm 5471R (Eppendord, Đức)
- Máy điện di ngang (Biorad, Mỹ)
- Máy DGGE K2401 (C.B.S Scientific, Mỹ)
- Bàn soi gel LMW – 20 UVP (UK)
- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)
- Máy lắc vortex (IKA 3, Đức)
2.1.2. Nguồn làm giàu vi khuẩn oxy hóa sắt
Nguồn vi khuẩn dùng để làm giàu vi khuẩn oxy hóa sắt đƣợc lấy từ:
 Mẫu bùn và nƣớc sông thu thập tại Làng rèn Vân Chàng – huyện Nam
Trực – tỉnh Nam Định
15


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

 Mẫu bùn Sóc Sơn – Hà Nội
 Mẫu đất thu thập tại xã Đông Yên - Quốc Oai – Hà Nội
2.2. Phƣơng pháp
2.2.2. Xây dựng và vận hành MFC

2.2.2.1. Cấu trúc MFC đƣợc sử dụng
MFC đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đã đƣợc chế tạo trƣớc đây theo
mô hình của Trung tâm Quốc gia Anh về Giáo dục Công nghệ sinh học
(National Centre for Biotechnology Education) - gọi tắt là mô hình NCBE R.
M. Allen and H. P. Bennetto (1993) [41] nhƣng đã đƣợc cải biến cho phù hợp
với mục đích sử dụng làm cảm biến sinh học [1].
Cụ thể, mỗi thiết bị MFC bao gồm 2 tấm perpex lớn kích thƣớc 12cm x
12cm x 2cm. Khoang anode và cathode đƣợc tạo từ 2 khung nhỏ với kích
thƣớc 8cm x 8cm x 2cm, ở giữa rỗng dạng hình vuông có kích thƣớc 5cm x
5cm.Điện cực đƣợc cấu tạo từ vải than chì (5cm x 5cm x 0,5cm) đƣợc kết nối
với que than chì bằng hỗn hợp keo epoxy và bột than chì theo tỉ lệ 1:1.Điện
cực đƣợc gắn xuyên qua tấm perpex lớn và thông ra bên ngoài. Tấm đệm cao
su đƣợc lắp vào giữa các khung để đảm bảo độ kín của các khoang anode và
cathode. Màng trao đổi proton đƣợc sử dụng là màng Nafion N117 (DuPont,
Hoa Kỳ) kích thƣớc 6cm x 6cm. Thiết bị đƣợc lắp ráp và cố định nhờ ốc và
bu – lông xuyên qua 4 góc mỗi tấm lớn. Các đầu điện cực que than chì đƣợc
nối với kẹp ngoàm cá sấu và dây dẫn điện bằng đồng ( đƣờng kính 1mm) và
nối với một điện trở mạch ngoài (10Ω).
Trên tấm perpex lớn có các lỗ nhỏ gắn với các ống silicon để tạo đƣờng
ra và vào cho dịch trong khoang anode và cathode. Ống dẫn dịch vào anode
đƣợc nối qua ống nhỏ giọt với bình chứa môi trƣờng M9 cải tiến.

16


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

qua ống chữ T trên rồi đƣợc bơm vào khoang anode của thiêt bị. Thể tích bơm

đƣợc tính sao cho mỗi lần, ½ dịch trong khoang anode đƣợc thay mới
(khoảng 20ml). Cuối cùng, HCO3- là nguồn cac – bon cho vi khuẩn sắt đƣợc
cung cấp dƣới dạng NaHCO3 vào khoang anode, theo cách tƣơng tự nhƣ cách
Fe2+ nồng độ cuối cùng trong dịch anode là 2g/L. Cách cung cấp các thành
phần dịch anode nhƣ trên đảm bảo tránh sự tạo thành các muối carbonate kết
quả trong dịch anode [27].
Bảng 2: Hỗn hợp vi lƣợng (Dung dịch Trace element)
STT

Thành phần

Hàm lƣợng

1

Nƣớc cất

1L

2

FeSO4.7H2O

1g

3

ZnCl2

0,07 g

4

MnCl2.4H2O

0,1 g

5

H3BO3

0,006 g

6

CaCl2.6H2O

0,13 g

7

CuCl2.2H2O

0,002 g

8

NiCl2. 6H2O

0,024 g

9

Na2Mo4.2H2O

0,036 g

10

CoCl2.6H2O

0,238 g

18


Nguyễn Thái Anh – K60 Sinh học

2019

Bảng 3: Môi trƣờng M9 cải tiến cho khoang anode
STT

Thành phần

Hàm lƣợng

1

Nƣớc cất

1L

2

KH2PO4

0,44 g

3

K2HPO4

0,34 g

4

NaCl

0,5 g

5

MgSO4.7H2O

0,2 g

6

CaCl2

0,0146 g

7

Trace elements

1 mL

Khử trùng ở 121oC/ 15 phút.
Ở cathode, dung dịch đệm photphat đƣợc sử dụng với cơ chế vận hành
liên tục( Hình 5). Dung dịch đệm sẽ đƣợc sục khí bằng máy sục khí SL-2800
(Silver Lake, Trung Quốc) sau đó dung dịch này đƣợc dẫn vào cathode bằng
ống nhỏ giọt. Dung dịch cathode sẽ đƣợc tuần hoàn liên tục bằng việc sử dụng
dây truyền dịch. Một mẻ vận hành đƣợc tính từ lúc bắt đầu cấp dịch vào
anode cho đến khi dòng điện sinh ra giảm về giá trị ban đầu.
Bảng 4: Dung dịch đệm cho khoang cathode
STT

Thành phần

Hàm lƣợng

1

Nƣớc cất

1L

2

KH2PO4

4,4 g

3

K2HPO4

3,4 g

4

NaCl

0,5 g

19