Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn

Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn
nuôi dạng rắn


Phạm Bích Hiên


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận án Tiến sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 62 42 40 01
Người hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Văn Toản, GS.TS. Nguyễn Đình Quyến
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Chương 1. Trình bày tổng quan về chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý;
vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ. Chương 2. Vật liệu và phương
pháp: các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật, hóa chất; phương pháp: phân loại vi
sinh vật; xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật; xác định hiện trạng chất thải
chăn nuôi; thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Chương 3. Kết quả và
thảo luận: thực trạng chất thải tại một số cơ sở chăn nuôi; nghiên cứu vi sinh vật để
xử lý chất thải chăn nuôi; nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh vật để xử lý chất thải
chăn nuôi ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi hiệu quả sử dụng
phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng.

Keywords. Sinh học; Vi sinh vật học; Xử lý chất thải; Phế thải chăn nuôi

Content

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN
Việt Nam là nước nông nghiệp, trong thời kỳ đổi mới ngành chăn nuôi có những bước

phát triển nhanh chóng, mô hình trang trại chăn nuôi tập trung được nhân rộng trong toàn
quốc. Mỗi năm cả nước có khoảng 60 triệu tấn chất thải vật nuôi, trong đó chỉ có khoảng
50% được xử lý, số còn lại được sử dụng trực tiếp bón cho cây trồng hoặc làm thức ăn cho
cá. Do chỉ tập trung đầu tư để nâng cao năng suất và chất lượng vật nuôi, phần nhiều các
trang trại chưa chú trọng đến công tác kiểm soát, quản lý chất thải nên làm phát sinh dịch
bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng trực tiếp đến việc phát triển bền
vững của ngành chăn nuôi. Tại nhiều địa phương người dân còn coi chất thải chăn nuôi là
phân bón, không quan tâm đến việc xử lý hoặc nếu có cũng chỉ ủ đống để chờ bón cho cây
trồng theo mùa vụ. Đây là một trong các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường và lây truyền
các dịch bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
- Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật (VSV) thuộc nhóm an toàn, sinh trưởng mạnh, cạnh
tranh được với VSV trong chất thải, chuyển hóa nhanh các hợp chất hữu cơ và ức chế hiệu
quả các vi khuẩn (VK) gây bệnh, gây thối, làm giảm ô nhiễm môi trường từ chất thải chăn
nuôi.
- Tạo được chế phẩm VSV để xử lý chất thải chăn nuôi thành phân hữu cơ đáp ứng yêu cầu
dinh dưỡng cây trồng, thay thế một phần phân vô cơ, góp phần phát triển nông nghiệp an
toàn, bền vững.
3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, từ hiện trạng chất
thải dạng rắn ở trang trại chăn nuôi tập trung đến sản xuất và ứng dụng thành công chế phẩm
VSV xử lý có hiệu quả chất thải chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trường và rút ngắn thời gian
chuyển hóa các chất hữu cơ từ 3- 4 tháng xuống còn 21- 30 ngày, đánh giá đựơc hiệu quả của
phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng.
- Là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách tổng hợp và chứng minh được hiệu quả sử dụng
vi khuẩn lactic sinh các chất kháng khuẩn (axit lactic và bacterioxin) để xử lý mùi hôi thối và
ức chế vi khuẩn gây bệnh trong chất thải chăn nuôi.
- Xây dựng được qui trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn
nuôi dạng rắn làm phân bón hữu cơ thay thế phân chuồng và tiết kiệm được 25% lượng phân

khoáng góp phần phát triển sản xuất nông nghiệp an toàn, bền vững.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN
- Cung cấp 4 chủng vi sinh vật an toàn, có hoạt tính sinh học cao trong sản xuất chế phẩm vi
sinh xử lý chất thải chăn nuôi, tạo phân hữu cơ góp phần giảm lượng phân hoá học và nâng
cao hiệu quả sản xuất của nông dân.
- Đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi qui mô trang trại góp
phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi.
BỐ CỤC LUẬN ÁN:
Luận án bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); vật liệu và
phương pháp (17 trang); kết quả và thảo luận (71 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang); danh
mục công trình liên quan đến luận án; danh mục 122 tài liệu tham khảo và các phụ lục. Luận
án có 45 bảng, 42 hình.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý
1.1.1. Chất thải chăn nuôi và nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng
 Chất thải chăn nuôi: Là chất thải ra trong quá trình chăn nuôi, gồm ba dạng chủ yếu:
Chất thải rắn (bao gồm chủ yếu là phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa và đôi khi là xác gia
súc, gia cầm chết hàng ngày); chất thải lỏng (bao gồm nước rửa chuồng, nước tắm cho vật
nuôi, nước tiểu, một phần phân); chất thải bán lỏng (gồm cả chất thải rắn và chất thải lỏng).
 Nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng:
- Ô nhiễm do kim loại nặng: Các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng, vật nuôi không tiêu hoá
hết bài tiết ra ngoài theo đường phân làm thoái hoá đất, ức chế hoạt động của VSV, ô nhiễm
nước ngầm, tích tụ trong nội tạng người và vật nuôi là nguyên nhân gây các loại bệnh tật.
- Ô nhiễm do khí độc: Trong phân, nước thải của lợn có khoảng 40 loại khí độc khác nhau
sinh ra từ quá trình thối rữa thức ăn thừa và xác động thực vật do hoạt động sống của vi
khuẩn yếm khí. Các khí thải H
2
S, NH
3,
CH

4
, CO
2,
N
2
O

gây mùi hôi thối khó chịu, kích thích
trung khu hô hấp của người và vật nuôi, có thể gây ngộ độc hoặc tử vong.
- Ô nhiễm do vi sinh vật và ký sinh trùng gây bệnh: Theo tài liệu của FAO có khoảng 90 loại
bệnh liên quan giữa người và gia súc mà phần lớn do các vi sinh vật và ký sinh trùng (KST)
lan truyền từ chất bài tiết của vật nuôi bị bệnh vào không khí, nguồn nước, đất, nông phẩm,
trong đó phổ biến và nguy hiểm nhất là nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
1.1.2. Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi ở Việt Nam
Mỗi ngày đàn gia súc, gia cầm của Việt Nam thải ra khoảng 539.733.15 tấn chất thải rắn,
khoảng 25-30 triệu khối chất thải lỏng, ước tính mỗi năm có trên 60 triệu tấn phân vật nuôi
các loại. Trong số đó chỉ có khoảng 50% được xử lý bằng phương pháp ủ trước khi sử dụng.
1.1.3. Các biện pháp xử lý chất thải chăn nuôi
- Phƣơng pháp vật lý: Bao gồm phương pháp lắng cặn; sử dụng máy tách chất rắn; lọc.
- Phƣơng pháp hoá học: Bơm và trộn các chất điện ly đơn giản hoặc các chất điện ly
polyme cùng với hỗn hợp chất thải trước khi tách cơ học làm tăng 82% hiệu quả tách chất
rắn.
- Phƣơng pháp sinh học:
+ Sử dụng thảm thực vật, hồ thuỷ sinh
+ Sử dụng vi sinh vật: Là biện pháp chính trong phương pháp sinh học. Dựa trên cơ sở tối ưu
hoá các điều kiện môi trường cho hệ vi sinh vật tự nhiên hoặc vi sinh vật khởi động phát triển
để phân giải các hợp chất hữu cơ trong phân trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí tạo sản phẩm
cuối cùng ổn định, có giá trị kinh tế, giảm hàm lượng chất rắn tổng số, giảm mùi, tiêu diệt vi
sinh vật gây bệnh. Biện pháp chủ yếu xử lý chất thải lỏng là biogas, xử lý chất thải rắn là
composting.

1.2. Vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ
Hệ vi sinh vật trong chất thải chăn nuôi gồm nhiều nhóm VSV có hoạt tính sinh học khác
nhau giữ vai trò hết sức quan trọng trong chu trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành các
chất mùn mà cây trồng có thể sử dụng được. Ở đây chúng tôi chỉ đề cập các nhóm VSV có
khả năng phân huỷ các hợp chất phổ biến, là thành phần chính trong chất thải chăn nuôi gồm
xenluloza, tinh bột, protein và VSV có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi
khuẩn gây thối.
1.2.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza
Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong tự nhiên khu hệ VSV
có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza phân giải xenluloza vô cùng phong phú, bao gồm
vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm. Xenlulaza là một phức hệ 3 enzym (Endo-1,4-glucanaza, Exo-
1,4-gluconaza, -1,4-glucozidaza) hoạt động cùng nhau để thuỷ phân xenluloza tạo ra các
loại đường có thể đi qua thành tế bào VSV.
1.2.2. Vi sinh vật phân giải tinh bột
Amylaza là hệ enzym rất phổ biến đối với VSV. Cơ chất xúc tác của amylaza là tinh bột
và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại:
-amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza. -amylaza gặp ở hầu hết các
loại VSV như nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn.
1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein
VK có khả năng sinh ra cả hai loại proteaza (endopeptidaza và exopeptidaza), do đó
proteaza của VK có tính đặc hiệu cơ chất cao. Các VK có khả năng tổng hợp proteaza mạnh
nhất. Nhiều loại nấm mốc cũng có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza còn xạ khuẩn ít
được nghiên cứu hơn.
1.2.4. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axit lactic và bacterioxin
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit lactic làm tăng sự phân hủy các hợp chất hữu
cơ, là chất tiệt trùng được ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, trong y, dược
và xử lý môi trường. Gần đây vi khuẩn lactic còn được đặc biệt quan tâm nghiên cứu về khả
năng sinh bacterioxin là các chất diệt khuẩn thế hệ mới có phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc
hiệu tế bào đích cao, an toàn với người, vật nuôi, cây trồng và môi trường là giải pháp cho
vấn đề kiểm soát các nguồn bệnh

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
- Mẫu thu thập: 50 mẫu nghiên cứu gồm phân ủ, thức ăn chăn nuôi, các phụ phẩm nông
nghiệp và chất thải sinh hoạt, chất thải chăn nuôi, phụ phẩm chế biến thực phẩm và sản phẩm
lên men truyền thống được thu thập trên địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac.
- Vi sinh vật gồm: VK lactic: Lactobacillus agilis JCM 1230,L. salivarius JCM 5804, L.
plantarum JCM 1048 và JCM1149, Leuconostos mesenteroides, L. fermentum, Streptocccus
spp do Phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp. Chủng VK gây thối nhũn
khoai tây Erwinia carotovora KT03 do Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp.
Chủng VK gây bệnh cho người và vật nuôi: E. coli PA2, E. coli NC, S. typhimurium, Shigella
flexneri, Enterococcus faecalis, S. aureus ATCC 29213 do Phòng VK hiếm gặp- Viện Vệ
sinh dịch tễ TW và Viện CNSH cung cấp.
- Các hoá chất, thiết bị máy móc: Được sản xuất tại các nước Mỹ, Nhật Bản, Thụy Điển và
Đức.
2.2. Phƣơng pháp
- Các phương pháp nghiên cứu VSV học thông thường: Phương pháp nuôi cấy, lên men, xác
định đăc điểm sinh hóa…
- Phân loại: Theo truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa) và bằng kỹ thuật sinh
học phân tử (lập cây phả hệ dựa trên kết quả giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự
ADNr 16S của các chủng VK theo phương pháp của Sakiyama và cs năm 2009).
- Các phương pháp xác định hoạt tính: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, điện di tricin
SDS-PAGE, phương pháp Thener, Anson cải tiến, Micro-bertrand …
- Phân tích lý hoá và thí nghiệm đồng ruộng theo TCN, TCVN, xử lý số liệu theo thống kê
sinh học.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THỰC TRẠNG CHẤT THẢI TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ CHĂN NUÔI
Số liệu khảo sát trung bình về sử dụng chất thải chăn nuôi dạng rắn tại 6 cơ sở chăn nuôi
tập trung ở thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An, Đắklắc cho thấy: Phần lớn (52%) chất thải chăn
nuôi được bán cho các cơ sở thu mua, có 21% lượng chất thải được dùng để bón cho cây,
17% dùng làm thức ăn cho cá và 10% được thải ra hệ thống nước thải công cộng. Kết quả xác

định nồng độ trung bình một số khí thải và vi sinh vật gây bệnh tại các điểm điều tra đều vượt
ngưỡng cho phép (bảng 3.1.).
Bảng 3.1. Môi trƣờng không khí tại các trang trại chăn nuôi
Nơi đánh giá
Chỉ tiêu đánh giá (số liệu trung bình 3 nơi đánh giá)
Độ nhiễm khuẩn
không khí (CFU/m
3
)
Nồng độ H
2
S
(mg/m
3
)
Nồng độ NH
3
(mg/m
3
)
1. Khu tập kết chất thải nuôi
lợn
5,8 ± 0,45 x 10
6

0,36 ± 0,05
(4,5
a
)
3,12 ± 0,06

(15,6
b
)
2. Khu tập kết chất thải nuôi
gà
7,2 ± 0,38 x 10
6

0,32 ± 0,04 (4
a
)
2,94 ± 0,08
(14,7
b
)
Giới hạn tối đa
10
6

0,08 *
0,2 **
(*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: số lần tăng so với giới hạn cho
phép
Nồng độ H
2
S tại các trang trại chăn nuôi gà và lợn cao gấp 4- 4,5 lần so với giới hạn.
Nồng độ NH
3
ở trang trại nuôi lợn và gà cũng đều cao hơn mức giới hạn 15 lần. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn kết quả điều tra trong báo cáo của Cục Chăn nuôi, trong

đó nồng độ H
2
S trong chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi
lợn gấp 64,4 lần; Nồng độ NH
3
trong chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn và
trong chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần. Sở dĩ có sự sai khác là do khác nhau về thời điểm
nghiên cứu, mô hình chăn nuôi và địa điểm lấy mẫu trong chuồng nuôi và ngoài khu vực tập
kết chất thải.
Bảng 3.2. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi
Chất thải chăn nuôi
Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/g)
Trứng
giun/g
VKTS *
E. coli
Salmonella sp
1. Chất thải nuôi lợn
6,58±0,6 x 10
6

2,20±0,5x 10
5

1,2±0,2x 10
3

105± 4,8
2. Chất thải nuôi gà
7,10 ±0,4x 10

7
8,06±0,3x 10
5

2,4±0,1x 10
3

120± 3,5
Mức cho phép

10
4

(-)
**

(*): VK tổng số ); (-)
**
: Không được có trong 25 g mẫu
Theo qui định thì chất thải chăn nuôi sử dụng cho nông nghiệp không chứa Salmonella
trong 25 g mẫu tuy nhiên kết quả phân tích đều cho thấy các mẫu chất thải chăn nuôi lợn và
gà đều chứa Salmonella sp với nồng độ 10
3
CFU/g và E. coli cao hơn 20- 80 lần giới hạn cho
phép. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cục Chăn nuôi và Viện Chăn
nuôi.
3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI
3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
Từ 28 mẫu phân ủ; thức ăn và chất thải chăn nuôi; phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm
nông nghiệp, bã nấm đã phân lập được 17 chủng VSV có khả năng phân giải xenluloza, 12

chủng phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein. Trong đó, sàng lọc được 15 chủng
sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa hoạt tính chúng tôi tuyển chọn được
chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thước VPG
đạt 34mm); chủng VK B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thước VPG đạt
38mm); chủng VK B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thước VPG đạt 30
mm). Từ 22 mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội đã phân lập được 7 chủng VK lactic, lựa
chọn chủng LH19 sinh bacterioxin và ức chế chủng VK gây thối Erwinia carotovora KT03.
Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế chéo trên môi trường thạch cho thấy 4 chủng LH19,
XK112, B20 và B15 không ức chế nhau, 4 chủng VSV trên được tuyển chọn cho nghiên cứu
tiếp theo.
Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của 4 chủng vi sinh vật tuyển chọn
Kí hiệu
chủng
Kích thước vòng phân giải (D-d) mm
Hàm lượng
axit lactic
(mg/ml)
Kháng E.
carotovora KT03
(D-d, mm)
Xenluloza
Tinh bột
Protein
XK112
34
20
-
-
-
B20

26
38
-
-
-
B15
-
21
30
-
-
LH19



27,9
22




Hình 3.2. Hoạt tính
phân giải xenluloza
của chủng XK112
Hình 3.3. Hoạt tính
phân giải tinh bột
của chủng B20
Hình 3.4. Hoạt tính
phân giải protein của
chủng B15

Hình 3.5. Hoạt tính
kháng E. carotovora
KT03 của chủng
LH15
3.2.2. Định tên và xác định độ an toàn sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2.2.1. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống
Chủng XK112: Sau 48- 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Gauze ở 35- 37
0
C, khuẩn
lạc chủng XK112 có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đường kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám,
chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch. Chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15
đến 35 bào tử.



Hình 3.6. Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử
của chủng XK112
Hình 3.10. Hình thái khuẩn
lạc của chủng XK112
Chủng B20: Chủng VK B20 thuộc Gram (+), kỵ khí không bắt buộc. Nuôi cấy trên
môi trường King B ở nhiệt độ 30
0
C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, mép có thùy, có
đường kính 0,5-1 mm. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thước 5,2 x 0,8 m. Bào tử
hình ovan



Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng B20
Hình 3.11. Hình thái

khuẩn lạc của chủng
XK112
Chủng B15: Chủng VK B15 thuộc Gram (+), hiếu khí. Trên môi trường KingB ở 30
0
C,
sau 48 giờ, khuẩn lạc khô, lan trên bề mặt thạch, màu vàng nhạt, lồi ở tâm, mép xẻ thùy, có
đường kính 0,7-1 mm. Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thước 444 nm x 2,02 m. Tạo
bào tử hình bầu dục.



Hình 3.8. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng B15
Hình 3.12. Hình thái
khuẩn lạc của chủng
B15
Chủng LH19: Trên môi trường thạch đĩa MRS ở 32-35
0
C, sau 48 giờ, khuẩn lạc nhỏ,
tròn lồi màu trắng sữa, bề mặt mịn, mùi chua thơm, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường thạch MRS có bổ sung 0,5% CaCO
3
. Chủng LH19 không di động,
không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tế bào hình que,
đứng riêng rẽ, kích thước 514 nm  2,44 m.



Hình 3.9. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng LH19
Hình 3.13. Hình thái
khuẩn lạc của chủng

LH19
Cả 4 chủng đều có khả năng đồng hóa đa dạng với các nguồn hydratcacbon, trong đó có
chủng vừa có khả năng phân giải CMC hoặc tinh bột vừa có khả năng thuỷ phân gelatin,
cazein. Đặc tính này thuận lợi cho việc lựa chọn môi trường nhân sinh khối sản xuất đồng
thời phù hợp với mục đích sử dụng VSV để xử lý chất thải chăn nuôi giàu các hợp chất
hydratcacbon và protein.
Căn cứ vào tất cả các kết quả về đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hoá của 4 chủng
VSV, dựa vào khoá phân loại của Bergey, có thể sơ bộ khẳng định chủng XK112 thuộc chi
Streptomyces, có đặc điểm tương tự như loài S. griceosporeus; chủng B20 thuộc chi Bacillus,
có đặc điểm tương tự như loài B. licheniformis; chủng B15 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm
tương tự như loài B. subtilis; chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus, có đặc điểm tương tự như
loài L. plantarum.
3.2.2.2. Định tên vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Kết quả giải trình tự gien cho thấy: Chủng XK112 có trình tự gien ARNr 16S tương đồng
tới 99,7% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng XK S. griseosporeus có ký hiệu
AB184419. Chủng B20 có trình tự gen ARNr 16S tương đồng 99,9 % (1429/1430 bp) với
trình tự gien của chủng B. licheniformis_X68416. Trình tự gien ARNr 16S của chủng B15
tương đồng 99,9% (1449/1451 bp) với đoạn 16S của Bacillus subtilis. Chủng LH19 có trình
tự ARNr 16S tương đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum, nằm cùng
vị trí với Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum.
 Căn cứ vào kết quả định danh theo phương pháp truyền thống và bằng kỹ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định chủng XK112 là Streptomyces griseosporeus, chủng
B20 là Bacillus licheniformis, chủng B15 là Bacillus subtilis, chủng LH19 là
Lactobacillus plantarum.
 Cả 4 chủng VSV nghiên cứu đều thuộc nhóm 1, đảm bảo độ an toàn sinh học đối với
người, vật nuôi, cây trồng và môi trường, được phép sử dụng trong sản xuất nông
nghiệp.
3.2.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phân giải chất hữu cơ của các
VSV
3.2.3.1. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng XK112

* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng XK112 được nuôi cấy trong môi trường Gauze, sau 72 giờ ở các điều kiện nhiệt
độ từ 25 đến 65
0
C, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất xenluloza
trên thạch đĩa.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của
XK112
Nhiệt độ nuôi
(
0
C)
Mật độ tế bào
(x 10
6
CFU/ml)
Kích thước VPG (D-d, mm)
Hoạt tính
tương đối (%)
CMC
Bột giấy
25
0,53
10
+/-
29,5
30
180
18
11

52,8
35
5400
31
15
91,2
40
6200
34
16
100
45
5600
32
16
94,1
50
3600
31
15
92,2
55
440
31
14
92,0
60
22
19
11

56,0
65
0,26
+/-
+/-
26,0
Chú thích: (+/-) Vòng phân giải mờ, kích thước VPG<10 mm
Chủng XK112 có khả năng thích nghi ở dải nhiệt độ tương đối rộng (25- 60
0
C), nhiệt độ
thích hợp là 35- 55
0
C, trong đó sinh trưởng và hoạt tính xenlulaza cao nhất ở nhiệt độ 40
0
C.
Khoảng nhiệt độ này hoàn toàn phù hợp với sự biến động nhiệt độ trong quá trình ủ, đặc biệt
là từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 15, khi nhiệt độ đống ủ tăng cao phù hợp cho VSV ưa nhiệt
phát triển và phân giải xenluloza
* Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy chủng XK112 ở 37
0
C trong môi trường Gauze với các pH khác nhau từ 4,0 đến
9,0. Sau 72h nuôi cấy, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất
xenluloza.
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của chủng
XK112
pH
ban đầu
pH cuối
Mật độ tế bào

(x 10
6
CFU/ ml)
Kích thước VPG (D-d, mm)
Hoạt tính
tương đối (%)
CMC
Bột giấy
4
5,0
0,18
20
11
58,0
5
5,4
6,4
22
12
64,3
6
6,8
320

26
14
76,5
7
7,3
5600

34
16
100
8
7,6
2800
29
15
85,3
9
8,2
3,4
24
14
70,0
pH thích hợp cho chủng XK112 sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza là pH6- 8, trong
đó pH7 là tối thích. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả
Trần Đình Toại, tăng Thị chính cho rằng pH ban đầu thích hợp nhất cho sinh trưởng và tổng
hợp xenlulaza của xạ khuẩn là pH 7- 7,5. Chất thải chăn nuôi thường có pH ban đầu trong
khoảng 5- 8 và đạt mức trung tính sau khi xử lý cơ chất, do đó chủng XK112 phù hợp cho
sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi.
Chủng XK112 có khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzym xenlulaza trong phạm vi nhiệt
độ 25- 60
0
C, pH 4,0- 9,0. Nhiệt độ thích hợp là 35- 55
0
C, pH 6,0- 8,0, điều kiện này là phù
hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn.
3.2.3.2. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải tinh bột của chủng B20
* Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chủng B20 được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể ở các

nhiệt độ khác nhau 30, 37, 40, 50, 55
0
C. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza
trên môi trường thạch đĩa chứa tinh bột tan, nhuộm màu với thuốc thử Lugon.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng
B20
Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp amylaza trong dải nhiệt độ 30-55
0
C nhưng thích
hợp ở 30- 50
0
C, sinh khối và hoạt tính đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37
0
C. Khoảng nhiệt độ
này là phù hợp với giai đoạn 15 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi đó quá
trình phân giải tinh bột trong khối ủ sẽ diễn ra mạnh nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của Ashger và cs, Nadia riaz và cs cho rằng nhiệt độ tối ưu cho khả năng tổng hợp
amylaza của Bacillus subtilis là 40
0
C. Ngô Xuân Mạnh và cs đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu nuôi
cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 42
0
C, cao hơn nhiệt độ tối
ưu của chủng B20.
* Ảnh hưởng của pH
Chủng B20 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường dịch thể với các pH khác nhau
gồm: 4,0, 5,0 , 6, 6,5, 7,0, 7,5 và 9,0. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza
của dịch nuôi.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20
Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp enzym phân giải tinh bột thích hợp ở pH 6,0- 8,0.
Khoảng pH này hoàn toàn thích hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Kết quả này khá
phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả khác (Đỗ Bích Thuỷ và cs xác định pH thích hợp
cho chủng B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-7,5 với pH tối ưu là 7; Ashger và cs chọn pH
nuôi cấy tối ưu để chủng B. subtilis JS2004 tổng hợp amylaza là pH7; Nadia riaz và cs kết
luận pH thích hợp để B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5. Ngô Xuân
Mạnh và cs lựa chọn được khoảng pH thích hợp nuôi cấy chủng B. licheniformis BCRP để
thu nhận enzym -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5).
* Ảnh hưởng của ion kim loại
Nuôi cấy chủng B20 trong môi trường và điều kiện thích hợp, ly tâm thu dịch enzym, bổ
sung CaCl
2
với các nồng độ 2và 4 mM, xử lý nhiệt ở 85
o
C trong 15 và 30 phút. Xác định ảnh
hưởng của Ca
2+
trong môi trường tới hoạt tính amylaza của chủng B20.
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của ion Ca
2+
đến độ bền nhiệt của amylaza do chủng B20 tổng
hợp
Nồng độ Ca
2+

(mM)
Thời gian xử lý
(phút)
Hoạt tính tương đối (%)

0
15
21,2
30
4,5
2
15
92,2
30
29,5
4
15
40,3
Nồng độ Ca
2+

(mM)
Thời gian xử lý
(phút)
Hoạt tính tương đối (%)
30
20,5
Nồng độ Ca
2+
thích hợp là 2 mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. Kết quả thử
nghiệm này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố cho rằng Ca
2+
làm
ổn định hoá cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao (Nguyễn Thị Hoài Hà;
Kwak và Akiba).

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym amylaza của chủng B20 hoạt động trong
dải nhiệt độ 30-55
0
C; pH 4,0-8,0, điều kiện thích hợp là 37- 50
0
C, pH 6,0- 8,0. Sự có mặt của
ion Ca
2+
làm tăng hoạt tính và độ bền nhiệt của amylaza.
3.2.3.3. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải protein của chủng B15
* Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện nhiệt
độ khác nhau trong khoảng từ 25 đến 55
0
C. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ
enzym proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.20

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng
B15
Chủng B15 có khoảng nhiệt độ thích hợp tương đối rộng (30-50
0
C), nhiệt độ 35-45
0
C
là thích hợp nhất (OD>0,2 và PA>0,8HP/ml). Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của B15 là ở
35
0
C (OD 2,8) còn PA đạt mức cao nhất ở 40
0
C (1,02 HP mg/l). Nhiệt độ này hoàn toàn phù

hợp với giai đoạn 2-10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Sản phẩm của quá
trình phân giải protein tạo các axit amin là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho các VSV trong
quá trình chuyển hoá tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác
(Kim J. M và cs xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza
là 40
0
C. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính
proteaza cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 35
0
C).
* Ảnh hưởng của pH
Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện pH
khác nhau trong khoảng từ 5 đến 9. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ enzym
proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.21


Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng B15
Hình 3.21 cho thấy: Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,6), pH tối ưu cho tổng
hợp proteaza là 7,5 (đạt 0,98 HP/ml). Khoảng pH thích hợp cho chủng B15 sinh trưởng và
tổng hợp enzym proteaza là 6,0-8,0 hoàn toàn phù hợp với quá trình xử lý chất thải chăn
nuôi. Trong một số nghiên cứu khác, tác giả Kim J. M và cs xác định pH nuôi cấy thích hợp
cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là từ 5 đến 6, pH tối ưu là 7. Nghiên cứu của Đỗ
Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi nuôi ở pH 8.
* Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại được sử dụng là: Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
, Cu

2+
,
Fe
2+
, Zn
2+
, với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10
-3
M.
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính proteaza của chủng B15
Ion

Mật độ quang (OD)
Hoạt độ tương đối
(%)
Lần 1
Lần 2
Giá trị
TB
Ca
2+

0,622
0,675
0,649
95,018
Ba
2+

0,683

0,702
0,693
101,47
Mg
2+

0,682
0,704
0,693
101,54
Cu
2+

0,334
0,311
0,323
47,253
Fe
2+

0,629
0,647
0,638
93,48
Zn
2+

0,294
0,382
0,338

49,524
ĐC
0,664
0,701
0,683
100,00
Số liệu bảng 3.13 cho thấy proteaza của chủng B15 khá ổn định với sự có mặt của ion
Ca
2+
; bị giảm hoạt tính mạnh bởi Cu
2+
,

Zn
2+
; ngược lại ion Ba
2+
, Mg
2+
lại làm tăng hoạt độ
enzym.
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym proteaza của chủng B20 hoạt động trong
khoảng nhiệt độ 30-55
0
C, pH 6,0- 9,0. Điều kiện thích hợp của enzym là 35- 50
0
C, pH 6,0-
8,0. Hoạt tính enzym tăng hoặc tương đối ổn định với sự có mặt của các ion Ca
2+
,

Ba
2+
và
Mg
2+

3.2.4. Hoạt tính đối kháng của chủng LH19
3.2.4.1. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh, gây thối rữa
* Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Các chủng VK được nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trường dịch thể ở điều kiện
thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp VK lactic với từng chủng VK kiểm định. Xác định khả năng
tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định.
Bảng 3.14. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng
LH19
Chủng kiểm định
Mật độ ban đầu
(CFU/ml)
Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời
gian (CFU/ml)
6h
24h
48h
72h
E. coli
4,8 x 10
6

6,3 x 10
4

1,8 x 10
4

1,4 x 10
4

-
Salmonella
3,5 x 10
6

2,7 x 10
4

1,5 x 10
4

1,0 x 10
4

-
Shigella
3,8 x 10
6

7,0 x 10
3

-

-
-
S. aureus
3,6 x 10
6

6,2 x 10
3

-
-
-
(-): Không xác định được ở nồng độ pha loãng 10
-1

Kết quả cho thấy chủng LH19 đối kháng được cả 4 chủng VK gây bệnh thử nghiệm, thời
gian ức chế nhanh (sau 6h tiếp xúc, nồng độ tế bào các VK gây bệnh đều giảm mạnh,
Shigella, Staphylococcus giảm từ 10
6
xuống 10
3
CFU/ml;

E. coli và Salmonella

giảm từ 10
6

xuống 10
4

CFU/ml). Khả năng kháng khuẩn nhanh, mạnh nhất với Shigella, Staphylococcus
aureus (ở 24h tiếp xúc), kháng E. coli và Salmonella ở 72h tiếp xúc trực tiếp.
* Đối kháng vi khuẩn gây thối rữa
Chủng VK lactic LH19 và VK gây thối E. carotovora KT03 được nuôi cấy riêng rẽ
sau 48h trong môi trường dịch thể đặc hiệu và điều kiện sinh trưởng phù hợp với mỗi chủng.
Cho tiếp xúc dịch thể ở nồng độ 10
6
và 10
8
CFU/ml. Xác định mật độ tế bào của mỗi chủng
trong hỗn hợp.
Bảng 3.15. Khả năng đối kháng E. carotovora KT03 của chủng LH19
Nồng độ
tiếp xúc
Chủng vi khuẩn
Mật độ
ban đầu
(CFU/ml)
Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng
LH19 theo thời gian (CFU/ml)
24h
48h
72h
10
8

E.carotovora KT03
1,6 x 10
8

3,6 x 10
4

-
-
LH19
1,4 x 10
8

2,2 x 10
8

4,6 x 10
8

3,08 x 10
8

10
6

E.carotovora KT03
3,2 x 10
6

1,06 x 10
4

-
-

LH19
3,0 x 10
6

6,8 x 10
6

1,52 x 10
7

1,4 x 10
7

(-): Không tìm thấy khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10
-1
Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng LH19 đối kháng mạnh với VK gây thối rữa thực vật,
sau 24h tiếp xúc mật độ tế bào chủng E. carotovora KT03 đã giảm mạnh từ 10
8
hoặc 10
6
xuống 10
4
, sau 48h không xác định được VK E. carotovora KT03 trong hỗn hợp.
Kết quả tại các bảng 3.14 và 3.15 cho thấy chủng LH19 có hoạt tính kháng khuẩn nhanh
(sau 6-48 giờ) nên giai đoạn đầu khi nhiệt độ tăng ở mức phù hợp cho VK ưa ấm phát triển,
chủng LH19 sẽ sinh trưởng mạnh và tiêu diệt được nhóm VK gây thối rữa, VK gây bệnh
đường ruột vì vậy bổ sung vào chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi sẽ có hiệu quả làm giảm
mùi hôi thối và sự lan truyền nguồn bệnh.
3.2.4.2. Khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của VK lactic LH19
Ngoài axit lactic là tác nhân diệt khuẩn, liệu chủng LH19 có khả năng tổng hợp

protein kháng khuẩn hay không? Để tìm hiểu rõ yếu tố kháng khuẩn của chủng LH19, nghiên
cứu tiến hành các thử nghiệm xác định khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng LH19
 Xác định phổ kháng khuẩn
Mục tiêu của thí nghiệm là tìm phổ kháng khuẩn của chủng LH19 trong điều kiện sinh
trưởng và của dịch ly tâm đã được trung hòa pH để làm giảm tác động kháng khuẩn của axit
lactic, từ đó xác định được yếu tố kháng khuẩn của LH19. Căn cứ vào các công trình nghiên
cứu đã được công bố về bacterioxin của VK lactic, chúng tôi lựa chọn bộ chủng giống VK
kiểm định có cùng họ hàng hoặc cạnh tranh về dinh dưỡng, môi trường cư trú. Kết quả đánh
giá nhanh, định tính phổ kháng khuẩn của LH19 bằng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm
điểm cho thấy chủng LH19 có phổ ức chế tương đối rộng với các chủng kiểm định thuộc cả
VK Gram (+) và VK Gram (-). Tuy nhiên khi điều chỉnh dịch nuôi cấy về pH trung tính để
loại bỏ tác động của axit lactic thì phổ ức chế bị thu hẹp lại, trong khi khả năng ức chế một số
VK gram (-) giảm xuống rõ rệt, vòng ức chế mờ, hầu hết nhỏ hơn 10 mm thì dịch nuôi cấy đã
trung hòa vẫn ức chế mạnh nhóm gram (+) trong đó có các chủng gây bệnh như E. faecalis và
S. aureus và khá nhiều loài VK lactic nhưng lại không ức chế các chủng L. plantarum là VK
sinh ra bacterioxin đó. Kết quả thử nghiệm này rất có ý nghĩa, phù hợp với các kết quả
nghiên cứu trước đây cho phép đưa ra khả năng chủng L. plantarum LH19 sinh tổng hợp
bacterioxin kháng khuẩn.
 Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Để khẳng định bản chất của bacterioxin của VK lactic có phải là protein hay không,
chúng tôi nuôi cấy VK LH19 trong môi trường MRS dịch thể, sau 14 giờ đem ly tâm thu dịch
nổi. Điều chỉnh về pH6,5; xử lý dịch ly tâm với các enzym proteaza (nồng độ 0.2 mg ml
-1
)
theo tỉ lệ 1:1. Mẫu đối chứng dương (dịch nuôi cấy VK với đệm phốtphát theo tỷ lệ 1:1). Các
mẫu thí nghiệm được ủ ở 37
o
C trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng tác động nhiệt ở 100
o
C/15

phút. Sau đó, tiến hành thử hoạt tính của mẫu theo phương pháp khuếch tán bacterioxin trên
thạch.
Sự nhạy cảm với enzym thể hiện qua việc mẫu bị mất hoạt tính. Nếu các giếng mẫu không
xuất hiện hoặc vòng vô khuẩn giảm nhiều so với mẫu đối chứng, có nghĩa đã xảy ra phản ứng
thuỷ phân protein, là nguyên nhân làm mẫu bị mất hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả tại bảng
3.17 và hình 3.25
Bảng 3.17. Phản ứng của dịch chứa chất kháng khuẩn với các enzim phân giải
protein
Phản ứng với enzim (0,2 mg/ml)
Trypsin
(1)
Pepsin (2)
α-chymotrypsin
(3)
Pronaza (4)
Proteinaza K (5)
Đối chứng
(6)
+
-
+/-
+/-
-
-
Chú thích: (+): Mất hoạt tính; (-): Không mất hoạt tính; (+/-): Giảm hoạt tính
Chủng LH19 tổng hợp nhạy cảm với các enzim thuỷ phân protein. Độ nhạy cảm cao nhất
đối với trypsin, yếu hơn với α-chymotrypsin và không có phản ứng với pepsin và proteinaza
K. Kết quả này chứng minh bản chất protein của mẫu bacterioxin của LH19.
 Điện di đồ xác định kích thước bacterioxin. Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn
Do bacterioxin của L. plantarum thuộc phân lớp IIa có kích thước <10kDa, chúng tôi tiến

hành điện di trên gel Tricine SDS-PAGE. Sau khi điện di, cắt đôi bản gel, nửa có marker
được nhuộm Coomasie brilliant blue, nửa còn lại được rửa (với 35% cồn, 2% glycerol 30÷60
phút, rửa nước cất vô trùng 15÷30 phút) để xác định hoạt tính kháng khuẩn. Đặt bản gel lên
đĩa petri vô trùng đã có sẵn 1 lớp thạch, sau đó đổ 1 lớp thạch bán lỏng có chứa chủng kiểm
định S. aureus. Úp ngược đĩa để trong tủ lạnh 4 giờ, sau đó nuôi 30
0
C trong 24 giờ.


A: Điện di trên gel acrylamide 16%
1: Thang protein chuẩn;
2: Tủa bacterioxin từ dịch nuôi cấy
B: Vùng ức chế S.aureus do bacteriocin
từ bản gel tạo ra sau khi điện di tricine-
SDS- PAGE).


Hình 3.25. Điện di tricine SDS- PAGE xác định kích thước và kiểm tra
hoạt tính bacterioxin của chủng LH19
Kết quả điện di cho thấy, bacterioxin do chủng LH19 tổng hợp có khối lượng phân tử
khoảng 3,5 kDa. Kết quả xác định hoạt tính kháng của bacterioxin tại bản gel sau điện di đối
với chủng kiểm định S. aureus cũng đã khẳng định kết quả này.
 Xác định độ bền của bacterioxin
Trong khoảng nhiệt độ <80
0
C và -20
0
C bacterioxin duy trì hoạt tính trong 120 phút. Đặc
biệt vẫn có hoạt tính kháng khuẩn ở 80
0

C trong vòng 60 phút và giảm hoạt tính trong 120
phút. Như vậy bacterioxin của chủng LH19 thuộc loại bền với nhiệt độ. Bacterioxin cũng thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn trong khoảng pH từ axit (2,0) đến trung tính (7,0), đây là một đặc
điểm mà nhiều bacterioxin không có (như nisin chủ yếu thể hiện hoạt tính trong vùng axit).
Như vậy sử dụng LH19 trong sản xuất chế phẩm VSV là phù hợp trong điều kiện xử lý chất
thải chăn nuôi.
3.2.4.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng
LH19
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng LH19 được nuôi lắc ổn nhiệt trên môi trường dịch thể MRS, ở các nhiệt độ 25, 30,
35, 40, 45, 50
0
C, trong thời gian 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp axit
lactic và khả năng kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy của chủng LH19.
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của
chủng LH19
Nhiệt độ nuôi
(
0
C)
Khả năng sinh
trưởng (OD, 600nm)
Hàm lượng axit
lactíc
ĐK vòng vô khuẩn
(D-d, mm)
(mg/ml)
25
1,8
14,8

14
30
2,2
23,5
19
35
3,2
27,9
22
40
2,3
21,2
17
45
1,2
8,4
8
50
0,7
5,0
6
Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy chủng VK lactic LH19 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn
trong dải nhiệt độ 25- 50
0
C. Ở nhiệt độ 35
0
C thì OD, hàm lượng axit lactic, kích thước vòng
kháng khuẩn đều đạt mức cao nhất (lần lượt là 3,2; 27,9 mg/ml và 22mm). Khả năng sinh
trưởng, tổng hợp axit lactic và kháng khuẩn giảm nhanh ở nhiệt độ 45
0

C và 50
0
C tuy nhiên
vẫn có khả năng kháng khuẩn. Nhiệt độ 30- 40
0
C là thích hợp cho sinh trưởng, tổng hợp axit
lactic và ức chế chủng VK gây thối E.carotovora KT03. Điều này phù hợp với nghiên cứu
của cho rằng mặc dù không hình thành bào tử nhưng VK lactic vẫn có thể tồn tại trong điều
kiện nhiệt độ dưới 15
0
C và nhiệt độ trên 40
0
C.
Như vậy trong đống ủ chất thải chăn nuôi, VK lactic sẽ sinh trưởng, tổng hợp các chất
kháng khuẩn mạnh và hoạt động hiệu quả trong vòng 3 ngày đầu khi nhiệt độ đống ủ <50
0
C
nhưng vẫn tồn tại trong đống ủ trong quá trình xử lý.
* Ảnh hưởng của pH
Nuôi lắc ổn nhiệt trên môi trường MRS. Điều chỉnh và ổn định bằng đệm ở các pH khác
nhau từ 4,0 đến 9,0 trong thời gian 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp axit
lactic, khả năng kháng E. carotovora KT03 của dịch nuôi cấy chủng LH19.
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của chủng
LH19
pH
Khả năng sinh
trưởng (OD, 600nm)
Hàm lượng axit lactíc
(mg/ml)
ĐK vòng vô khuẩn

với E. carotovora (D-
d,mm)
4
0,9
16,8
18
5
1,6
25,3
19
6
2,2
29,2
22
7
3,2
30,5
22
8
2,4
25,0
17
9
1,2
19,6
13
Ở pH 4- 9 chủng LH19 đều có khả năng sinh trưởng, tổng hợp axit lactic và bacterioxin.
Tuy nhiên ở pH 4, khả năng sinh trưởng của chủng LH19 kém (OD chỉ đạt 0,9) do đó hàm
lượng axit lactic cũng ở mức thấp (16,8 mg/ml). Khả năng sinh trưởng (OD) và sinh tổng hợp
axit lactic tăng nhanh ở pH 5-7, đạt cao nhất ở pH 7 (lần lượt là 3,2 và 30,5mm/ml), ở pH 9,

khả năng sinh trưởng (OD) và sinh tổng hợp axit lactic lại giảm xuống mức thấp (1,2 và 19,6
mg/ml). Trong khoảng pH 4- 8, chủng LH19 vẫn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao (17-
22mm). Kích thước vòng kháng khuẩn đạt cao nhất ở pH 6-7 là 22 mm và giảm ở pH 9
(13mm). Như vậy bacterioxin của chủng LH19 hoạt động mạnh trong khoảng pH từ axit nhẹ
đến trung tính và giảm dần ở pH kiềm.
Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các công trình đã công bố cho biết trong
điều kiện pH axit và trung tính, bacterioxin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn ở pH
kiềm, dải pH thích hợp của L. plantarum từ 4 cho đến 10, tuy nhiên Ogunbanwo và cs lại xác
định pH thích hợp cho hoạt tính của L. plantarum là từ 2 đến 8.
* Ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon
Nghiên cứu của chúng tôi nhằm mục đích tìm ra nguồn hydratcacbon là nguồn nguyên
liệu rẻ tiền, sẵn có ở các địa phương phù hợp với giá thành, điều kiện sản xuất chế phẩm VSV
ở nước ta.
Bảng 3.22. Sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn của chủng LH19 trên các loại đƣờng
khác nhau
Nguồn đường
Mật độ tế bào
(x 10
8
CFU/ml)
Hàm lượng axit
lactic (mg/ml)
ĐK vòng vô khuẩn với
E. carotovora (D-d,mm)
Sacaroza
1,2
26
20
Glucoza
46

30
23
Rỉ đường
28

32
22
Bảng 3.22 cho thấy chủng LH19 có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn ở cả 3 nguồn
đường. Glucoza là nguồn đường tốt nhất (Mật độ tế bào, lượng axit lactic và kích thước vòng
kháng khuẩn cao nhất, lần lượt là 4,6x 10
9
CFU/ml, 30 mg/ml, 23 mm). Trên môi trường rỉ
đường cũng cho lượng axit lactic và vòng kháng khuẩn cao tương đương. Như vậy có thể sử
dụng rỉ đường để thay thế glucoza trong điều kiện sản xuất qui mô lớn hoặc tại địa phương có
sẵn nguồn nguyên liệu rỉ đường.
* Ảnh hưởng của các muối nitơ vô cơ
Chủng LH19 được nuôi trên môi trường dịch thể trong các điều kiện thích hợp với sự bổ
sung các muối amon (0,1% nitơ trong phân tử muối amon). Sau 48h, xác định khả năng sinh
trưởng và ức chế vi khuẩn E. carotovora KT03 của chủng LH19.
Bảng 3.23. Ảnh hƣởng các muối nitơ vô cơ đến sinh trƣởng và hoạt tính của chủng
LH19
Muối nitơ
Khả năng sinh trưởng
(OD, 600 nm)
Đường kính vòng vô khuẩn với
E. carotovora (D-d,mm)
(NH
4
)
3

H
7
O
3

1,8
20
(NH
4
)
2
C
4
H
4
O
6

3,3
22
(NH
4
)
2
PO
4

2,3
19
NH

4
Cl
2,4
16
NH
4
NO
3

2,5
18
NH
4
H
2
PO
4

1,7
15
Amoni xitrat là thích hợp nhất cho sinh trưởng và khả năng kháng khuẩn của LH19 (OD
đạt 3,3, ĐT vòng vô khuẩn đạt 22 mm). Sự khác nhau này có thể do gốc xitrat có tính đệm
cao và tính axit yếu nên không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc khác. Kết quả
thử nghiệm này là phù hợp vì amoni xitrat được chọn là nguồn nitơ vô cơ trong môi trường
nuôi cấy chuẩn.
3.3. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ CHẤT THẢI
CHĂN NUÔI
- Điều kiện nhân sinh khối VSV: Kết quả nghiên cứu động thái sinh trưởng của 4 chủng
VSV (ở các mốc thời gian 24, 48, 72, 96h) đã xác định được thời gian nuôi cấy để mật độ tế
bào đạt mức cao nhất, từ đó xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất đối với

chủng XK112 là 72 giờ, các chủng B20, B15 và LH19 là 48 giờ.
- Tỷ lệ giống cấy: Thí nghiệm được triển khai với các tỷ lệ cấy giống gốc là 1, 2, 3, 4, 5 %.
Kết quả cho cho thấy ở tỷ lệ giống cấy 3%, cả 4 chủng nghiên cứu đều sinh trưởng và phát
triển tốt (đạt mức ổn định > 10
9
CFU/ml). Bổ sung 3% giống vào bình lên men vừa thích hợp
cho thu sinh khối vừa hiệu quả đối với chi phí sản xuất.
- Điều kiện cấp khí: Các được nuôi cấy trong các điều kiện cấp khí 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 và 0,73
dm
3
không khí/lít môi trường/phút. Nhu cầu oxy của chủng XK112 và B15 là 0,5-0,6 dm
3

không khí/lít môi trường/phút, của chủng B20 (0,3-0,4 dm
3
không khí/lít môi trường/phút).
Riêng chủng LH19 có nhu cầu oxy thấp nhất, có thể lên men tĩnh hoặc khuấy nhẹ (≤0,3dm
3

không khí/lít môi trường/phút).
- Môi trƣờng nhân sinh khối: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu gồm SX1, SX2,
SX3. Kết quả xác định sinh khối đạt cao nhất ở môi trường SX1 đối với chủng XK112, môi
trường SX2 đối với chủng LH19 và môi trường SX3 đối với chủng B20 và B15, mật độ tế
bào các chủng đều đạt ≥10
9
CFU/ml. Như vậy môi trường nhân sinh khối phù hợp đối với
chủng XK112 là SX; chủng LH19 là SX2 và chủng B20, B15 là SX3.
Tổng hợp các yếu tố kỹ thuật thích hợp cho quá trình lên men của 4 chủng VK nghiên
cứu được trình bày trong bảng 3.28.
Bảng 3.28. Điều kiện thích hợp nhân sinh khối của các chủng VSV nghiên cứu

Thông số kỹ thuật
Chủng vi khuẩn
XK11
2
B20
B15
LH19
pH
7,3 ± 0,2
7,0 ± 0,2
7,0 ± 0,2
6,5 ± 0,2
Nhiệt độ nhân sinh khối (
o
C)
37 ± 2
30 ± 2
30 ± 2
35 ± 2
Thời gian nhân sinh khối (giờ)
72
48
48
48
Tỷ lệ giống gốc (%)
3
3
3
3
Môi trường nhân sinh khối

SX1
SX3
SX3
SX2
Lưu lượng cấp khí (dm
3
KK/dm
3
môi trường/phút)
0,5-
0,6
0,3- 0,4
0,5- 0,6
≤ 0,3
3.3.2. Quy trình sản xuất chế phẩm
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho quá trình nhân sinh khối của các
chủng VSV và tham khảo các công trình nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xây dựng quy
trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý nhanh phế thải chăn nuôi. Qui trình sản xuất
chế phẩm vi sinh vật được tóm tắt theo sơ đồ sau:







Kiểm tra hoạt
tính
Kiểm tra
hoạt tính

Kiểm tra
hoạt tính

Nhân giống cấp
I
Nhân giống cấp
I

Nhân giống
cấp I

X khun phân giải
xenluloza (Streptomyces
griseosporeus)
Vi khuâ
̉
n phân giải tinh
bột (Bacillus licheniformis)
Vi khun lactic kháng
khun, khư
̉
mu
̀
i hôi
(Lactobacillus
plantarum)

Môi trường lên
men cấp II

Môi trường lên
men cấp I
Vi khuâ
̉
n phân
giải protein
(Bacillus subtilis)
Kiểm tra hoạt
tính

Nhân giống
cấp I

Hình 3.27. Sơ đồ Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi
3.3.3. Chất lƣợng chế phẩm
Bảng 3.29. Khả năng tồn tại của 4 chủng vi sinh vật trong chế phẩm
Chủng
VSV
Mật độ tế bào (x 10
8
CFU/ml)
0 giờ
7
ngày
1
tháng
2
tháng
3
tháng
6 tháng
XK112
5,6
40
56
52
42
4,6
B20
4,4
32
45
36

64
2,4
B15
5,2
46
55
40
18
3,8
Chất mang
(than bùn)
Nhân giống cấp
II
Nhân giống cấp
II

Nhân giống cấp
II

Phối trộn

Kiểm tra chất lượng

Bao gói

Bảo quản sử dụng

Lên men
xốp
Lên men xốp

Lên men xốp

Nhân giống cấp
II

Lên men xốp

Bổ sung
dinh
dưỡng
Sấy khô

LH19
3,6
32
12
62
1,4
0,42
Bảng 3.30. Hoạt tính của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19 trong chế phẩm
Chủng
VSV
Đường kính vòng phân giải (D-d, mm) sau thời gian bảo
quản
Đường kính vòng
kháng E.
carotovora KT03
(D-d, mm)
Xenluloza

Tinh bột
Protein
3 tháng
6 tháng
3 tháng
6 tháng
3
tháng
6 tháng
3 tháng
6 tháng
XK112
34
33
19
18
-
-
-
-
B20
27
25
38
36
-
-
-
-
B15

-

22
20
28
27
-
-
LH19
-
-
-
-
-
-
22
20
Sau 3- 6 tháng bảo quản, các chủng VSV vẫn tồn tại tốt trong chế phẩm; mật độ tế bào
của 3 chủng XK112, B20, B15 đạt 10
9
CFU/g sau 3 tháng và 10
8
CFU/g sau 6 tháng, riêng
chủng LH19 mật độ tế bào thấp hơn (đạt 10
8
CFU/g sau 3 tháng và 10
7
CFU/g sau 6 tháng).
Hoạt tính sinh học của các chủng sau 3 tháng bảo quản đều tương đương so với hoạt tính ban
đầu (bảng 3.7), sau 6 tháng hoạt tính vẫn tương đối ổn định. Như vậy, các yếu tố kỹ thuật lựa

chọn trong qui trình sản xuất thử nghiệm là phù hợp cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật để xử
lý chất thải chăn nuôi.
3.4. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI
3.4.1. Hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi
Căn cứ vào kết quả thử nghiệm và kế thừa kết quả nghiên cứu đã được công bố trong
nước và trên thế giới, đề tài đã xây dựng quy trình xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn tóm tắt
theo sơ đồ sau:



(Chất thải chăn nuôi + than bùn,
trấu, rơm rạ khô theo tỷ lệ 1:1đến 2:1)


Chất thải chăn
nuôi dạng rắn
Chế phẩm
VSV
Phối trộn

Điều chỉnh pH,
độ ẩm, tỷ lệ C/N
Ủ nóng

Đảo trộn, ủ chín, để
hoai đến nhiệt độ
không đổi

Hình 3.29. Sơ đồ Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi
3.4.1.1. Động thái nhiệt độ đống ủ
Khảo sát biến động nhiệt độ đống ủ trên 2 loại chất thải chăn nuôi gà và lợn dạng rắn. Thí
nghiệm với 2 công thức: Đối chứng (ĐC) không xử lý bằng VSV và thí nghiệm (TN) xử lý
bằng VSV.
Bảng 3.31. Biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý chất thải chăn nuôi
Thời gian theo dõi
(ngày)
Nhiệt độ khối ủ chất thải
nuôi lợn (
0
C)
Nhiệt độ khối ủ chất thải
nuôi gà (
0
C)
ĐC
TN
ĐC
TN
0
29,0
29,0
29,5
29,5
2

34,0
38,5
34,5
39,0
4
41,3
52,0
42,0
52,7
7
Trước/sau đảo trộn
47,5 / 33,5
60,5 /
34,8
48,0 / 35,0
62 / 35,5
9
42,6
53,5
43,0
55,3
12
46,5
55,0
47,6
56,5
15
Trước/sau đảo trộn
50,8 / 36,0
51 / 34,6

51 / 41,2
51,5 /
35,0
18
45,7
40,2
46,0
42,5
21
46,0
35,5
47,2
36,0
24
46,5
34,6
48,3
35,0
Làm khô, đóng bao,
kiểm tra, sử dụng