Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng lactobacillus spp có hoạt tính probiotic từ dịch âm đạo phụ nữ khỏe mạnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng Lactobacillus
spp. có hoạt tính probiotic từ dịch âm đạo phụ nữ khỏe mạnh

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng Lactobacillus
spp. có hoạt tính probiotic từ dịch âm đạo phụ nữ khoẻ mạnh

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo chuẩn)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội 2019


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận, em đã
luôn nhận được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các thầy, cô giáo cũng như sự
quan tâm chăm sóc từ gia đình và bạn bè. Đó là nguồn động lực giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn để hoàn thành khóa luận này.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, bộ môn
Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội,
người đã trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình
hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tất cả các thầy cô, cán bộ, anh chị và bạn bè thuộc
phòng thí nghiệm GREEN LAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống,
bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học; phòng Sinh học Nano và Ứng dụng –
KLEPT, khoa Môi trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình
cộng tác và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn Đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số chế phẩm
probiotic từ một số loài Lactobacillus sp. và Bacillus sp. ứng dụng nhằm nâng
cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ” do Bộ Công thương quản lý đã hỗ trợ kinh
phí cho việc thực hiện các nghiên cứu của khóa luận.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, những người
thân yêu đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ em cả về mặt vật chất lẫn tinh
thần trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2019
Sinh viên


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Hệ thống tính điểm (0 đến 10) đối với mẫu âm đạo nhuộm Gram. .. 23
Bảng 2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA........ 26
Bảng 3: Kí hiệu thể hiện cường độ màu và khả năng sinh H2O2. .................. 28
Bảng 4: Phân loại mẫu dựa vào điểm số Nugent ......................................... 32

Bảng 5: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập được từ các mẫu âm
đạo: .............................................................................................................. 33
Bảng 6: Kết quả định danh 3 chủng H1, H2, H3: ........................................ 35
Bảng 7: Mã số đăng kí trên NCBI của 2 chủng H1, H2 ............................... 36
Bảng 8: Vòng kháng kháng sinh của 3 chủng đối với 7 loại kháng sinh ....... 41


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Ảnh nhuộm Gram hình thái Lactobacillus ...................................... 18
Hình 3: Ảnh nhuộm phân loại mẫu âm đạo theo điểm Nugent: A và B: mẫu
âm đạo bình thường; C và D: mẫu âm đạo viêm nhiễm nhẹ; E và F: mẫu âm
đạo viêm nhiễm nặng[22]. ............................................................................ 22
Hình 4: Khả năng sinh H2O2 của các mẫu lactobacilli phân lập được[10] .. 29
Hình 5: Đường cong sinh trưởng theo thời gian của 3 chủng H1, H2, H3 ... 37
Hình 6: Lượng axit lactic sinh ra của 3 chủng H1, H2, H3 trong 32 giờ. .... 38
Hình 7: Khả năng chịu muối mật của 3 chủng H1,H2,H3: A- Nồng độ muối
mật 0.3%; B- Nồng độ muối mật 3%. ........................................................... 39
Hình 8: Khả năng sống sót tại các độ pH khác nhau của 3 chủng H1, H2,
H3: A- tại pH2; B- tại pH3; C- tại pH4; D- tại pH5; E- tại pH6. ................. 40
Hình 9: Cường độ màu thể hiện khả năng sinh H2O2 của 3 chủng H1, H2, H3
..................................................................................................................... 40
Hình 10: Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của 3 chủng H1, H2, H3: Achủng H3, B- chủng H2, C- chủng H1. ......................................................... 42
Hình 11: Sự bắt màu tím kết tinh cuả các tế bào bám trên thành ống
eppendorf ..................................................................................................... 42
Hình 12: Khả năng tạo màng biofilm đo ở bước sóng 570nm. ..................... 43
Hình 13: Khả năng phát triển của H1, H2, H3 trong điều kiện nuôi lắc và
nuôi tĩnh. ...................................................................................................... 43
Hình 14: Khả năng phát triển trên các nhiệt độ khác nhau: A: chủng H1, B:
chủng H2, C: chủng H3 ................................................................................ 44
Hình 15: Độ đục trong dịch môi trường ở các nhiệt độ của chủng H3 ......... 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BV

: Bacterial vaginosis

CTC

: Cổ tử cung

DNA

: Deoxyribonucleic acid

MRS

: Man, Rogasa and, Sharpe

MRSB

: Man, Rogasa and Shape Broth

OD

: Optical Density (mật độ quang)

SKSS

: Sức khỏe sinh sản

VNĐSDD

: Viêm nhiễm đường sinh dục dưới

PCR

: Polymerase Chain Reaction


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ 3
MỤC LỤC ..................................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................ 10
1.1.

Tổng quan về sức khỏe sinh sản phụ nữ ............................................. 10

1.2.

Probiotic với sức khỏe sinh sản của phụ nữ ........................................ 13

1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................ 13
1.2.2. Vai trò của probiotics ....................................................................... 14
1.2.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở
phụ nữ ......................................................................................................... 15
1.4.

Mục tiêu đề tài:................................................................................... 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 20
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ....................................... 20

2.1.2. Thiết bị ............................................................................................. 20
2.1.3. Dụng cụ ............................................................................................ 20
2.2.

Phương pháp nghiên cứu: ................................................................... 21

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu: ............................................................................. 21
2.2.2. Phân loại mẫu ................................................................................... 21
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn ................... 23
2.2.4. Xác định hoạt tính probiotics của các chủng vi khuẩn: ..................... 26
2.3.

So sánh sinh khối tế bào ở 2 chế độ nuôi lắc và nuôi tĩnh: .................. 30

2.4.

Khảo sát khả năng phát triển ở các nhiệt độ:....................................... 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 32


3.1.

Khái quát chung tình hình sức khỏe sinh sản của phụ nữ độ tuổi 18 - 40

thông qua phân loại mẫu............................................................................... 32
3.2.

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp................................................... 32

3.3.

Định danh vi khuẩn phân lập được từ mẫu âm đạo ............................. 34

3.4.

Hoạt tính của các chủng Lactobacillus phân lập được từ mẫu âm

đạo…………………………………………………………………………...37
3.4.1. Khả năng sinh trưởng ....................................................................... 37
3.4.2. Khả năng sinh axit lactic .................................................................. 38
3.4.3. Khả năng chịu muối mật: .................................................................. 39
3.4.4. Khả năng chịu axit: ........................................................................... 39
3.4.5. Khả năng sinh H2O2.......................................................................... 40
3.4.6. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh: ................................................. 41
3.4.7. Khả năng tạo màng biofilm .............................................................. 42
3.5.

So sánh So sánh sinh khối tế bào ở 2 chế độ nuôi lắc và nuôi tĩnh: ..... 43

3.6.

Khảo sát khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau: ...................... 44

KẾT LUẬN .................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ........................................................................... 47
PHỤ LỤC .................................................................................................... 51


MỞ ĐẦU
Các probiotic có vai trò rất lớn đối với hệ tiêu hóa và miễn dịch của vật
chủ. Nhiều loài vi khuẩn lactic được biết đến với vai trò probiotic, được sử
dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic phục vụ cuộc sống của con người.
Phần lớn các probiotic có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic thuộc 2 chi chính là:
Lactobacillus và Bacillus .
Viêm nhiễm phụ khoa hiện nay được coi là bệnh nhiễm trùng phổ biến
ở các nước nhiệt đới như Việt Nam, khoảng 90% phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ
mắc bệnh này. Viêm nhiễm phụ khoa có thể gây ra những khó chịu, ảnh hưởng
đến sức khoẻ, đời sống, khả năng lao động của người phụ nữ. Ở Việt Nam trong
những năm gần đây, các nghiên cứu về viêm nhiễm phụ khoa cho thấy tỷ lệ
mắc bệnh cao, chiếm 25% đến 78,4% tùy theo vùng miền. Bệnh cũng có thể
gây ra những hậu quả nặng nề như: chửa ngoài tử cung, vô sinh, ung thư cổ tử
cung, tăng nguy cơ lây truyền vi rút gây suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV),
vi rút gây u nhú ở người (HPV); Ở phụ nữ có thai, viêm âm đạo, cổ tử cung
(CTC) có thể gây sẩy thai, đẻ non, ối vỡ non, nhiễm khuẩn ối, nhiễm khuẩn sơ
sinh.
Viêm âm đạo do vi khuẩn (Bacterial vaginosis - BV) là bệnh phổ biến
trong các bệnh lý nhiễm trùng đường sinh dục dưới của phụ nữa trong độ tuổi
sinh sản. Bệnh gây ra bởi Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, vi
khuẩn kỵ khí, do sự thay thế Lactobacillus (nhóm vi khuẩn có lợi của âm đạo),
dẫn đến sự phát triển quá mức của vi khuẩn yếm khí.
1.
Xuất phát từ thực tế đó đề tài nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn, nghiên

cứu các chủng probiotic từ dịch âm đạo phụ nữ khỏe mạnh” được tiến hành với
các mục tiêu sau đây: Phân lập các chủng Lactobacillus spp. từ dịch âm đạo
phụ nữ khỏe mạnh.
2.
Lựa chọn được chủng có hoạt tính probiotic tốt và nghiên cứu đặc điểm
sinh học của chúng.

9


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về sức khỏe sinh sản phụ nữ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sức khỏe sinh sản (SKSS) là trạng
thái khỏe mạnh về thể chất, tinh thần và hòa hợp xã hội về tất cả các phương
diện liên quan đến hệ thống sinh sản trong suốt các giai đoạn của cuộc đời.
Chăm sóc SKSS là một tập hợp các phương pháp, kỹ thuật và dịch vụ nhằm
giúp cho con người có tình trạng SKSS khỏe mạnh thông qua việc phòng chống
và giải quyết những vấn đề liên quan đến SKSS. Điều này cũng bao gồm cả sức
khỏe tình dục với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống và mối quan hệ giữa
con người với con người mà không chỉ dừng lại ở chăm sóc y tế và tư vấn một
cách đơn thuần cho việc sinh sản và những nhiễm trùng qua đường sinh dục.
Sức khỏe sinh sản đang là một vấn đề rất nóng hiện nay. Các nghiên cứu
về sức khỏe sinh sản được tiến hành rất sớm trên thế giới, chủ yếu là các nước
phát triển như Mỹ và các nước châu Âu. Hiện nay, tỉ lệ phụ nữ trong độ tuổi
sinh đẻ mắc viêm nhiễm phụ khoa rất cao, đây được coi là một vấn đề lớn đã
và đang rất được quan tâm vì những thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra là rất
lớn, những gánh nặng về y tế, cũng như các vấn đề về gia đình và xã hội. Nếu

bệnh không được điều trị kịp thời hoặc điều trị không đúng, không đầy đủ có
thể gây ra những biến chứng như: vô sinh, chửa ngoài tử cung, sảy thai, ung
thư cổ tử cung, các biến chứng cho thai nhi như thai chết lưu, dị tật bẩm sinh,
trì độn trí tuệ...
Viêm âm đạo do vi khuẩn (Bacterial vaginosis – BV) là nhiễm trùng âm
đạo nội sinh, gây ra chủ yếu bởi Garndnerella vaginolis, Mycoplasma hominis,
vi khuẩn kỵ khí. Bệnh gây ra do sự thay thế vi khuẩn Lactobacillus (nhóm vi
khuẩn có lợi ở âm đạo), dẫn đến tình trạng phát triển quá mức của vi khuẩn
yếm khí.
Trên thế giới và ở Việt Nam, viêm âm đạo do vi khuẩn là bệnh phổ biến
trong các bệnh lý nhiễm trùng đường sinh dục dưới ở phụ nữ trong độ tuổi sinh
sản.Viêm âm đạo gặp ở tất cả các chủng tộc người. Tần suất cao nhất của viêm
âm đạo do vi khuẩn là người da đen (23%), và thấp nhất là người châu Á (6%).

10


Tại Hoa Kỳ, theo khảo sát của Y tế Quốc gia thì tỉ lệ mắc BV chiếm 29%
ở phụ nữ tuổi từ 14 – 49 và 50% ở người Mỹ gốc Phi [8]. Nghiên cứu của Gavin
và cộng sự về sức khỏe sinh sản và tình dục từ 2002-2007 cho thấy riêng năm
2006, có khoảng 1 triệu người ở tuổi vị thành niên và thanh niên tuổi từ 10 –
24 tuổi ở 33 bang đã bị bệnh lậu do nhiễm Chlamydia hoặc giang mai [15]. Ở
các quốc gia đang phát triển, có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo với tỷ lệ
mắc bệnh cũng rất cao. Theo Aggarwal và cộng sự [7] nghiên cứu trên 2.325
phụ nữ có chồng trong độ tuổi sinh đẻ tại vùng nông thôn Harryana, Ấn Độ đã
thấy có tới 61% mắc ít nhất một triệu chứng của viêm nhiễm đường sinh sản,
viêm âm đạo là 32%, viêm cổ tử cung là 21%, bệnh lý viêm khung chậu là 19%,
xét nghiệm dịch âm đạo có 48% viêm âm đạo do vi khuẩn Gardnerella
vaginalis, Bacteroides spp., Prevotella bivia…, 9% do trùng roi âm đạo và
0,8% do nấm C. albicans.

Tại Việt Nam, viêm nhiễm đường sinh sản là một trong những bệnh rất
hay gặp ở phụ nữ và là bệnh phụ khoa thường gặp nhất ở độ tuổi hoạt động tình
dục. Các bệnh viêm nhiễm đường sinh sản là một vấn đề đang rất được quan
tâm trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt ở phụ nữ, các nghiên
cứu về VNĐSDD cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao, chiếm 40% đến 80 % tùy theo
vùng miền [2, 4, 5].
Nghiên cứu của Bùi Thị Thu Hà ở 380 phụ nữ từ 18- 49 tuổi ở nội thành
Hà Nội (2007) [3] cũng nhận thấy tỷ lệ mắc nhiễm trùng đường sinh sản rất cao
62,1%, trong đó viêm âm đạo do vi khuẩn chiếm chủ yếu với tỷ lệ 50,0%, do
C. trachomatis là 45,8%, nấm C. albicans là 31,8% và thấp nhất là T. vaginalis
là 3,8%.
Một số nghiên cứu trên phụ nữ tuổi sinh đẻ 15-49 tuổi có chồng tại một
số vùng nông thôn cho kết quả là tỷ lệ nhiễm trùng đường sinh sản là 63,8%,
trong đó viêm âm đạo đơn thuần là 37,4%; viêm cổ tử cung (CTC) đơn thuần
và kết hợp viêm âm đạo là 17,9%; lộ tuyến CTC đơn thuần và kết hợp viêm âm
đạo là 8,9%. Vi sinh vật gây bệnh hay gặp là tạp khuẩn 59,8%; nấm 23,3%;
Trichomonas 0,6%; Gardnerella 6,7%. Tỷ lệ nhiễm trùng đường sinh sản của
phụ nữ tuổi sinh đẻ có chồng tại 5 tỉnh phía Bắc là 43,1%. Trong đó, viêm âm
đạo là 44,2%; viêm CTC là 28,3%; viêm âm hộ là 3,2%. Nguyên nhân gây bệnh
11


do vi khuẩn chiếm 64,8%; do nấm là 19,8%; do Trichomonas 1,9% và phối hợp
là 13,5%.
Một nghiên cứu khác tại 5 tỉnh trong cả nước năm 2011 cho kết quả là ở
nội thành Hà Nội có 41,5% phụ nữ bị nhiễm trùng đường sinh sản, trong đó do
vi khuẩn chiếm 25,6%, do nấm chiếm 15,3%. Vùng ngoại thành Hà Nội có tới
59,6% phụ nữ bị nhiễm trùng đường sinh sản, trong đó nhiễm nấm cao nhất
39,9%, do G. vaginalis là 18,9%, các vi khuẩn khác chiếm tỷ lệ thấp hơn, tỷ lệ
nhiễm cả hai căn nguyên là 15,7%.

Vùng ven biển Thái Bình có 56,9% phụ nữ bị nhiễm trùng đường sinh
sản, trong đó cao nhất là do nấm C. albicans 28,6%, do G. vaginalis khá cao
26,8%, do vi khuẩn khác có tỷ lệ thấp hơn, do lậu cầu 0,3%, nhiễm 2 căn nguyên
trở lên là 21,7%. Vùng chiêm trũng Hà Nam có 58,4% phụ nữ bị nhiễm trùng
đường sinh sản, trong đó cao nhất là do nấm C. albicans 38,7%, do G. vaginalis
18,7%, do vi khuẩn khác có tỷ lệ thấp hơn. Vùng núi tỉnh Nghệ An, tỷ lệ phụ
nữ mắc nhiễm trùng đường sinh sản rất cao, chiếm 64,1%, cao nhất trong các
vùng mà tác giả nghiên cứu, trong các tác nhân gây bệnh, cao nhất là do nấm
32,31%, do G. vaginalis là 28,7%, do vi khuẩn khác có tỷ lệ thấp hơn.
Vùng đồng bằng tỉnh Hải Dương, có 52,0% phụ nữ bị nhiễm trùng đường
sinh sản, trong đó cao nhất là do tụ cầu chiếm 19,0%, xếp sau là do nấm 14,7%
và do E. coli là 11,6%.
Lê Hoài Chương (2011) khảo sát 960 phụ nữ 18-49 tuổi đến khám tại
Bệnh viện Phụ sản Trung ương phát hiện thấy có 83,1% phụ nữ có ít nhất một
hình thái tổn thương đường sinh dục dưới, trong đó viêm âm đạo chiếm tỷ lệ
cao nhất (66,6%), viêm âm đạo kết hợp CTC chiếm 33,8%, tỷ lệ nhiễm nấm
chiếm 35,3%; nhiễm Gardnerella chiếm 15,9%.
Nghiên cứu của Nông Thị Thu Trang (năm 2015) tại Thái Nguyên cho
thấy, tỷ lệ nhiễm trùng đường sinh sản ở phụ nữ nông thôn là 35,4%; căn
nguyên hàng đầu là vi khuẩn (43,3%), tiếp theo là Candida 28,0%. Một số
nghiên cứu khác chỉ ra rằng kiến thức của người dân, đặc biệt là đối tượng vị
tuổi thành niên, ở nông thôn và miền núi về các bệnh nhiễm trùng đường sinh

12


sản, hậu quả của bệnh cũng như về điều trị các bệnh này là thấp, tỷ lệ người
biết dưới 60%, đặc biệt hiểu biết về hậu quả và điều trị bệnh đều dưới 50%.
Mặc dù nhiễm trùng đường sinh sản có thể có các triệu chứng khác nhau,
nhưng không phải lúc nào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra. Trên thực tế, chẩn

đoán thậm chí còn khó khăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm. Các trường hợp
nhiễm trùng nặng được bác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với
liều khá cao nên gây ra các tác dụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới
sức khoẻ và sinh hoạt tình dục, và nếu được điều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng
kháng thuốc kháng sinh, một vấn đề nổi cộm và thách thức hiện nay.
1.2.

Probiotic với sức khỏe sinh sản của phụ nữ

1.2.1. Định nghĩa
Probiotic là một loại lợi khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật sống, thường là vi
khuẩn, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe. Theo WHO
với lượng là 108 đơn vị hay 100 triệu đơn vị tế bào lợi khuẩn được WHO quy
định là liều đầy đủ số lượng probiotic cho mỗi lần bổ sung, tùy thuộc vào tình
trạng, mỗi người có thể sử dụng tới 1011. Lactobacillus và Bacillus thường được
xem là những loại probiotic phổ biến. Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm
cả vi khuẩn có lợi và có hại. Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể
giúp kìm hãm các vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng
cũng như tăng cường khả năng miễn dịch. Khi vi khuẩn có hại trong cơ thể lấn
át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học để lấy lại
sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể.
Probiotics là những chế phẩm có chứa các vi sinh vật sống, khi đưa vào
cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là hệ tiêu hóa.
Một probiotics được xem là “tốt” nếu đáp ứng 5 yếu tố sau:
- Chế phẩm chứa vi sinh vật sống.
- Xác định cụ thể chi, loài, chủng và được phân lập tới chủng.
- Đảm bảo liều lượng lợi khuẩn cho đến hết hạn sử dụng (tối thiểu 108 đơn
vị).
- Hiệu quả đạt được chúng minh qua các nghiên cứu lâm sàng có đối chứng
trên người.

13


- Có bằng chứng về độ an toàn trên người.
1.2.2. Vai trò của probiotics
Probiotics có rất nhiều vai trò quan trọng đối với cơ thể con người như:
tăng cường hệ miễn dịch, kháng khuẩn, chống ung thư, dị ứng, điều trị một số
bệnh về tiêu hóa. [12]
Tác động kháng khuẩn
Làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là: tiết
ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức
chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide
và chất diệt khuẩn. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh
vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất
của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm
pH môi trường khoang ruột thông qua việc tạo ra các acid hữu cơ đặc biệt là
acid lactic, cũng như một số acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate,
propionate, và butyrate.
Cạnh tranh với nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và
cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh.
Tác động trên mô biểu bì ruột:
Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô. Giảm việc kích
thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm gây ra do lây nhiễm vi khuẩn. Đẩy
mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy.
Tác động miễn dịch:
Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng
viêm cho đường ruột. Cụ thể là đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm
giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ
vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
Tác động đến vi khuẩn đường ruột:

Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Sự sống sót của
probiotic ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các
14


giống. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ
sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt
đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng
của giống vi khuẩn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nếu sự tiêu thụ thường xuyên,
vi khuẩn probiotic định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự
tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này thì đúng cho
tất cả các loại probiotic.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường
ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó
sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột. Vi khuẩn
probiotic cũng giúp làm tăng sự dung nạp đường lactose thông qua việc giúp
tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa
nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại.
Một số vai trò khác đối với cơ thể:
 Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của
cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như (folic acid, niacin,
riboflavin, vitamin B6 và B12).
 Chống ung thư: nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm
giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra còn có tác
dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển
của các khối u bướu.
 Giúp giảm cholesterol trong máu: Làm giảm nồng độ cholesterol trong
huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra còn giúp nhanh chóng bình
phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh.
 Giảm nguy cơ sỏi thận do ảnh hưởng đến sự bài tiết oxalate trong nước tiểu,

do đó giảm sự hình thành sỏi.
1.2.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục
ở phụ nữ
Tạo ra H2O2:
H2O2 là một chất oxi hóa mạnh. Các nghiên cứu đã cho thấy chất này
cũng giống như các gốc ROS khác như O2- hay OH- có khả năng gây tổn thương
oxi hoá cao khi tham gia vào phản ứng Fenton. Chúng gây tổn thương cấu trúc
15


và chức năng các đại phân tử trong tế bào như protein, AND, lipid…dẫn đến
gây chết mạnh vi khuẩn [28]. Một số chủng Lactobacillus spp. được tìm thấy
có tác dụng ức chế sự phát triển các mầm mống nhiễm khuẩn âm đạo trong ống
nghiệm, bằng cách sản xuất tạo ra H2O2. Mastromarino và nhóm cộng sự đã
nghiên cứu L. salivarius FV2 và L. gasseri 335 được phân lập từ âm đạo của
người và phát hiện thấy chúng có thể sản xuất ra một lượng lớn H2O2 cũng như
ức chế sự tăng trưởng của G. vaginalis [20]. McLean và Rosenstein đã chứng
minh L. acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã
sản xuất lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp.,
Prevotella bivia và G. vaginalis được lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm
khuẩn âm đạo [21]. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu chứng minh
Lactobacilli sản xuất peroxide bảo vệ cho đường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng
và quan điểm cho rằng H2O2 là yếu tố kháng khuẩn chính được sản xuất bởi
Lactobacillus vẫn là phổ biến nhất, một nghiên cứu in-vitro khác lại chứng
minh rằng H2O2 được tạo ra do Lactobacillus không phải là nguyên nhân chính
gây ức chế tác nhân gây bệnh. Các Lactobacillus này sản xuất H2O2 có thể làm
khả năng làm tăng hoạt động của các chuỗi peptide kháng khuẩn của vật chủ
(muramidase và lactoferrin) cũng như hoạt tính kháng khuẩn của các tế bào
biểu mô [29].
Tạo ra axit lactic:

Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạo
của acid lactic được chứng minh rõ ràng. Acid lactic ở nồng độ sinh lý (ví dụ:
110 mM) thậm chí ở pH 4,5 làm giảm 106 lần khả năng tồn tại của 17 loại vi
khuẩn khác nhau gây viêm nhiễm âm trong khi đó lại không ảnh hưởng đến
khả năng tồn tại của bốn loài Lactobacillus spp âm đạo trong nghiên cứu invitro. Đáng chú ý là hoạt tính kháng khuẩn của axit lactic có cường độ lớn hơn
các chất được axit hóa đến pH 4,5 như HCl hoặc với axit axetic [26]. Ngoài ra,
ở gần điều kiện ex-vivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ không kết hợp với bacteriocin
vẫn có hiệu quả kháng vi khuẩn gây viêm nhiễm ở đường sinh dục nữ [14]. Một
số nghiên cứu đã chứng minh rằng axit lactic có tác dụng chính trong chống lại
các bệnh do vi khuẩn gây ra bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually
Transmitted Infections- STIs) chứ không phải là H2O2. Axit lactic sinh ra bởi
16


L. crispatus và L. gasseri đã làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [6, 23]và
Neisseria gonorrhoeae [16]. Axit lactic sản xuất bởi L. crispatus đã được chứng
minh có tác dụng ức chế N. gonorrhoeae và Gardnerella vaginalis trong mô
hình niêm mạc âm đạo ở lợn [11]. Tóm lại, những nghiên cứu in-vitro và exvivo đều cho thấy rằng axit lactic được sản sinh ở các chủng probiotic thuộc chi
Lactobaciilus có khả năng duy trì hệ vi sinh vật âm đạo và bảo vệ vi khuẩn
chống lại STIs.
Khả năng bám dính hay tạo màng biofilm:
Giúp đẩy mạnh sự liên kết giữa những tế bào biểu mô, giảm kích thích
bài tiết và những hậu quả do bị viêm nhiễm gây ra bởi vi khuẩn, đẩy mạnh sự
tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy.
1.3.

Lactobacillus đối với sức khỏe sinh sản phụ nữ:
Mối liên hệ giữa probiotic và sức khỏe âm đạo chưa được nghiên cứu

thật đầy đủ. Tuy nhiên, probiotic được cho là có khả năng cung cấp cho cơ thể

các vi khuẩn có lợi để chống lại vi khuẩn có hại, bao gồm cả vi khuẩn ở âm
đạo. Điều này có nghĩa rằng chế phẩm sinh học có thể giúp âm đạo của phụ nữ
tránh được một số bệnh. Hệ sinh thái âm đạo đạt được sự cân bằng nhờ các vi
khuẩn có lợi như Lactobacillus.
Lactobacillus là một chi của vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện hoặc
vi hiếu khí , có dạng hình que, vi khuẩn không hình thành bào từ. Chúng là một
phần chính của nhóm vi khuẩn lactic (tức là chúng chuyển hóa đường thành
axit lactic). Ở người, chúng trở thành một thành phần quan trọng của hệ vi sinh
vật tại một số vị trí của cơ thể, chẳng hạn như hệ tiêu hóa , hệ tiết niệu và hệ
thống sinh dục. Ở phụ nữ có nguồn gốc châu Âu, các loài Lactobacillus thường
là một phầnchính của hệ vi khuẩn âm đạo. Lactobacillus hình thành màng sinh
học trong hệ vi sinh vật âm đạo và ruột, cho phép chúng tồn tại trong điều kiện
môi trường khắc nghiệt và duy trì quần thể rộng rãi. Lactobacillus là chế phẩm
sinh học phổ biến nhất được tìm thấy trong thực phẩm như sữa chua, và nó rất
đa dạng trong ứng dụng của nó để duy trì sức khỏe của con người, vì nó có thể
giúp điều trị tiêu chảy, nhiễm trùng âm đạo và các rối loạn về da như bệnh
chàm. Chi Lactobacillus hiện có hơn 180 loài.
17


người, đặc biệt là cho phụ nữ. Các chế phẩm probiotic trên thị trường do Việt
Nam sản xuất hiện chỉ tập trung vào probiotics đường ruột, đặc biệt là dành cho
trẻ em. Trong khi đó các chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ được phụ nữ
Việt Nam dùng hiện nay thì đều được nhập khẩu từ nước ngoài, đặc biệt các
nước phát triển như Anh, Mỹ, … với giá thành rất cao. Vì vậy để tìm kiếm các
chủng vi khuẩn probiotic tiềm năng, chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng
vi khuẩn có lợi, đặc biệt là các chủng Lactobacillus từ dịch âm đạo phụ nữ khỏe
mạnh.
Đề tài “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng
Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic tốt từ dịch âm đạo phụ nữ khỏe mạnh”

được tiến hành nhằm phân lập các chủng Lactobacillus spp. từ dịch âm đạo phụ
nữ khỏe mạnh, sau đó lựa chọn được chủng có hoạt tính probiotic tốt và nghiên
cứu đặc điểm sinh học của chúng.

19


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.1.1. Đối tượng:
30 mẫu dịch âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh từ 18 – 40 tuổi.
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu:
Các tiêu chí loại trừ khi lấy mẫu bao gồm: mang thai, điều trị kháng
sinh trong vòng một tháng trước khi lấy mẫu và quan hệ tình dục trong vòng
ba ngày trước khi lấy mẫu.
Sau khi lấy mẫu, người lấy mẫu và người thu thập mẫu sẽ cùng nhau
hoàn thành phiếu câu hỏi (Phụ lục 1) phục vụ cho mục đích nghiên cứu. Toàn
bộ thông tin về người lấy mẫu sẽ được bảo mật theo đúng tiêu chuẩn y đức.
Tất cả các mẫu được lấy từ vùng sau của đường âm đạo sử dụng một
miếng gạc vô trùng. Mỗi người lấy mẫu vào 2 miếng bông gạc. Miếng bông
gạc chứa mẫu âm đạo được đưa vào trong 1ml nước muối sinh lý 0,9% [25].
Các mẫu sau đó được phân loại dựa trên điểm số Nugent.
2.1.2. Thiết bị
Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB – 30; Serial No:
0398272117PO10; Hàn Quốc).
Bình khí N2 pure và dây dẫn khí để tạo môi trường Kỵ khí (Model:
Tornado LS/B –He; Việt Nam).

-

Cân điện tử để xác định trọng lượng các thành phần của môi trường

(Model: precisa 310M, Thụy Sĩ).
Box cấy kỵ khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh); tủ ổn nhiệt
(Imperia III).
-

Máy đo OD để xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật (Model:

Biomate 3; Serial No: 2KBK 138001; Mỹ)
Máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức), hệ thống điện di gel agarose
( NixTechnik, Pháp), kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật).
Tủ 37oC
2.1.3. Dụng cụ
Pipet, đầu côn, đĩa Petri, ống falcol, ống eppendorf, bình tam giác, ống
đong, ống nghiệm...
20


MgSO4.7H2O

0,2 g

MnSO4

0,05 g

CH3COONa

5g

CaCO3 (môi trường thạch)

10 g

Agar (môi trường thạch)

15 g

H 2O

1 lít

Chuẩn pH 6,2 – 6,5. Khử trùng ướt môi trường 1100C trong 20 phút.
Môi trường MRSB không có CaCO3 và agar.
2.2.3.2.

Phân lập và xác định vi khuẩn.

Sau 48 giờ, trên mặt đĩa thạch MRS sẽ xuất hiện các khuẩn lạc với các
hình thái khác nhau. Tiến hành cấy ria 3 pha các khuẩn lạc nhìn thấy hình thái
đặc trưng của lợi khuẩn lactobacilli. Các khuẩn lạc riêng lẻ của pha thứ 3 sau
đó sẽ được định danh.
2.2.3.3.

Định danh vi khuẩn

 Tách chiết và tinh sạch ADN

Các khuẩn lạc riêng lẻ sẽ được tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết
ADN (Magpure Bacteria DNA Kit) của ANABIO research and development:
Bước 1: Hút 20l Proteinase K cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng.
Thêm 150l dịch chứa mẫu vi khuẩn/ nấm, hay huyết thanh, huyết tương, dịch
cơ thể…
Bước 2: Thêm 250l Binding Buffer. Trộn đều bằng cách pipet lên
xuống 10 lần hoặc vortex 10-15 giây. Ủ mẫu ở 700C trong 15 phút.
Bước 3: Thêm 150l Ethanol 960. Vortex mẫu 10 – 15 giây hoặc pipet
lên xuống 3-5 lần.
Bước 4: Chuyển mẫu ở bước 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin
column) đặt trên ống thu dịch CT01 (ANAPURE collection tube).

24


Bước 5: Ly tâm cột lọc - ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12.000
rpm trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.
Bước 6: Thêm 500l Washing Buffer 1 vào cột lọc SC01, lặp lại thí
nghiệm ở bước 5.
Bước 7: Thêm 500 l Washing Buffer 2 vào cột lọc SC01. Ly tâm cột
lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 2 phút. Chú ý:
cần loại bỏ hoàn toàn WB2 vì WB2 ảnh hưởng tới việc chiết đẩy ADN.
Bước 8: Nhấc cột lọc SC01 chuyển sang ống thu mẫu eppendorf 1,5 ml
vô trùng mới.
Bước 9: Thêm 50-200 l Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc SC01.
Ly tâm cột lọc ống eppendorf ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 1 phút.
Bước 10: Thu dịch chảy qua cột chứa ADN trong ống eppendorf. Bảo
quản sản phẩm ADN tinh sạch ở -200C hoặc sử dụng ngay cho ứng dụng mong
muốn.
Kiểm tra chất lượng ADN là bước cần thiết trong quy trình tách chiết

AND, ADN tinh sạch theo phương pháp cột lọc được phân tích bằng cách điện
di trên Gel agarose 1% (100V -30 phút), nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng
ánh sáng UV.
ADN sau khi tinh sạch xong sẽ được sử dụng ngay hoặc được lưu trữ ở
nhiệt độ -200C.
 Các phương pháp sinh học phân tử
Các sản phẩn sau khi được tách bằng Kit, gen 16S rRNA được khuếch
đại bằng phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt như Bảng 2. Hai
đoạn mồi PCR đươc thiết kế để khuếch đại đoạn khoảng 1500bp của gen 16S
rRNA là: mồi xuôi 27F (5’ – AGAGTTTGATAMTGGCTCAG - 3’) và mồi
ngược 1527R (5’ – AAAGGAGGTGATCCAGCC - 3’) được cung cấp bởi
Enzynomics. Độ đặc hiệu và hiệu quả của cặp mồi này được nghiên cứu và thử
nghiệm với nhiều loài vi khuẩn và mẫu môi trường, cho thấy cặp mồi này rất
25


hữu ích cho khuếch đại gen 16S rRNA trong nghiên cứu về sinh thái vi sinh
vật.
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1% có bổ sung
thuốc nhuộm EtBr, hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Sau đó quan sát và chụp
trên máy soi Gel UVP (UK).
Bảng 2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA
Thành phần

Thể tích (µl)

Nước cất

15,75

dNTP mix

2,5

Chu trình nhiệt

1. 95oC: 10 phút
2. 94oC: 30 giây

10x Buffer

2,5

27F – 10pmol

1

1527R – 10pmol

1

Enzyme mix (Taq polymerase)

0,25

3. 72oC: 5 phút

DNA khuôn

2.0

4. 4oC : ∞

Tổng

25

60oC: 30 giây
72oC: 1 phút 30 giây
 Lặp lại 30 chu kỳ

 Giải trình tự và định danh vi khuẩn
Các mẫu ADN tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự. Các trình
tự ADN sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas và DNA club, sau đó
so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng
chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương
đồng tương ứng, tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả
BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho
phân tích phát sinh chủng loại.
2.2.4. Xác định hoạt tính probiotics của các chủng vi khuẩn:
2.2.4.1.
Khả năng sinh trưởng
Điều kiện nuôi cấy: nuôi lắc trong bình kỵ khí, trong môi trường
MRSB, nhiệt độ 370C, 200 vòng/phút.

26


-

Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫu bằng máy đo OD (bước sóng

620nm) và vẽ đường cong sinh trưởng tại các khoảng thời gian.
2.2.4.2.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Khả năng sinh axid lactic

Xác định độ chua Therner:
-

Sau khi cấy vi khuẩn vào môi trường MRSB mang đi nuôi lắc ở

37oC ở 200 vòng/ phút.
Lấy 10ml dịch nuôi lắc đã li tâm cho vào cốc thủy tinh, bổ sung
thêm 20ml nước cất và 1 - 2 giọt Phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o).
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền
trong 30s thì dừng lại.
-

Ghi lại thể tích NaOH đã dung để chuẩn độ.
Độ axit tính theo độ Therner
o

T = VNaOH tiêu tốn x 10

% acit lactic = oT x 0.009
Trong đó:

T: độ Therner

o

1 oT = 9mg acid lactic
2.2.4.3.


Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Khả năng chịu muối mật

Môi trường muối mật:
Nuối cấy trên 2 điều kiện muối mật là 3% và 0.3%.
Muối mật 0.3%

Muối mật 3%

Bổ sung vào môi trường -

-

Bổ sung vào môi trường MRSB:

MRSB: 3g muối mật vào 1L môi 30g muối mật vào 1L môi trường
trường


Phương pháp thực hiện:
- Nuôi lắc vi khuẩn ở 37oC, 200 vòng, trong 24 giờ, sau đó cho vào 2 môi

trường với nồng độ muối mật 0.3% và 3%.

- Đo OD ở lúc 0 giờ và sau 4 giờ bằng cách tra dịch vào bảng 96 giếng và
đo OD. [9, 10, 13]
27


- Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.2.4.4.
Khả năng chịu acid
- Sau khi nuôi lắc qua đêm ở 370C trong môi trường MRSB,
- Chuyển 100 mL dịch nuôi lắc vào bình tam giác chứa 10mL MRSB có
pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và 6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M)
- Tra vào bảng 96 giếng và đo OD tại 0 giờ và 3 giờ. [9, 10, 13]
- Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.2.4.5.
Khả năng sinh H2O2
- Các mẫu lactobacilli phân lập được sẽ được nuôi cấy trong môi trường
thạch MRS có bổ sung thêm 250µg/mL 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (SigmaAldrich, USA) và 0,01 mg/mL horse radish peroxidase (Sigma-Aldrich, USA).
- Với các chủng kỵ khí, nuôi trong bình kỵ khí ở 370, 48 giờ, sau đó bỏ ra
ngoài hiếu khí 30 phút. Đối với các chủng hiếu khí, nuôi trong tủ 370 ở 48 giờ
sau đó cho vào tủ lạnh.
- Quan sát màu sắc.
- Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Cường độ màu phân loại được giúp xác định khả năng sinh H2O2 [9, 10, 19]
Bảng 3: Kí hiệu thể hiện cường độ màu và khả năng sinh H2O2.
+++

Sinh ra lượng lớn H2O2 (xanh dương nhiều, đậm)

++

Sinh ra lượng trung bình H2O2 (xanh dương đậm)

+

Sinh ra ít H2O2 (xanh dương nhạt)

-

Không sinh H2O2 (màu giữ nguyên)

28


- Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn đã nuôi lắc bổ sung vào 700l MRSB
trong các ống eppendorf (2ml hoặc 1.5ml) đã khử trùng và ủ trong điều kiện
tĩnh ở 370C.
- Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh
giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ
quang học ở bước sóng 620 nm trong dịch nuôi cấy vi khuẩn.
- Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật
+ Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng.
+ Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh
1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng
nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết
tinh.
+ Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành
eppendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70 0. Mật độ tế bào trong màng sinh
vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm.
So sánh sinh khối tế bào ở 2 chế độ nuôi lắc và nuôi tĩnh:

2.3.

 Chuẩn bị môi trường MRSB đã khử trùng, sau đó cấy các chủng vi khuẩn
(với cùng lượng OD đầu vào) vào môi trường và để ở 2 điều kiện trong 24 giờ:
- Điều kiện 1: Vi khuẩn nuôi kỵ khí trong điều kiện tĩnh không lắc, ở 37oC.
- Điều kiện 2: Vi khuẩn được nuôi kỵ khí trong điều kiện lắc 200 vòng/
phút ở 37oC.
 Đo OD bước sóng 620nm sau 24 giờ ở các điều kiện và nhận xét sự chênh
lệch.
 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4. Khảo sát khả năng phát triển ở các nhiệt độ:
 Chuẩn bị môi trường MRSB đã khử trùng, sau đó cấy các chủng vi khuẩn
(với cùng lượng OD đầu vào). Mỗi bình môi trường của một chủng được nuôi
cấy ở 1 nhiệt độ.
 Các nhiệt độ sử dụng trong thí nghiệm là 25oC, 30oC, 37oC, 45oC và
50oC.
30