Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo từ glconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.14 MB, 40 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-------------------------------------
TRẦN THỊ HƯỜNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT
LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI
TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật
Hà Nội, 5/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-------------------------------------
TRẦN THỊ HƯỜNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI
TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn
ThS. Phạm Thị Kim Dung
Hà Nội, 5/2019
LỜI CẢM ƠN
Thành công là sự nỗ lực hết sức của bản thân và sự ủng hộ, giúp đỡ của
mọi người cho dù đó là trực tiếp hay gián tiếp, là ít hay nhiều.
Viện Nghiên Cứu Khoa học và Ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 là nơi em chọn để hoàn thành chương trình học, thực hiện nghiên cứu,
hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng
thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ glconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
Em xin gửi lời cảm ơn Th.S Phạm Thị Kim Dung, người đã tận tình
hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh-KTNN cùng các
thầy cô ở Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè thân yêu đã
chăm sóc và khích lệ em trong thời gian nghiên cứu.
Bài khóa luận tốt nghiệp của em còn rất nhiều thiếu sót, em rất mong
nhận được sự đóng góp, nhận xét, góp ý của quý thầy, cô và các bạn để bài
khóa luận của em hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Trần Thị Hường
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận tốt nghiệp với đề tài:
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac
Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo” đều là sự thật, là kết quả nghiên cứu của cá nhân em, không sao chép,
không trùng lặp với bất kì đề tài nào. Trong quá trình viết luận văn tốt nghiệp
em có tham khảo, trích dẫn một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự
hướng dẫn của Th.S. Phạm Thị Kim Dung.
Nếu đề tài có vấn đề gì em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
Hà Nội, Ngày 20 Tháng 05 Năm 2019
Sinh viên
Trần Thị Hường
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1
G.xylium
Gluconacetobacter xylinus
2
OD
Mật độ quang phổ
3
TDKD
Tác dụng kéo dài
4
VLC
Vật liệu cellulose
5
VNCKH&UD
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 2
5. Tính mới của đề tài ..................................................................................... 3
PHẦN NỘI DUNG .......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 4
1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ....................................... 4
1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus 4
1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri.................................................. 5
1.1.2.1. Công thức hoá học .............................................................................. 5
1.1.2.2. Tính chất hóa lý .................................................................................. 5
1.1.2.3. Độ ổn định ........................................................................................... 5
1.1.2.4. Hấp thụ ................................................................................................ 6
1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định .......................................................................... 6
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ......................... 6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................ 6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
........................................................................................................................... 7
2.1. Đối tượng ................................................................................................... 7
2.1.1. Đối tượng................................................................................................ 7
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu .................................................................. 7
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 8
2.1.3.1. Thiết bị ................................................................................................ 8
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 9
2.3.1. Bố trí thí nghiệm.................................................................................... 9
2.3.2. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 9
2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC .......................................... 11
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn ...................................................... 11
2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri .......................................................... 14
2.3.6. Pha dung dịch đệm .............................................................................. 14
2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac
Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ............................................ 15
2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu .............................................. 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 17
3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo .............................. 17
3.2. Màng tinh chế ......................................................................................... 18
3.3. Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri...................................... 18
3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac natri được giải phóng ra khỏi màng
......................................................................................................................... 18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 30
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 7
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 8
Bảng 2.3. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 8
Bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo .................... 10
Bảng 2.5. Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ
khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm .......................................................... 13
Bảng 3.1. Kết quả thu VLC .......................................................................... 17
Bảng 3.2. Giá tri OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại
các thời điểm khác nhau của VLC chưa ép nước ...................................... 20
Bảng 3.3. Giá trị OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại
các thời điểm khác nhau của VLC ép 50% nước ....................................... 21
Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép nước ở các môi
trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3). 24
Bảng 3.5: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% nước ở các môi
trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3). 25
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri ............................... 5
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô .................................... 10
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC ....................................................... 11
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm
......................................................................................................................... 13
Hình 2.4. Pha dung dịch đệm ........................................................................ 15
Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm .......................................... 16
Hình 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo....................... 17
Hình 3.2. Rung siêu âm ................................................................................. 18
Hình 3.3. Máy xác định lượng thuốc giải phóng ......................................... 19
Hình 3.4. Mẫu rút ra để đo quang phổ ......................................................... 19
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở
màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau
(n=3) ................................................................................................................ 22
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở
màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) .. 22
Hình 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các
thời điểm khác nhau đối với màng gạo chưa ép nước( % ) (n=3) ............... 26
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các
thời điểm khác nhau đối với màng gạo ép 50% nước( % ) (n=3) ................ 27
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau thời điểm
24 giờ đối với màng chưa ép và màng ép 50% nước (% ) (n=3).................. 28
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vật liệu cellulose (VLC) có giá thành thấp được tạo nên từ các nguyên
liệu dễ kiếm, rẻ và có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp.
VLC có cấu trúc hóa học rất giống cellulose thực vật nhưng có một số
tính chất hóa lí đặc biệt như: độ tinh sạch lớn, độ kết tinh và độ bền cơ học
cao, khả năng đàn hồi tốt, có thể phân hủy sinh học, tái chế, bề mặt tiếp xúc
lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt
tốt đặc biệt là khả năng cản khuẩn. Do tính chất tương đối đặc biệt như vậy mà
màng cellulose vi khuẩn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực các như: thực
phẩm, công nghiệp, mĩ phẩm và đặc biệt là y học [3, 4, 8].
Việc nghiên cứu và ứng dụng VLC trong nước đang được quan tâm và
đã có được một số thành tựu nhất định. VLC có tẩm dầu mù u được thử
nghiệm trên thỏ gây bỏng làm màng trị bỏng giúp vết thương mau lành và
ngăn sự nhiễm trùng đó là kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Y Dược
TP. Hồ Chí Minh. Ngoài ra, VLC còn được ứng dụng trong: phẫu thuật, ghép
mô, cơ quan [9].
Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm
không steroid. Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của
cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin,
prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình
viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu
cầu. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh [5].
Diclofenac Natri được đánh giá là có tác động giảm đau mạnh trong
những cơn đau từ trung bình cho đến trầm trọng, khi viêm do chấn thương, do
can thiệp phẫu thuật, thuốc nhanh chóng làm giảm chứng đau tự nhiên, đau do
vận động, và giảm phù nề do viêm và phù nề ở vết thương [5].
Tuy nhiên, khi dùng Diclofenac Natri cũng gây các tác dụng không
mong muốn như đau đầu, đau vùng thượng vị, chán ăn, khó tiêu, trướng bụng,
bồn chồn, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, gan tăng các transaminase, ù tai; thỉnh
thoảng có gặp trường hợp phù, dị ừng, đau bụng, chảy máu đường tiêu hóa,
1
làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, buồn ngủ, ngủ gật,
trầm cảm, mất ngủ, lo âu;…[1,2].
Do đó, với mục tiêu tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi
khuẩn thuộc chủng G. xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự
giải phóng thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác
dụng phụ, kháng lại tác động của acid và khả dụng sinh học của vật liệu
cellulose trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu
khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ
Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo và thu VLC tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi
trường môi trường nước vo gạo.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong sự giải phóng thuốc.
Nghiên cứu tiềm năng của môi trường nuôi cấy trong nước vo gạo.
Nghiên cứu ứng dụng của VLC nhằm khắc phục hạn chế của thuốc
Diclofenac Natri để mang lại lợi ích cho việc điều trị.
Đánh giá những ưu nhược điểm khả năng giải phóng thuốc của VLC
nạp thuốc Diclofenac Natri để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc
khác.
2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra hệ thống giải phóng Diclofenac Natri kéo dài từ màng cellulose
vi khuẩn.
5. Tính mới của đề tài
Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclfenac
Natric từ vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ
Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản
xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu cellulose nạp thuốc.
3
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus
Vật liệu cellulose là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, chủng
Gluconacetobacter xylinus. Vật liệu cellulose cấu tạo bởi những chuỗi polyme
β-1,4-glucopyranose mạch thẳng. Theo AJ. Brown (1886), vật liệu cellulose
gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết
hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy,
mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [12].
Vật liệu cellulose được tạo từ Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa
học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt
như: độ bền cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ
tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu,... Vì
vậy, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực
phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, môi trường, dầu mỏ, mỹ phẩm, da
nhân tạo, y học,...Vật liệu cellulose được sử dụng như hệ thống để phân phối
thuốc [3, 4, 8].
Ngoài ra, Vật liệu cellulose còn được ứng dụng làm màng băng vết
thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9].
Amin và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng vật liệu cellulose làm màng
bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy
vật liệu cellulose giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng
hiệu quả sử dụng của thuốc [11].
Ở Brazil, Vật liệu cellulose ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị
trường như một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thương [9].
Vật liệu cellulose được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với nhiều ứng
dụng và đang được nghiên cứu, sản xuất hàng loạt.
4
1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri
Diclofenac là một dẫn chất của acid 2-amino benzen acetic, có sinh khả
dụng thấp do kém nước (độ tan trong nước ở 25oc khoảng 0.06 mM) [17]. Vì
vậy dạng được dùng thường là muối của nó (có độ tan lớn hơn, ổn định hơn),
đặc biệt muối được sử dụng nhiều là muối Natri Diclofenac [5].
1.1.2.1. Công thức hoá học
Tên khoa học: [2- (2,6- dicloro anilino) phenyl] acetat natri.
Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2.
Khối lượng phân tử: 318,13 [5].
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri
1.1.2.2. Tính chất hóa lý
Diclofenac là một axit yếu, dạng tồn tại bột kết tinh hoặc tinh thể màu
trắng đến trắng hơi vàng.
Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong axit acetic,
thực tế không tan trong ether, hơi tan trong nước độ tan phụ thuộc vào pH,
nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trường hoà tan [5].
1.1.2.3. Độ ổn định
Trong cấu trúc phân tử, Natri Diclofenac có nhóm chức amin bậc hai dễ
bị oxy hoá, nhóm phenyl acetat dễ bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực
cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương
đối bền.
5
1.1.2.4. Hấp thụ
Diclofenac Natri được hấp thụ nhanh. Diclofenac Natri hấp thụ qua
đường tiêu hoá gần như là hoàn toàn, hấp thụ trong huyết tương đạt nồng độ
tối đa khoảng 1 đến 4 giờ sau khi uống. Diclofenac natri cũng được hấp thu
qua da và niêm mạc[5].
1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định
Natri Diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do có khả
năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian
gây đau, viêm, sốt. Diclofenac Natri có hoạt tính chống viêm mạnh hơn
aspirin, nhưng tương đương với indomethacin [5].
Diclofenac Natri chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp:
viêm khớp dạng thấp, viêm gân, viêm bao hoạt dịch,... với liều duy trì hàng
ngày khoảng 75 đến 100mg, chia 3 đến 4 lần. Với thuốc TDKD, chỉ cần uống 1
viên 75 mg, hoặc 100 mg trong một ngày, uống khi no [5].
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam đã và đang quan tâm đến việc nghiên cứu tạo VLC. Tuy
nhiên, các kết quả nghiên cứu VLC mới dừng lại ở bước đầu thí nghiệm.
Nghiên cứu VLC làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn còn là một hướng
nghiên cứu mới.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng màng cellulose
vi khuẩn trong hệ thống phân phối thuốc (năm 2014) [11]
Nghiên cứu của Wei B. Và CS (2011) màng cellulose vi khuẩn thu
được sau khi ngâm trong benzalkkonium chloride có khả năng giải phóng
thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và
tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus
và B. Subtilis [19].
6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
2.1.1. Đối tượng
Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter
Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
1
Diclofenac Natri dạng tinh khiết
Trung Quốc
2
Metanol
Trung Quốc
3
D-Glucose
Trung Quốc
4
Pepton
European Union
5
Amoni sunfat ((NH4)2SO4 )
Trung Quốc
6
Diamoni photphat (KH2PO4 )
Trung Quốc
7
Axit axetic
Việt Nam
8
Nước vo gạo
VNCKH&UD
9
vi khuẩn G. xylinum
Nhật Bản
10
NaOH
Việt Nam
11
HCL
Việt Nam
12
KCL
Việt Nam
13
H3PO4
Việt Nam
STT
7
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
2.1.3.1. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT
Thiết bị
1
Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ)
2
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)
3
Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA
4
Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
5
Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)
6
Bể ổn nhiệt 1013, bể rửa siêu âm TCP 280
7
Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)
8
Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)
9
Máy đo pH
10
Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu,...và nhiều thiết bị khác
2.1.3.2. Dụng cụ
Bảng 2.3. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT
Dụng cụ
1
Bình thủy tinh, bình tam giác
2
Bình định mức 100ml, 500ml, 1000ml, bình hút ẩm
3
Hộp nhựa, cốc thủy tinh, thước
4
Ống nghiệm
5
pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml
6
Gạc vô trùng, vải xô, giấy nhớ,… và nhiều dụng cụ khác.
8
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng-Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC.
Thí nghiệm 3: Tìm quang phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc
Diclofenac Natri.
Thí nghiệm 4: Xây Dựng đường chuẩn Diclofenac Natri.
Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac Natri trong 2 giờ.
Thí nghiệm 6: Tính tỉ lệ thuốc giải phóng thuốc Diclofenac Natri của
VLC nạp Diclofenac Natri ở các môi trường pH khác nhau.
Thí nghiệm 7: Tính tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC
nạp Diclofenac Natri ở độ dày khác nhau.
2.3.2. Chuẩn bị màng BC
Pha môi trường nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn được thể hiện ở
bảng 2.1 [13]
9
Bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo
STT
Thành phần
Khối lượng
1
Glucose
30g
2
Pepton
10g
3
Amoni sunfat ((NH4)2SO4 )
0,5g
4
Diamoni photphat (KH2PO4 )
0,3g
5
Axit axetic
2%
6
Nước vo gạo
1000ml
7
Dịch giống
10%
Qua bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấynước vo gạo ta có quá
trình tạo VLC được thể hiện ở hình 2.1:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Hấp khử trùng môi trường trong 113oC, 15 phút
Khử trùng môi trường bằng tia UV (15 phút)
Bổ Sung 10% Dịch Giống, 2% Acid Acetic
Ủ tĩnh trong buồng nuôi cấy tế bào khoảng 5 đến 14 ngày ở 28oC
Vật liệu cellulose thô
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô
10
2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC
Vật liệu cellulose thô
Rửa dưới vòi nước, ngâm trong NaOH 3% trong 24 giờ
đến 48giờ làm vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng độc tố ra
ngoài
Vật liệu cellulose có màu vàng nâu
Trung hòa bằng HCL 3% trong 24 giờ đến 48giờ
Vật liệu cellulose có màu trắng ngà, không mùi
Ngâm nước trong 24 giờ đến 48 giờ trung hòa hết acid
Vật liệu cellulose thô màu trắng, trong
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC
Kiểm tra đường glucose có trong màng (Đường D_glucose tác dụng với
thuốc Fehling tạo ra kết tủa nâu đổ). Vì vậy để kiểm tra sự có mặt của đường Dglcoso ta dung thuốc thử Fehling, xử lí hóa học.
Lấy dịch thử mỗi loại của màng và mẫu đối chứng_nước cất và dung dịch
D-glucose.
Cho mỗi loại dịch thử vào mỗi ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống
nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 đến 15phút.
Quan sát hiện tượng (kết tủa) xuất hiện trong mỗi ống nghiệm.
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương
pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử.
Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru-Nhật Bản), đo phổ vùng
tử ngoại và khả kiến. Máy gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh
sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm.
11
Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu
được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±
0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [3].
Pha dãy dung dịch Diclofenac Natri trong Metanol ở các nồng độ (mg/ml)
khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. Dùng máy đo quang phổ tử ngoại
UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của dung dịch Diclofenac Natri có
nồng độ 50% ở bước sóng 278nm (bước sóng tại đó dung dịch Diclofenac Natri
đạt cực đại (λmax) hấp thụ).
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bước sóng đã
lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch Metanol 900ml và xây dựng đường chuẩn
biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ thuốc Diclofenac Natri.
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac
Natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó:
y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax
x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.
Làm tương tự trên khảo sát phổ diclofenac natri và xây dựng khoảng
tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Diclofenac Natri trong môi trường pH
= 2; 4,5; 6,8 và 7,4.
Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc Diclofenac Natri thể hiện ở
bảng sau:
12
Bảng 2.5. Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 278nm
Nồng độ (mg/ml)
10
20
40
60
80
100
Giá trị
OD
278nm
Lần 1
0,116
0,21
0,49
0,66
0,95
1,169
Lần 2
0,116
0,25
0,46
0,76
0,94
1,173
(n=3)
Lần 3
0,119
0,23
0,46
0,68
0,96
1,171
0,117
0,23
0,47
0,7
0,94
1,171
± 0,04
± 0,006
± 0,001
Giá trị trung bình
± 0,013 ± 0,013 ± 0,013
Giá trị OD nm
Dựa vào bảng 2.2 dựng đồ thị biểu diễn, lập đường chuẩn Diclofenac
Natri bằng phần mềm Excel 2010, ta được hình 2.1, hình 2.2, hình 2.3
1,20
y = -0.1583+0.218x
R² = 0,9917
1,00
0,80
0,60
0,40
OD 278nm
0,20
0,00
10
20
30
40
50
60
STT Nồng độ dung dịch Diclofenac mg/ml
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm
Ta có phương trình đường chuẩn ở bước sóng 278nm sóng:
Y = 0,218x – 0,1583 (R2= 9917) (2)
Trong đó: x - nồng độ Diclofenac Natri (mg/ml).
y - giá trị OD tương ứng.
R2 là hệ số tương quan.
13
2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri
B1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
B2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC.
B3: Tiến hành nạp thuốc Diclofenac Natri trên 2 mẫu:
Mẫu 1: VLC có độ dày 0,5cm.
Mẫu 2:VLC có độ dày 1cm.
B4: VLC sau khi tinh chế cho vào sấy khô 50%, sau đó để vào bình tam
giác có chứa 100ml dung dịch Diclofenac 20%.
B5: Rút dịch ở các mẫu trong khoảng thời gian 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ và 2
giờ ta dùng máy quang phổ UV-Vis để đo giá trị OD của từng mẫu [9] [17].
B6: Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi tính giá trị OD trung bình cho
vào phương trình đường chuẩn để tính nồng độ của Diclofenac Natri hấp thụ qua
VLC được xác định theo công thức: mBC = mBC(2) – mBC(1) (1)
Trong đó: mBC là khối lượng thuốc được hấp thụ qua VLC, mBC(1) là
khối lượng của VLC lúc ban đầu, mBC(2) là khối lượng của VLC sau khi hấp
thụ thuốc.
2.3.6. Pha dung dịch đệm
Nghiên cứu sự giải phóng thuốc Diclofenac Natri từ chế phẩm trong 4
môi trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng là 2,0; 4,5; 6,8;7.4 [1]:
Pha dung dịch đệm có pH theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ
theo Dược điển Việt Nam [3].
Dung dịch đệm pH = 2,0: Hòa tan 6,57g aliclorid trong nước, thêm 119ml
dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu
chỉnh pH nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH).
Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphate trong
1.000ml nước; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH).
14
Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g
kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu
cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).
Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri
hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1.000 ml; đo pH và hiệu
chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).
Hình 2.4. Pha dung dịch đệm
2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri
nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo
Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][17]
Lấy màng cellulose vi khuẩn đã được nạp thuốc Diclofenac Natri với độ
dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5), mỗi loại lấy 4 mẫu cho vào các bình
chứa 900ml môi trường pH như trên.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ±
0,50C.Sau các khoảng thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ,
12 giờ, 24 giờ, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó.
Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ
sung lại 5ml dung dịch đệm tương ứng.
15
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung
bình.
Tỉ lệ giải phóng thuốc được tính theo công thức[17]:
R% =
x100%
Trong đó:
R: Tỉ lệ giải phóng thuốc; Ct: Nồng độ của dung dịch
Diclofenac Natri tại thời điểm t; V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị
pH khác nhau; V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào; n: Số lượng mẫu lấy ra từ
dung dịch giải phóng; m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các màng VLC.
Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm
2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu
Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2007 và
được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
Các thông số động học giải phóng thuốc được tính toán, xử lý bằng công
cụ DDSolver trong Excel [17].
16
