Tối ưu hóa quá trỡnh tỏch chiết catechins trong là chố tỉa và ứng dụng trong nuụi cấy mụ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Tối ưu hóa quá trình tách chiết catechins trong là chè tỉa
và ứng dụng trong nuôi cấy mô”

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Lại Thị Ngọc Hà

Sinh viên thực hiện
Msv
Lớp

TS. Đinh Trường Sơn
: Đặng Thị Tươi
: 580964
: K58_CNSHA

HÀ NỘI, 26/12


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này
là trung thực và chưa sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng năm 2016

Sinh viên

Đặng Thị Tươi

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các tập thể, cá nhân trong và ngoài trường.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới T.S. Lại Thị Ngọc Hà, giảng
viên bộ môn Hóa sinh - Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã dành nhiều thời gian và tâm huyết, tận tình hướng
dẫn chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn trân
trọng của tôi tới T.S. Đinh Trường Sơn, bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa
Công nghệ sinh học người đã tận tình và kiên nhẫn giảng giải, hướng dẫn và tận tình
theo sát tôi trong các bước thực hiện nuôi cấy mô cũng như một số vấn đề còn chưa rõ
thầy đã giải đáp giúp cho tôi hiểu rõ vấn đề hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm, khoa Công
nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam và tôi cũng xin cảm ơn chị Trần Thị
Hoài làm việc tại Phòng thí nghiệm bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm
và Phòng thí nghiệm trung tâm, Khoa công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp
Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp
và luôn chỉ dạy tôi trong việc chạy thiết bị HPLC.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn Hà Thị Thùy CNTPB-K58 và các bạn
trong nhóm thực tập khóa luận cùng tập thể lớp CNSHA – K58 đã nhiệt tình giúp đỡ

tôi trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2016
Sinh Viên

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................................................................... ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
C

(+) – Catechin

EC

(-) - epicatechin

ECG

(-) - epicatechin gallate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EGC

(-) - epigallocatechin

EGCG

(-) - Epigallocatechin gallate

EU

Liên minh Châu Âu

Euro

Đồng tiền chung Châu Âu

HPLC

High performance liquid phase

CK

Chất khô

CT

Công thức

Đvt

Đơn vị tính

SD

Standard Deviation

TB

Trung bình

iii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Diễn biến diện tích, sản lượng chè thế giới giai đoạn 1999-2008
(FAO, 2011)......................................................Error: Reference source not found
Bảng 2.2. Kim ngạch xuất khẩu chè Việt Nam sang EU một số thị trường lớn
2012 – 2014 [16]...............................................Error: Reference source not found
Bảng 2.3. Thành phần hóa học của lá chè [22]..........Error: Reference source not
found
Bảng 2.4. Hàm lượng của các dạng catechins trong lá chè [22]. .Error: Reference
source not found
Bảng 2.5. Thành phần pha chế các môi trường MS....Error: Reference source not
found
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm......................Error: Reference source not found
Bảng 3.2. Thời gian cung cấp dung môi khi phân tích mẫu bằng HPLC......Error:
Reference source not found

Bảng 3.3. Các đường cong chuẩn catechins và caffeine...Error: Reference source
not found
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình tách chiết catechins
..........................................................................Error: Reference source not found
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình tách chiết catechins...26
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của yếu tố nồng độ đến quá trình tách chiết catechins
..........................................................................Error: Reference source not found
Bảng 4.4. Các mức thí nghiệm.........................Error: Reference source not found
Bảng 4.5. Ma trận thực nghiệm.......................Error: Reference source not found
Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm với biến thực.....Error: Reference source
not found
Bảng 4.7.Tổng hợp phân tích mô hình.............Error: Reference source not found

iv


Bảng 4.8. Kết quả thí nghiệm kiểm tra mô hình.........Error: Reference source not
found
Bảng 4.9. Kết quả nuôi cấy mô bạch đàn khi bổ sung catechins..Error: Reference
source not found
Bảng 4.10. Kết quả nuôi cấy mô lan hồ điệp khi bổ sung catechins.............Error:
Reference source not found

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cấu tạo catechin................................Error: Reference source not found
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của một số catechins [22]....Error: Reference source

not found
Hình 2.3. Cơ chế chống oxi hóa và các nhóm có chức năng chống oxi hóa của
polyphenol [22].................................................Error: Reference source not found
Hình 3.1. Giống chè Phúc Vân Tiên.................Error: Reference source not found
Hình 3.2. Nồi hấp và thiết bị sấy khô nhiệt......Error: Reference source not found
Hình 3.3. Sơ đồ chiết catechins từ bột chè.......Error: Reference source not found
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn cactehins và caffeine ở nhiệt độ
..........................................................................Error: Reference source not found
50 µg/ ml...........................................................Error: Reference source not found
Hình 4.1. Kết quả dự báo hàm mục tiêu EGCG và catechin tổng số............Error:
Reference source not found
Hình 4.2. Bột catchines thu được sau trích ly.. .Error: Reference source not found

vi


PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis Lindl O.Kuntze, trong tiếng
Latinh sinensis có nghĩa là “Trung Quốc”. Chè thuộc ngành hạt kín (Angiospermae),
lớp hai lá mầm (Dicotyledonae), bộ chè (Theales), họ chè (Theaceae), chi chè (
Camellia), loài Camellia sinensis. Trong những năm gần đây, nhờ áp dụng các phương
pháp nghiên cứu khoa học hiện đại đã tìm thấy rằng tác dụng sinh học của nước chiết
lá chè chủ yếu là do các polyphenol, trong đó quan trọng và chủ yếu là các dẫn xuất
của catechins. Tác dụng sinh học của hợp chất polyphenol từ lá chè xanh được giải
thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất
chống oxi hóa. Các gốc tự do được sinh ra và tích lũy trong quá trình sống, chính là
nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hóa cơ thể con người.
Ngày nay, các nghiên cứu khoa học đã tìm thấy tác dụng của catechins từ chè ở mức
độ khác nhau đối với bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường

ruột, bệnh răng miệng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, giảm béo, tăng tuổi
thọ. Catechins từ chè còn được sử dụng có hiệu quả và an toàn trong công nghiệp thực
để thay thế các chất chống oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ có hại. Ngoài ra,
catechins còn được sử dụng trong công nghiệp nhẹ như công nghiệp hóa mỹ phẩm…
Nhờ các tác dụng quý giá như trên các catechins từ lá chè có giá trị cao trên thị trường
hiện nay. Chè xanh đã trở thành nguyên liệu quan trọng đẻ chế biến nhiều loại thức ăn,
đồ uống khác nhau ở rất nhiều quốc gia trên thế giới. Các loại bánh kem chè xanh,
bánh gato, kem chè xanh, thạch chè xanh,… Đặc biệt polyphenol chiết xuất từ chè
xanh ngày càng được sử dụng rộng rãi, thường xuyên nhằm mục đích chữa bệnh và
được bổ sung trong thực phẩm chức năng. Hiện nay để sản xuất chè khô mới chỉ sử
dụng chè búp và lá chè non, còn lại lượng rất lớn lá chè già hiện còn bị bỏ phí, làm cho
hiệu quả canh tác cây chè vẫn còn thấp. Thêm vào đó, hàng năm, một lượng chè tỉa bị
bỏ đi khi cây chè bị đốn bỏ để hạ thấp chiều cao vào cuối năm. Ngoài ra, ở các nhà
máy chè trong quá trình sản xuất còn tạo ra một lượng lớn chè phế phẩm đó là chè
xanh vụn có giá trị sử dụng thấp. Như vậy, chè già trên ruộng và chè không đạt tiêu

1


chuẩn ở các nhà máy là một nguồn nguyên liệu lớn có thể khai thác catechins có giá trị
sinh học cao được sử dụng làm thuốc, phụ gia thực phẩm hoặc bổ sung trong thực
phẩm chức năng…
Cho đến nay, việc khai thác catechins từ lá chè xanh đã đang được nghiên cứu
theo các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên đến nay phương pháp trích ly catechins có
sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện đại tại Việt Nam vẫn tỏ ra chưa phù hợp do vốn đầu tư
lớn và mới chỉ dừng ở phạm vi nghiên cứu. Bên cạnh đó việc khai thác catechins từ
chè xanh theo phương pháp trích ly thông thường vẫn tỏ ra chưa đem lại hiệu quả kinh
tế cao do giá thành chế phẩm catechins còn cao, độ tinh khiết của chế phẩm chưa tốt.
Việc tìm ra những phương pháp trích ly mới hay đi sâu vào nghiên cứu các yếu
tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly từ một phương pháp cụ thể sẽ góp phần năng cao

khả năng và hiệu quả trích ly các hợp chất catechins trong chè. Do thời gian và điều
kiện thí nghiệm, trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến ảnh khảo sát ảnh hưởng của các
yếu tố nhiệt độ, thời gian, nhiệt độ ethanol đến quá trình tách chiết catechins từ lá chè
và tối ưu hóa quá trình. Tiếp đến, đề tài thực hiện khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung
catechins tách chiết từ lá chè vào môi trường nuôi cấy lan hồ điệp và bạch đàn.
1.2. Mục tiêu, yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục tiêu
- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố của nhiệt độ, thời gian, nồng độ ethanol
đến kết quả trích ly catechins trong lá chè. Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách
chiết với ba yếu tố tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian.
- Khảo sát ảnh hưởng của bột chiết catechins từ lá trà đến môi trường nuôi cấy
mô lan hồ điệp và bạch đàn.
1.2.2. Yêu cầu
Đánh giá được ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, thời gian, nồng độ ethanol
đến quá trình chiết catechins trong lá chè tỉa.
Đưa ra được mô hình hóa quá trình chiết catechins trong lá chè tỉa và điều kiện
tối ưu cho quá trình tách chiết.
Sử dụng bột chiết catechins từ chè để đánh giá tách động của catechins lên môi
trường nuôi cấy lan hồ điệp và bạch đàn
PHẦN THỨ 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về chè
2.1.1. Đặc điểm thực vật và sự phân bố của cây chè

2


Tên khoa học: Camellia sinensis (L) O.Kuntze. Chè được xếp trong phân loại thực
vật như sau: Ngành hạt kín (Angiospermatophyta), lớp Ngọa Lan (Magnoliopsida), bộ
chè Theales, họ chè Theaceae và chi chè Camellia [2].
Cây chè sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm 3 loại:

thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ). Cành chè do mầm sinh dưỡng phát triển thành,
trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi từ 1 – 10 cm. Đốt chè dài là biểu hiện
giống chè có năng suất cao. Lá chè mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng
và kích thước thay đổi tùy giống. Lá chè mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình
dạng và kích thước thay đổi tùy giống. Lá chè có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa. Búp
chè là giai đoạn của một cành chè, gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2
hoặc 3 lá non. Kích thước của búp chè thay đổi tùy giống và kỹ thuật canh tác. Cây
chè sau khi sinh trưởng 2-3 tuổi bắt đầu ra hoa, mọc từ chồi sinh thực ở nách lá [6].
Về phân loại thực vật hiện nay, có 23 chi và 380 loài, tuy nhiên để dễ phân loại
người ta chia làm 2 giống chè chính [3]:
Giống chè Ấn Độ (Camellia sinensis Var. assamica):
Đặc điểm: cây thuộc loại độc thân, lá to dài tới 20-30 cm, mỏng, mềm, thường có
màu xanh đậm, dáng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài. Có trung bình 1215 đôi gân lá, rất ít hoa quả, không chịu được rét, hạn, năng suất, phẩm chất tốt. Có
hàm lượng tanin lớn phù hợp cho sản xuất chè đen [3].
Giống chè Trung Quốc (Camellia sinensis Var. sinensis):
Đặc điểm: lá nhỏ cứng, dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, lá dài từ 3,5 – 6,5 cm.
Có 6 -7 đôi gân lá không rõ, răng cưa nhỏ, không đều. Búp nhỏ, hoa nhiều, năng suất
thấp, phẩm chất bình thường. Có thể chịu rét ở nhiệt độ -12°C đến -15°C. Tanin không
cao nên thích hợp cho sản xuất chè xanh [4].
Chè cho năng suất không cao vào mùa mưa từ tháng 5 – tháng 11, sau 10 -15 ngày
thì thu hoạch 1 lần. Nguyên liệu sử dụng trong công nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm
và 2 -3 lá non [2].
Về sự phân bố của cây chè, những vùng chè nguyên sản và vùng chè dại đều nằm
ở khu vực núi cao, có điều kiện sinh lý thái lý tưởng như Vân Nam ( Trung Quốc),
Assam (Ấn Độ), có độ cao trên 1500m so với mặt nước biển. Tại Việt Nam chè được

3


tìm thấy tại suối Giàng (Yên Bái), Cao Bồ (Hà Giang), Tam Đảo (Vĩnh Phúc) có độ

cao trên 1000m. Nói chung, chè được trồng nhiều tại vành đai á nhiệt đới, khu vực có
đặc điểm khí hậu ôn hòa, ẩm ướt, từ 33° vĩ Bắc đến 49° vĩ Nam. Trong đó, các vùng
chè ở giữa 16° vĩ Nam đến 20° vĩ Bắc là thích hợp nhất. Ở vùng này, chè có búp quanh
năm [4].
2.1.2. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam
2.1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới
Hiện nay có 58 quốc gia trồng chè. Tuy nhiên, chỉ có 20 nước là có khối lượng
chè xuất khẩu đáng kể. Những quốc gia có diện tích trồng chè lớn nhất là: Trung Quốc
1.086.200 ha (8.87% tổng diện tích chè trên thế giới), Indonesia 129.400 ha (4.78%),
Kenya (3.08%) (FAO, 2011). Về năng xuất chè, trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây,
năng suất bình quân của các nước sản suất chè tăng lên 48%. Đứng đầu là Ấn Độ 45%,
theo sau là Srilanka 55%, Trung Quốc 35%, Indonesia 31%.
Trong những thập kỉ qua, diện tích chè thế giới luôn có sự tăng trưởng mạnh mẽ.
Theo FAO (2011), tổng diện tích chè thế giới vào năm 1970 chỉ là 1.585.900 ha thì đến
năm 2002 đã lên tới 2.560.000 ha và đạt gần 2,9 triệu ha vào năm 2008. Bảng dưới đây
là diễn biến diện tích và sản lượng thế giới năm 1999 – 2008 (FAO, 2011)
Bảng 2.1. Diễn biến diện tích, sản lượng chè thế giới giai đoạn 1999-2008
(FAO, 2011)
Năm

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

1999

2383831

3077588

2002

2479097

3173842

2005

2714475

3627197

2008

2925155

3894029

4


2.1.2.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam
Hiện nay, sản phẩm chè Việt Nam đã có mặt trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ
, trong đó thương hiệu “CheViet” đã được đăng kí và bảo hộ tại 70 thị trường quốc gia
và khu vực. Việt Nam hiện là quốc gia đứng thứ 5 thế giới về sản lượng và xuất khẩu
chè, chỉ sau Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanca và Kenya.
Trong 10 năm qua, ngành chè Việt Nam đã có bước phát triển đáng chú ý về năng
suất, sản lượng và chế biến. Năm 2011, năng suất bình quân chè cả nước mới chỉ đạt 4,5
tấn/ha thì đến năm 2011 đã vượt qua ngưỡng 7,5 tấn/ha với 133.000 ha đất chuyên canh
chè. Số lượng các nhà máy chè chế biến chè cũng tăng nhanh, từ 230 nhà máy lên hơn 230

nhà máy với công suất chế biến tăng từ 3000 tấn/ngày lên 4600 tấn/ngày.
Năm 2013, cả nước có 135.500 ha chè, trong đó chè làm nguyên liệu cho chế
biến 128.200 ha, năng suất đạt 7,95 tấn búp tươi/ha. Việt Nam đã tiến hành rà soát quy
hoạch vùng sản xuất chè định hướng đến năm 2020 vào khoảng 140000 ha, trong đó
trồng mới khoảng 5000 ha, trồng thay thế bằng giống mới khoảng 30000 ha. Hiện các
tỉnh như Lâm Đồng, Nghệ An, Hà Nội, Thái Nguyên, Phú Thọ, Yên Bái, Sơn La đã
quy hoạch vùng sản xuất chè an toàn .
Nhìn chung các sản phẩm chè xuất chủ yếu vẫn là chè đen, chè xanh, chè ô
long, chè nhài,… với các thị trường chủ lực là Đài Loan, Trung Quốc, LB Nga,
Pakistan, Mỹ….
Bảng 2.2. Kim ngạch xuất khẩu chè Việt Nam sang EU một số thị trường lớn
2012 – 2014 [16].
Thị trường

2012

2013

2014

Pakistan

41,948

42,545

75,187

Đài Loan

27,397

28,626

29,311

Trung Quốc

17,877

17,853

16,003

Nga

20,013

17,825

17,381

Hoa Kỳ

8,304

10,871

10,682

EU

9,246

9,325

6,800

(Đvt: nghìn Euro)

5


2.1.3. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè
Bảng 2.3. Thành phần hóa học của lá chè [22].
Thành phần

Hàm lượng

Polyphenol
Methylxanthines
Aminoacids
Acid hữu cơ
Carotennoids
Volatiles
Carbonhydrate
Protein
Lignin
Lipids
Chlorophyll

Tro

(%CK)
36
3,5
4
1,5
<0,1
<0,1
25
15
6,5
2
0,5
5

Nước
Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè: nước có quan hệ đến quá trình biến
đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các men, là chất quan trọng không
thể thiếu được để duy trì sự sống của cây. Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy
theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái,… Trong
búp chè chè (tôm + 3 lá) hàm lượng nước thường có từ 75-82% . Để tránh khỏi sự hao
hụt những vật chất trong búp chè trong quá trình bảo quản và vận chuyển, phải cố
gắng tránh sự giảm bớt nước trong búp chè sau khi hái [9].
Các hợp chất tanin trong lá chè
Tanin là một trong những thành phần chủ yếu quyết định đến chất lượng
nguyên liệu cũng như chè thành phẩm. Nó chiếm khoảng 30% chất khô trong chè.
Tanin là hỗn hợp phức tạp của các hợp chất có đặc tính polyphenol, bao gồm các
catechin đơn giản và các dẫn xuất của chúng.
Nhìn chung, thành phần chủ yếu trong tanin chè là các hợp chất catechins

(chiếm khoảng 80%). Sự biến động của hàm lượng catechins trong chè là rất lớn. Nó
phụ thuộc vào vị trí lá trên cành, giống, tiêu chuẩn hái, thời điểm thu hái, điều kiện vĩ
độ, địa hình, kỹ thuật canh tác,…[9].

6


Polyphenol giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh lý của cây, nó tham gia
vào quá trình oxy hóa khử của cây. Trong y học, polyphenol được dùng để làm thuốc
cầm máu, tăng cường sức đề kháng của thành huyết quản trong cơ thể động vật, tăng
cường sự tích lũy và đồng hóa sinh tố C, kháng oxi hóa, kháng viêm và kháng ung
thư…
Alkaloid
Trong chè có nhiều loại alkaloid nhưng nhiều nhất là caffein. Hàm lượng caffein
trong lá chè lá từ 3 – 5% chất khô, đây là hợp có tác dụng sinh học quan trọng trong
chế biến chè và có khả năng kích thích thần kinh trung ương, tăng cường hoạt động hệ
thần kinh, kích thích hoạt động của thận và sự lưu thông máu. Nó có khả năng kết hợp
với tanin để tạo thành hợp thành hợp chất tanat cafein có hương vị dễ chịu [5].
Sự thay đổi hàm lượng caffein trong chè nguyên liệu phụ thuộc chủ yếu vào
giống, độ tuổi của lá, thời vụ thu hoạch và điều kiện canh tác…
Glucid
Glucid trong chè rất đa dạng, bao gồm các monosaccharid (chiếm khoảng 1 – 2%)
và các polysaccharid (chiếm 10 – 20%). Ở chè các dạng đường tan trong nước có hàm
lượng không nhiều, nhưng rất cần thiết. Các nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ cao do tác
dụng của các đường glucosse, fructose với amino acid và các chất chát trong chè, mà
chè có được các hương thơm đặc trưng như: mùi hoa hồng, quả chín, mật ong và mạch
nha [9]. Đây là kết quả các phản ứng Maillard giữa các aminoacid và đường khử.
Pectin là một trong những hợp chất glucid. Trong chè hàm lượng pectin không
nhiều, chiếm khoảng 2 – 3% hàm lượng chất khô, chè non hàm lượng pectin cao.
Pectin tan được trong nước và làm tăng độ nhớt, độ sánh của nước chè pha.

7


Protein và amino acid
Trong chè hàm lượng protein chiếm khoảng 16 – 25% chất khô, phân bố không
đều ở phần của búp chè và thay đổi tùy theo giống, thời vụ, điều kiện canh tác và một
số yếu tố khác. Ngày nay, tìm thấy trong chè còn có chứa khoảng 17 loại aminno acid,
trong đó glutamic acid có hàm lượng lớn hơn cả [5].
Chlorophyll
Hàm lượng chlorophyll trong lá chè thấp, từ 0,24 – 0,85% chất khô và thay đổi
tùy giống và độ non của nguyên liệu, lá non có hàm lượng thấp. Trong quá trình chế
biến, hàm lượng chất màu giảm mạnh vì chúng bị phân hủy, biến đổi do tác dụng của
nhiệt độ cao và enzyme thủy phân tương ứng, tạo cho sản phẩm chè mất mùi hăng ngái
khó chịu [11].
Chất tro
Hàm lượng chất tro trong chè vào khoảng 4 -6% chất khô và phụ thuộc vào
giống, độ non già của nguyên liệu, chè non có hàm lượng chất tro thấp hơn chè già.
Nghiên cứu về chất tro, người ta nhận thấy rằng, có một số nguyên tố liên quan đến
chất lượng của chè thành phẩm. Chè có chất lượng tốt thì hàm lượng K, P cao. Chè có
chất lượng xấu thì có hàm lượng Na, Mg, Ca cao [21].
Tinh dầu
Tinh dầu của chè được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của
cây và cả quá trình chế biến chè. Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong
lá chè tươi vào khoảng 0,007 – 0,009%, trong chè bán thành phẩm vào khoảng 0,024 –
0,025% [8].
Vitamin
Có nhiều loại vitamin trong chè. Chính vì vậy, giá trị dược liệu cũng như giá trị
dinh dưỡng của chè rất cao. Theo các tài liệu của Trung Quốc, hàm lượng một số
vitamin trong chè tính theo mg/1000g CK như sau: Vitamin A:54,6; B1: 0,70; B2:

12,20; PP: 47,0; C:27,0 vv… Đáng chú ý nhất là hàm lượng Vitamin C ở trong chè
nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4 lần [21].

8


Enzyme
Trong búp chè non có hầu hết các loại men, nhưng chủ yếu gồm hai nhóm
chính [21]:
Nhóm thủy phân: men amylase, glucoxidase, protease và một số men khác.
Nhóm oxy hóa khử: chủ yếu là hai loại men: peroxidase và polyphenoloxidase.
2.2. Giới thiệu chung về catechins
Catechins là nhóm hợp chất polyphenol thuộc họ flavonoid, có tính chống oxi
hóa mạnh nhất. Catechins được đặc trưng bởi cấu trúc C6-C3-C6. Catechin có nhiều
trong lá của cây trà. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy trong thực phẩm khác như
rược vang đỏ, socola, dâu, táo với lượng nhỏ.
Công thức phân tử C15H14O6
Công thức cấu tạo

Hình 2.1. Cấu tạo catechin
Catechins có 2 vòng benzen gọi là vòng A và vòng B, còn vòng C gọi là chất dị
vòng dihydropyran (dihydropyran heterocycle) trong đó mối nối carbon ở vị trí số 3.
Vòng benzen A giống phân nửa resorcinol, còn vòng B thì giống như phân nửa
catechol. Nơi phân tử carbon số 2 và 3 có 2 tâm không đối xứng, thế nên nó tạo ra 4
chất đồng phân không đối quang (diatereoisomers). Hai chất đồng phân (isomers) là
trans và cis. Cấu trúc trans gọi là catechin. Cấu trúc cis gọi là epicatechin.
Hầu hết đồng phân trans của catechin là có dấu cộng (+) –catechin. Những
đồng phân cis của lập thể khác (stereoisomer) là dấu trừ (-) –catechins hay cũng gọi là
epi-catechin. Đồng phân lập thể (stereoisomer) trong đó hợp chất tạo thành mà các

9


phân tử có cùng số và các loại nguyên tử về cách sắp xếp nhưng quan hệ trên bình diện
không gian thì khác nhau.
Họ catechin bao gồm: catechin (C), epicatechin (EC), gallocatechin (GC),
epigallocatechin (EGC). Chúng là những polyphenol có nguồn gốc từ thực vật và đóng
một vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người. “Epi “có nghĩa là có cùng một cấu
trúc như catechins nhưng các định hướng khác nhau nếu nhìn trong không gian 3 chiều
nên các tác dụng hóa học cùng khả năng oxi hóa cũng khác nhau. Những catechins
được oxi bởi enzyme polyphenol oxidase trong quá trình lên men chè trước hết hợp
thành một hợp chất trung gian gọi là orthoquinones, chất này rất hoạt động và kết hợp
thành cặp với theaflavins (TF), nó có phân tử lớn hơn và duy nhất trong hóa học.
EGC có hàm lượng thường bằng 10% tổng sản lượng của lá trà tươi được phơi
khô. Đó là gồm những lá trà non cho ta rất nhiều chất kể trên, kỹ thuật hái trà để có
catechins nhiều nhất là hái 2 lá từ búp và cả búp hơn là các lá thứ 3 và 4.
Trong việc trồng trà, nếu cây trà trồng trong bóng mát, bóng râm, không có ánh
sáng, thì con đường tổng hợp flavonoids trong đó có catechins coi như bị hạn chế và lá
chè có hàm lượng catechinns thấp, khoảng 10% của polyphenols.
Tóm lại, trong kỹ nghệ chế biến trà, từ cái vị của trà, mùi của trà, màu sắc của
nước trà tất cả đều có liên quan trực tiếp hay gián tiếp với sự đổi thay của catechins.
Bảng 2.4. Hàm lượng của các dạng catechins trong lá chè [22]
Thành phần
Epicatechin (EC)
Epigallocatechin (EGC)
Epicatechin gallate (ECG)
Epigallocatechin gallate (EGCG)
Catechin (C)
Gallocatechin (GC)

Hàm lượng (%CK)
1-3
3-6
3-6
8-12
1-2
3-4

10


Hình 2.2. Công thức cấu tạo của một số catechins [22].
Trong cây chè, polyphenol là thành phần hóa học chủ yếu, chiếm khoảng 30%
khối lượng chất khô với các hợp chất catechins là chủ đạo [21]. Chúng có vai trò quyết
định với chất lượng cảm quan và dược lý của chè, hàm lượng của chúng giảm dần theo
độ già của búp và lá như sau:
Trong đọt (tôm) và lá non 1: 30-32%, lá non 2: 25-28%, lá non 3: 20-22%, lá
non 4: 16-18%, lá già: 10-13%, cuộng chè: 15%
2.2.2. Vai trò sinh học của catechin
2.2.2.1. Hoạt tính kháng oxy hóa
Khi thực hiện khảo sát khả năng quét gốc tự do tổng hợp như DPPH, ABTS…,
các polyphenol - catechin thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hóa
đối chứng như vitamin C, vitamin E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn
từ 3 đến 6 lần). Trong nghiên cứu của Mai Tuyên, Vũ Bích Lan và Ngô Đại Quang về
hoạt tính chống oxi hóa của polyphenol chiết xuất từ lá chè xanh dể bảo quản dầu cải
đã đưa ra kết luận: polyphenol chiết xuất từ lá chè xanh thứ phẩm có tác dụng kháng
oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn nhiều so với acid ascorbic và tocopherol . Trong các
hợp chất catechin thì epigallocatechin (EGCG) và epicatechin (ECG) có hoạt tính vượt
trội hơn. Sự khác biệt này được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl
trong công thức cấu tạo, những gốc có chức năng chống oxy hóa là gốc ortho-3,4-

11


dihydroxyl (catechol), hoặc các vị trí 3,4,5-trihydroxyl (gallate) của vòng B , nhóm
gallate ở vị trí C3 của vòng C, nhóm hydroxyl ở vị trí C5, C7 của vòng A.
Cơ chế chống oxy hóa của chè thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất
phenol. Thể hiện ở chỗ, chúng có khả năng vô hiệu hóa các gốc peroxyd, do đó nó có
thể cắt các mạch oxy hóa. Khi đó, các gốc phenol nhừng nguyên tử hydro của nhóm
hydro cho gốc peroxyd

Hình 2.3. Cơ chế chống oxi hóa và các nhóm có chức năng chống oxi hóa của
polyphenol [22].
Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng không có khả năng
sinh mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất ankylphenol
được tăng lên bằng cách hydroxyl hóa vào phân tử phenol, vì các hợp chất polyphenol
có hoạt tính tốt hơn monophenol.
2.2.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Các hợp chất
này được tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm trùng. Chúng đã được
nghiên cứu trên tế bào vi sinh vật và được cho là những hợp chất có tác dụng kháng
khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính của chúng là do khả năng tạo phức với

12


các protein tan ngoại biên và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn. Catechins là những
hợp chất flavonoid được nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt trong lá chè xanh.
Những năm vừa qua người ta thấy rằng trà xanh có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng
có chứa hợp chất của các chất catechin. Những hợp chất này đã ức chế Vibrio cholera

O1, Streptococcus mutans, Shiglla, và các vi khuẩn, các vi khuẩn khác [17].
2.2.2.3. Tác dụng dược lý của trà xanh
Về dược lý học, chè có vị đắng chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải khát,
lợi tiểu, định thần, làm cho con người thư thái, khỏi chóng mặt, bớt mụn nhọt và cảm
tả lỵ. Công nguyên. Do có caffein và theophyllin, chè là một chất kích thích não, tim
và hô hấp. Nó tăng cường sức làm việc trí óc và của cơ, làm tăng hô hấp, tăng cường
và điều hoà nhịp đập của tim [23].
Theo kết quả nghiên cứu hiện đại, polyphenol có tác dụng giảm lipid trong
máu, chống xơ vữa động mạch, tăng cường vi huyết quản, giảm lượng đường trong
máu, chống oxi hóa, chống phóng xạ, chống ung thu và đột biến tế bào [24].
2.2.4. Nghiên cứu về trích ly catechins chè
Quá trình trích ly phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố:
- Dung môi trích ly: Dung môi trích ly là các dung môi hòa tan được hợp chất
cần trích ly. Các polyphenol là các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng dung môi
phân cực như: nước, methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate …. Tuy nhiên, hiệu suất
trích ly cũng như hoạt tính chống oxy hóa của các polyphenol-catechin chè phụ thuộc
rất nhiều vào bản chất và nhiệt độ của dung môi [20].
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (thường dùng dung
môi hữu cơ) càng nhỏ thì hiệu quả trích ly càng cao. Tỷ lệ thường được sử dụng là
1:20 đến 1:30 cho nguyên liệu chè khô, 1:10 đến 1:20 cho nguyên liệu là chè tươi, tuy
nhiên sử dụng nhiều dung môi sẽ gây khó khăn cho các giai đoạn tiếp theo [8].
- Thời gian: Một số quy trình chỉ thực hiện trích ly dưới 30 phút. Tuy nhiên có
những nghiên cứu tiến hành trong khoảng 30-60 phút, hoặc kéo dài hơn 100 phút. Mặc
dù hiệu quả trích ly thường tăng theo thời gian, nhưng việc kéo dài thời gian trích ly
lại có điểm bất lợi về mặt theo thời gian, nhưng việc kéo dài thời gian trích ly lại có
điểm bất lợi về mặt năng lượng [8].

13

- Nhiệt độ: nhiệt độ cao làm tăng tốc độ vận tốc và hiệu quả của quá trình. Tuy nhiên
cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp, tránh làm oxi hóa catechins cần tách. Những nghiên
cứu về nhiệt độ trích ly catechins chè khác nhau, một số quy trình thực hiện ở nhiệt độ thấp
5-10°C hoặc 40-50°C nhưng cũng có những nghiên cứu lên tới 100°C [8].
- pH: Catechin rất không bền ở pH base, bền ở pH acid. Khi thực hiện trích ly ở
pH thấp sẽ tránh được hiện tượng oxi hóa polyphenol và tăng hiệu quả trích ly. Tuy
nhiên, cũng có nghiên cứu cho rằng ảnh hưởng pH không nhiều đến hiệu quả trích ly,
chỉ cần đảm bảo trích ly ở pH trung tính hoặc thấp hơn [14].
- Kích thước vật liệu: Qúa trình trích ly xảy ra chủ yếu do sự thẩm thấu và
khuếch tán nên kích thước và vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng lớn thì hiệu
quả trích ly càng cao. Tuy nhiên, kích thước và hình dạng của nguyên liệu sau khi làm
nhỏ cũng có giới hạn vì nếu chúng quá nhỏ sẽ bị lắng đọng, làm tắc các ống mao dẫn
hoặc bị dòng dung môi cuốn vào mixen làm cho dung dịch có nhiều cặn gây khó khăn
cho quá trình xử lý tiếp theo [8].
2.3. Tổng quan về môi trường nuôi cấy
Định nghĩa nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch bệnh các vi sinh vật, trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật invitro (trong ống
nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng
ruộng, gọi là nuôi cấy invivo.
Tùy theo đối tượng và mục đích nuôi cấy, để pha các loại môi trường đặc
hoặc lỏng với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi trường sử dụng phổ biến
hiện nay là môi trường MS (Murashige – Skoog) là một trong những loại môi trường
được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường MS thích
hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm. Đến nay có rất nhiều công thức cải
tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm
1962. Ở thí nghiệm nghiên cứu này tôi sử dụng các công thức MS1, MS2, MS3, MS4
với các thành phần như bảng sau:

14


Bảng 2.5. Thành phần pha chế các môi trường MS
MS
MS1

Thành phần - Hàm lượng
Cho 300ml nước cất và bình 500ml rồi thêm:
NH4NO3: 16,5g
KNO3: 19,0g
CaCl2.2H2O: 4,4g
MgSO4.7H2O: 3,7g
KH2PO4: 1,7g

MS2

(hòa tan, định mức đến 500ml và bảo quản ở 5°C)
Cho 60ml nước cất vào bình 100ml rồi thêm:
KI: 16,6mg
H3BO3:124mg
MnSO4.5H2O: 482mg
ZnSO4.7H2O: 172mg
Na2MoO4.2H2O: 5mg
CuSO4.5H2O: 0,5mg
CoCl2.6H2O: 0,5mg

MS3

(hòa tan, định mức đến 100ml và bảo quản ở 5°C)
Cho 60ml nước cất vào bình định mức 100ml sau đó thêm vào:
FeSO4.7H2O: 556mg
Na2EDTA: 746mg
Đun ở 60-70°C đến khi vàng chanh và mọi hóa chất tan. Định

MS4

mức đến 100ml bảo quản ở 5°C, bọc giấy bạc để che sáng.
Cho 60ml nước cất vào bình 100ml sau đó bổ sung thêm:
Myo-inositoe: 2000mg
Nicotinic axit: 10mg
Pyridoxine HCl: 10mg
Thiamine HCl: 2mg
Glycine: 40mg
Hòa tan và định mức đến 100ml chia ra các ống 5-10ml bảo

quản ở -20°C.
Các chất này sẽ được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy vì chúng có
đầy đủ các muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… tất cả các hóa chất đều tan, không

15


kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn làm giá đỡ thì không quá rắn, không quá mềm
để khi cấy mẫu vật dễ dàng. Tuy nhiên mẫu cấy và môi trường thường trở nên nâu
hoặc đen sau khi cấy, sau một thời gian mô thường chết. Sự sinh trưởng bị ảnh hưởng
nặng ở những loài có nồng độ tanin cao hoặc các hợp chất phenol như lan hồ điệp...

16

PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Hình 3.1. Giống chè Phúc Vân Tiên
Nguyên liệu lá chè già, chè đốn được thu hái còn tươi và tiến hành xử lý ngay
trong ngày thu hoạch tại Viện Khoa học Kỹ thuật nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc
tại Phú Thọ.Thời gian thu hái tầm cuối tháng 11. Sau khi loại bỏ các lá sâu bệnh, đem
hấp từ 4 – 5 phút tùy thuộc vào độ dày và độ già của lá. Ngay sau khi hấp, lá chè được
trải ra trên khay tre, làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ
80°C tới độ ẩm <8% , thời gian khoảng 1 giờ. Lá chè sau khi sấy được đưa tới phòng
thí nghiệm Khoa Công nghệ thực phẩm và tiến hành bước xử lý tiếp theo. Nghiền
nguyên liệu với máy nghiền có kích thước lỗ sàng <0,05 mm. Nguyên liệu sau khi
nghiền được bảo quản ở nhiệt độ 4°C để sử dụng cho phân tích HPLC.

Hình 3.2. Nồi hấp và thiết bị sấy khô nhiệt

17


Môi trường nuôi cấy mô với các thành phần MS1, MS2, MS3, MS4 được giới
thiệu ở bảng 2.5.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Từ ngày 18/6 đến ngày 20/08 thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Hóa sinh
– Công nghệ sinh học thực phẩm và Phòng thí nghiệm trung tâm, Khoa công nghệ
thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Từ ngày 1/9 đến ngày 30/12 thực hiện tại B209 phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ sinh học thực vật, Khoa công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Hóa chất
Ethanol tuyệt đối (hãng Merk, Đức), methanol (hãng Merk, Đức), acetonitrile
(hãng Merk, Đức), tetraacetic ethylenediamine acid (EDTA) dạng tinh thể, Vitamin C
(Ascorbic acid) dạng tinh thể, MS1, MS2, MS3,MS4, sucrose, agar.
Thiết bị
Cân phân tích điện tử AR2140 (d=0,0001g, Ohaus Crop-pine Brook, Mỹ), bể ổn
nhiệt (Schutzart DIN EN 60529 – IP 20, Đức), máy li tâm Mikro 220R (Hettich
zentrifugen, Đức), máy vortex, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, tủ nuôi cấy
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao High-performance liquid chromatography
(HPLC) Agilent 1260 của Agilent technology (Mỹ), bao gồm các bộ phận:
Hệ thống cung cấp dung môi (Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump VL)
Bộ khử khí (Degasser)
Đầu dò UV/VIS detector Variable wevelength
Hệ thống điều khiển và phân tích dữ liệu
Bộ đưa mẫu tự động – 1260 Infinity Standard Autosampler
Cột phân tích Phenomennex Kinetex C18 (Phenomennex, CA, Mỹ)
Dụng cụ
Pipet( 5ml, 10ml, 200µl, 1000µl), bình định mức (10ml, 25ml, 500ml), ống
eppendorf , ống falcon, ống nghiệm có nắp, ống đong, cốc đong, phễu lọc, bông và
vải lọc, bình nuôi cấy, kẹp, dao.

18