Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm, rạ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ KIM ANH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
CELLULOSE TRONG RƠM RẠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI - 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ KIM ANH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
CELLULOSE TRONG RƠM RẠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS Đinh Thị Kim
Nhung, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên
cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn
Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt
tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm cho em trong suốt thời gian em
tiến hành thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa
Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp cho em hoàn thành khóa
luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân,
những người đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình
học tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, Ngày 15 Tháng 04 Năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Anh


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả

những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn
không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công
trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em xin
phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Hà Nội, Ngày 15 Tháng 04 Năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Anh


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2
5. Đóng góp của đề tài....................................................................................... 3
NỘI DUNG....................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1. Tổng quan nguyên liệu .................................................................................. 4
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm, rạ ........................................................ 4
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm, rạ ................................................. 6
1.3. Thực tế nghiên cứu về phân giải cellulose trong rơm, rạ nhờ vi sinh vật 13
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống của vi khuẩn ................................... 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 18

2.2. Các loại môi trường................................................................................. 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
2.3.1. Ủ và lấy mẫu ......................................................................................... 19
2.3.2. Phân lập vi khuẩn từ các khối ủ ............................................................ 21
2.3.3. Đếm số lượng tế bào vi khuẩn sống trên đĩa thạch ............................... 21
2.3.4. Phương pháp cấy truyền tuyển chọn từng giống và bảo quản giống .... 22
2.3.5. Quan sát hình thái hiển vi các chủng vi khuẩn nghiên cứu .................. 22
2.3.6. Xác định khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn ............................ 23


2.3.7. Phương pháp thống kê toán học và xử lý số liệu .................................. 23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 24
3.1. Diễn thế sinh thái của VSV trong quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm,
rạ ...................................................................................................................... 24
3.2. Các chủng vi khuẩn phân lập được từ quá trình mùn hóa tự nhiên của
rơm, rạ ............................................................................................................. 27
3.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào phân
giải tốt cellulose .............................................................................................. 28
3.4. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại
bào tuyển chọn ................................................................................................ 29
3.6. Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi dưỡng của các chủng vi khuẩn
có khả năng phân giải cellulose trong rơm, rạ ................................................ 32
3.7. Thử mùn hữu cơ được phân giải từ rơm, rạ nhờ các chủng vi khuẩn
trên cây trồng................................................................................................... 35
KẾT LUẬN .................................................................................................... 38
1. Kết luận ....................................................................................................... 38
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Giống vi khuẩn cấy trên môi trường thạch nghiêng ....................... 22
Hình 3.1. Rơm, rạ được ủ trong thùng xốp ..................................................... 24
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào với độ phóng đại x1000 của chủng V1
......................................................................................................................... 31
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn .. 32
Hình 3.6. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ ................................ 34
Hình 3.7. Trồng rau cải trên đất ruộng trộn mùn rơm, rạ ............................... 36
Hình 3.8. So sánh kích thước của cây rau cải sau khi trồng 13 ngày. ............ 37


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.2.1. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn .................................. 19
Bảng 2.2.2. Thành phần môi trường thử hoạt tính enzyme ngoại bào............ 19
Bảng 2.3. Tỉ lệ thành phần các khối ủ ............................................................. 20
Bảng 3.1. Sự thay đổi một số trạng thái rơm, rạ trong các khối ủ U1 và U2 ... 25
Bảng 3.2. Sự thay đổi độ mủn của rơm, rạ các khối ủ .................................... 26
Bảng 3.3. Vi khuẩn phân lập được trong 2 đợt phân lập các mẫu của khối ủ
(U1, U2) ............................................................................................................ 27
Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus tuyển
chọn ................................................................................................................. 28
Hình 3.2. Vòng hoạt tính của chủng vi khuẩn V1 môi trường bổ sung cơ chất
là bột giấy ........................................................................................................ 29
Hình 3.3. Vòng hoạt tính của chủng vi khuẩn V1 môi trường bổ sung cơ chất
là CMC ............................................................................................................ 29
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn V1..................................... 30
Bảng 3.6. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ ........................................ 33
Bảng 3.7.1. Thời gian sinh trưởng phát triển của cây rau cải. ........................ 35

DANH MỤC VIẾT TẮT

1.

BG

: Bột giấy

2.

CMC : Cacboxyl Methyl Cellulose

3.

Dd

: dung dịch

4.

g

: gram

5.

KL

: khuẩn lạc

6.

RBBR : Remazol Brilliant Blue R

7.

VSV

: Vi sinh vật

8.

ĐC

: Đối chứng

9.

TN

: Thí nghiệm

10. MT

: Môi trường


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Vấn đề thực phẩm bẩn, kém chất lượng đang là một vấn nạn được quan
tâm từ xã hội. Bởi vậy nhu cầu về một nguồn thực phẩm sạch, đảm bảo chất
lượng là một nhu cầu cần thiết và đáng được quan tâm đối với người tiêu dùng,
đặc biệt là vấn đề rau sạch.Vậy làm thế nào để có nguồn rau sạch đáp ứng nhu
cầu cho người tiêu dùng?
Chúng tôi nhận thấy một biện pháp hữu ích, tối ưu phù hợp với hoàn cảnh
hiện nay là các gia đình có thể tự cung tự cấp nguồn rau sạch tại gia. Để giải
quyết vấn đề trên chúng tôi thực hiện: nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn có khả năng sinh enzyme phân giải cellulose trong rơm, rạ nhằm hướng
tới giải pháp sử dụng nguồn mùn hữu cơ. Nguồn mùn hữu cơ này chủ yếu được ủ
từ rơm, rạ và lá khô.
Việt Nam là một quốc gia đang phát triển có số lượng dân số đông
95.554.355 người vào ngày 06/05/2018 theo số liệu mới nhất từ Liên Hợp
Quốc[16], trong số đó có trên 80% dân số sống bằng nghề nông nghiệp trồng lương
thực, thực phẩm... Ở nước ta lúa là cây lương thực chủ yếu và có vai trò ngày càng
quan trọng trong ngành xuất khẩu. Năm 2014 tổng diện tích lúa gieo trồng đạt hơn
7,8 triệu ha, năng suất đạt 57,4 tạ/ha sản lượng lúa đạt trên 44,84 triệu tấn như vậy
lượng rơm, rạ sau thu hoạch là rất lớn, khoảng gần 46 triệu tấn/năm. Sau khi thu
hoạch, bình quân 1 hecta thu được 6 tấn rơm, rạ trong đó bao gồm 51,5 kg N - 25,4
kg P2O5 - 137,4 kg K2O. Đa số bà con nông dân vẫn tiến hành đốt rơm, rạ sau thu
hoạch. Việc làm này không những làm mất đi các vi tố hữu cơ có ích mà còn gây
tổn hại đến môi trường. Theo tính toán, lượng CO2 phát thải vào môi trường do đốt
rơm, rạ tại Đồng bằng Sông Hồng là 1,2 đến 4,7 triệu tấn/năm, lượng khí nhà kính
phát thải vào môi trường do việc đốt rơm, rạ này gây thiệt hại về môi trường tương
đương với 19,05 - 200,3 trUSD/năm. Bên cạnh đó, việc lấy đi rơm, rạ khỏi đồng
ruộng đã làm giảm cacbon hữu cơ một cách đáng kể, nếu hàm lượng cacbon ban

1

đầu là 3,56%; sau 10 năm canh tác 2 vụ lúa/năm, hàm lượng cacbon chỉ còn 3,03%,
sau 50 năm là 1,59% và sau 100 năm là 0,71%, như vậy độ phì nhiêu cũng như hàm
lượng dinh dưỡng trong đất sẽ giảm đi rất nhiều[9].
Trên thế giới đã có nhiều quy trình ủ và chế phẩm sinh học để ủ rơm, rạ như:
chế phẩm sinh học Bokashi, chế phẩm E.M... còn ở Việt Nam có: chế phẩm Vixura,
chế phẩm sinh học BIMA (Trichoderma)... Như vậy nếu biết cách xử lý rơm, rạ
thành mùn hữu cơ sẽ tăng hàm lượng mùn cho đất, mùn hữu cơ có tác dụng kích
thích sự sinh trưởng của cây. Sử dụng sản phẩm mùn hữu cơ trong trồng trọt đặc biệt
đối với những nông phẩm trực tiếp làm thức ăn cho con người sẽ an toàn cho sức
khỏe của con người và giảm ô nhiễm môi trường. Bởi vậy, chúng tôi chọn đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
trong rơm, rạ”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose cao và
nghiên cứu được một số đặc tính sinh học bao gồm: đặc điểm hình thái, điều kiện
nuôi dưỡng, hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào, hoạt tính đối kháng của các
chủng vi khuẩn trên.
3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đặc tính sinh học và điều kiện môi trường nuôi dưỡng tối ưu của
một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm, rạ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình phân giải cellulose để nghiên cứu các
đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của một số chủng vi khuẩn khả năng phân
giải cellulose trong rơm, rạ. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung cho các
nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn trên trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình tạo mùn hữu cơ từ nguồn nguyên

2


liệu sẵn có ở Việt Nam.
5. Đóng góp của đề tài
Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn BacillusV1 có khả năng sinh enzyme phân
giải cellulose cao trong trong rơm, rạ. Phần lớn các chủng vi khuẩn phân lập được
có hoạt tính enzyme ngoại bào từ yếu đến trung bình, chỉ có khoảng 7,14% số
chủng phân lập được có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh, tập trung chủ yếu vào
các chủng có hoạt tính phân giải cellulose. Bước đầu đánh giá khả năng sinh trưởng
của cây rau cải trên mùn khối ủ rơm, rạ đã bổ sung vi sinh vật tuyển chọn.

3


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan nguyên liệu
1.1. Tổng quan về cellulose trong rơm, rạ
1.1.1. Thành phần các chất trong rơm, rạ
Nguồn cellulose trong rơm, rạ: Theo giáo sư tiến sĩ sinh học Nguyễn Lân
Dũng thành phần hóa học của rơm, rạ nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm
44%, hyđrô (H) chiếm 5%, oxy (O) chiếm 49% và nitơ (N) chiếm khoảng 0,92%;
một lượng rất nhỏ còn lại là phốtpho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K). Thành phần
chính của rơm, rạ tính theo khối lượng khô thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1. Thành phần hóa học của rơm, rạ
Các chất hóa học

Rơm, rạ (%)

Cellulose

34 - 38

Hemicellulose

32 - 40

Ligin

12

Protein

-

Tro

14 - 18

Tỷ lệ lignocellulose cao (78 - 90%) gây cản trở việc sử dụng rơm, rạ một
cách kinh tế. Trong thành phần lignocellulose trong rơm, rạ có cellulose, rất khó bị
phân hủy bởi hóa chất và vi sinh vật nhưng nếu sử dụng tập hợp các chủng vi khuẩn
phân giải thích hợp thì sẽ tạo thành nguồn phân hữu cơ sinh học tốt[1].
1.1.2. Tính chất và cấu trúc của cellulose
Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n, có phân tử khối rất lớn (khoảng
1.000.000 − 2.400.000 đến 1.000.000 − 2.400.000). Cellulose là một polime hợp
thành từ các mắt xích β-glucozơ nối với nhau bởi các liên kết β-1,4glicozit, phân tử
cellulose không phân nhánh, không xoắn. Mỗi mắt xích C6H10O5 có 3 nhóm OH tự
do.

4


1.1.3. Hiện trạng sử dụng rơm, rạ trên thế giới và ở Việt Nam
Rơm, rạ là phế phẩm chủ yếu của lúa gồm phần thân và gốc của cây lúa sau
khi tách hết phần hạt. Do đó, hàng năm lượng rơm, rạ sau mỗi vụ thu hoạch là rất
lớn. Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) cho biết, nếu
điều kiện sản xuất bình thường thì sản lượng lúa toàn cầu năm 2017 đạt 758,9 triệu
tấn, tăng 7 triệu tấn so với năm 2016. Trong đó, riêng khu vực châu Á đạt khoảng
trên 681 triệu tấn, chiếm 89% sản lượng toàn cầu. Việt Nam là quốc gia đứng thứ
hai về sản xuất lúa gạo sau Thái Lan. Sản lượng lúa của Việt Nam trong năm 2017
dự kiến đạt khoảng 43,5 triệu tấn, không đổi so với năm trước đó[15]. Theo ông Đỗ
Đức Tưởng (Tổ chức phát triển Hà Lan): mỗi năm Việt Nam sản xuất ra xấp xỉ 40
triệu tấn sinh khối từ phụ phẩm của lúa, bao gồm 32 triệu tấn rơm, rạ và 8 triệu tấn
trấu. Tổng năng lượng lý thuyết tiềm năng từ phụ phẩm của lúa tương đương 13,34
Mtoe (trong đó toe là đơn vị tính năng lượng lý quy đổi tương đương với 1 tấn dầu).
So với tổng tiêu thu năng lượng sơ cấp của Việt Nam năm 2010 là 47 Mtoe, thì
riêng rơm, rạ có thể đáp ứng được gần 28% nhu cầu. Tuy có nguồn sinh khối dồi
dào, nhưng thiếu sự quan tâm, do đó trong những năm gần đây, sau mỗi vụ thu
hoạch lúa, tại các đô thị lớn lại chứng kiến cảnh khói bay mịt mù từ những cánh
đồng ven đó. Nguyên nhân từ việc người nông dân đốt rơm, rạ bừa bãi và hiện
tượng này đang ngày càng phổ biến. Bên cạnh đó, khói tỏa ra từ những nơi đốt rơm,
rạ ảnh hưởng tới sức khỏe người dân trong khu vực và những vùng phụ cận làm
không khí ngột ngạt và gây ra hiện tượng khó thở. Không chỉ như vậy, việc này còn
ảnh hưởng tới con người và phương tiện tham gia giao thông trên nhiều tuyến
đường như: đường quốc lộ, đường liên huyện, liên xã… Khói mù mịt làm giảm tầm
nhìn của người tham gia giao thông và có nhiều vụ tai nạn thương tâm đã xảy ra
trong điều kiện như vậy. Thành phần của rơm, rạ là cellulose và hemicellulose và
một số hợp chất hữu cơ khác, khi đốt những chất này bị phân hủy tạo thành CO2,

gây ra ô nhiễm môi trường không khí. Trong đó, CO2 là một trong những chất khí
gây ra hiệu ứng nhà kính, nguyên nhân của việc làm cho Trái đất nóng lên. Hằng
năm, sau mỗi mùa vụ không biết bao nhiêu tấn CO2 được thải vào môi trường vì

5


nguyên nhân trên. Hiện nay, một phần nhỏ rơm, rạ được sử dụng làm phân bón sinh
học, còn lại chủ yếu là bị đốt bỏ ngay trên đồng ruộng gây ra lãng phí và ảnh hưởng
tới môi trường. Nếu biết tận dụng nguồn rơm, rạ này sẽ có ý nghĩa về nhiều mặt.
1.2. Hệ VSV phân giải cellulose trong rơm, rạ
Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng phong
phú bao gồm xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn.
1.2.1. Nấm
Một trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose mạnh nhất chính
là nấm. Chúng là những VSV thuộc nhóm không có diệp lục, sống hoại sinh ở trong
đất và có cơ chế hoại sinh độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc
hai đặc biệt. Chúng tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư
của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên
màu mỡ hơn[8].
Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh
tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hóa cellulose mà
mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzyme. Một số loài nấm là:
Alternaria tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei,
Fusarium solani, Penicillium pinophinum, Aspergillus niger...[7].
Các nấm ưa nhiệt cũng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn, chúng
sinh trưởng và phân giải cellulose nhanh nhưng hoạt tính cellulose của dịch lọc lại
thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulose tối ưu ở phạm vi pH
khoảng từ 3,5 - 6,6[8].
1.2.2. Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt có mặt ở khắp mọi nơi, tế bào đặc
trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất, gram dương và hiếu khí. Cellulose
của xạ khuẩn là enzyme ngoại bào[5]. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác
nhau về dinh dưỡng và nhiều nhóm xạ khuẩn đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các
môi trường có dịch chiết pepton, nấm men, dịch thuỷ phân casein thường thuận lợi
cho sinh trưởng của xạ khuẩn. Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay

6


phân chia tế bào bình thường. Bào tử của xạ khuẩn thường có hình bầu dục hay hình
cầu chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng
nhiệt của chúng. Khi thêm các nguyên tố vi lượng thì việc hình thành cuống bào tử
diễn ra mạnh hơn[8].
1.2.3. Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong rơm, rạ.
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và nhận thấy một
số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Vào những năm đầu thế kỷ XX
(1903) G.Van Iterson đã phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả
năng phân giải cellulose[8]. Một số vi khuẩn phân giải cellulose như: Clostridium,
Cellulosimicrobium

funkei,

Citrobacter

Methanobrevibacterruminatium,

freundii,

Ochrobactrum

Butyrivibrio
cytisi,

fibrisolvens,

Ochrombactrum

haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia,...Các loài này phần lớn thuộc
nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động
vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn[6], [12], [13].
Trong lòng đất cũng có các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose như
Bacillus Brevibacllus,… Đối với các loài ưa ấm thì pH và nhiệt độ tối ưa cho
enzyme cacbonmethyl cellulose của chúng hoạt động lần lượt là khoảng 5,5 và
55oC, còn đối với các loài ưa nhiệt thì pH là 5,0 và nhiệt độ là 75oC[11].
1.2.4. Sơ lƣợc về chủng vi khuẩn Bacillus
1.2.4.1. Phân loại
Bacillus thuộc:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillacease[17]

7


1.2.4.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
Bacillus là vi khuẩn gam dương tính và catalase dương tính, sử dụng khí
oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính

hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc
que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì
người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng
bất định và đang phát triển lan rộng.
Có một cách dễ dàng để cô lập một loại trực khuẩn nào đó là cho đất tốt vào
trong ống nghiệm cùng với nước, lắc đều, cho vào Mannitol salts agar đã tan, và giữ
ở nhiệt độ trong phòng ít nhất một ngày[17].
Vi khuẩn Bacillus sp. là trực khuẩn, ngắn, nhỏ, kích thước (3 - 5) x 0,6 µm,
Gram (+), nhiều khi tế bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào
đứng riêng rẽ. Bacillus sp. có khả năng di động, có 8 đến 12 lông, sinh bào tử hình
bầu dục, có kích thước từ 0,6 - 0,9 µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không
chính tâm, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 30oC - 35oC. Vi khuẩn Bacillus
sp. Có khả năng sinh một số enzyme như: α-amylase, protease, lipase,… và đặc biệt
có khả năng sinh tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B2)[14].
Vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng sản xuất rất nhiều các enzyme tiêu hóa
dựa vào nguồn cơ chất khác nhau, bao gồm các enzyme:
• Enzyme Amylase
Bacillus sp. có thể tổng hợp nên α-amylase. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột
và các sản phẩm chứa tinh bột sẽ bị thủy phân thành đường glucose. α-amylase của
B.subtilis và B.licheniformis phân giải tinh bột nguyên nhanh hơn 2 - 2,5 lần so với
bình thường.
• Enzyme Protease
Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết
peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là
các amino acid. Protease là enzyme quan trọng, cần thiết cho các sinh vật sống, rất

8

đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể vì protease có khả năng
phân hủy protein tạo thành acid amin giúp cho sinh vật dễ hấp thu hơn và tổng hợp
cấu trúc cơ thịt của vật nuôi.
• Enzyme Lipase
Lipase là enzyme tan được trong nước, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết
ester trong chất nền lipid không tan trong nước tạo thành glycerol và acid béo giúp
cho quá trình hấp thu chất béo tốt hơn. Lipase thực hiện chức năng cần thiết trong
quá trình vận chuyển, tiêu hóa và xử lý các chất béo của chế độ ăn như triglyceride,
dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống.
Vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis có khả năng tổng hợp các chất ức chế
ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Theo nghiên cứu của Vaseeharan và
Ramasamy (2003), vi khuẩn B.subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của vi
khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm. Các chất ức chế này có thể là
lyzozyme hoặc các enzyme ngoại bào.
Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện
khi bổ sung vi khuẩn có lợi, đặc biệt là sự bổ sung chế phẩm có chứa các
chủng Bacillus sp. vì Bacillus là vi khuẩn Gram (+) rất hiệu quả trong việc biến đổi
các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn Gram (-). Từ đó, làm giảm hàm lượng
chất hữu cơ và làm giảm các khí độc trong nước[14].
1.2.4.3. Đặc điểm hình thái học và phân bố trong tự nhiên
-Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm,
rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có
khoảng 106 - 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì
sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu
sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 - 79% vi
khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus
đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi
sinh học.

9


- Bacillus có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn cacbon trong khi
một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ
là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus
popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát
triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB).
- Năm 1993, giáo sư Richard Losik cùng cộng sự thuộc Đại học Havard ở
Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở
Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus có tập tính ăn thịt đồng
loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những
trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một
cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá
thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong,
giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh
những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng
cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng.
1.2.4.4. Hệ enzyme trong vi khuẩn
Vi khuẩn là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo, trong phân giải cơ chất
chúng có thể phân hủy các chất phức tạp thành các chất đơn giản, các cellulose từ vi
khuẩn thường có hoạt lực khá cao và khá phức tạp.
Các chủng vi khuẩn phân giải cellulose điển hình như: Pseudomonas,
Bacillus, Celloulomonas, Achromobacter,...Trong vi khuẩn có đầy đủ các enzyme
để phân giải các thành phần chính trong rơm, rạ và quan trọng nhất là chúng có
enzyme có hoạt tính tốt phân giải cellulose trong rơm, rạ. Gồm có[8]:
 Enzyme phân giải cellulose:
Liên kết chủ yếu trong của polysaccharide này cần có một hệ enzyme
cellulose với những tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ

enzyme cellulose của vi khuẩn, hệ enzyme thủy phân cellulose gồm 3 loại enzyme
sau:

10


(1) Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân các liên
kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose ở các điểm ngẫu nhiên bên trong
chuỗi polyme hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide
ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó
sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận.
(2) Exoglucanase bao gồm các 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3. 2. 1. 74), giải
phóng

D-glucose

từ

β-glucan

và

cellodextrin;

và

các

1,4-β-D-glucan

cellobiohydrolase (EC 3. 2. 1. 91), thủy phân D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của
enzyme cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của mạch cellulose.
(3) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3. 2. 1. 21) giải phóng phân tử
D-glucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.
Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp thức
ăn. Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao; chúng chỉ có tác dụng điều
hòa hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu và tăng cường
đào thải chất cặn bã. Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại và các động vật
nguyên sinh trong ruột mối là những vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân giải
cellulose. Ngoài ra, một số vi sinh vật đất cũng có khả năng này.
 Enzyme phân giải hemicellulose:
Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật. Enzyme
xylanase, thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật. Các vi sinh vật có
khả năng sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm chủ yếu là vi khuẩn. Do tính
không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thống enzyme phức tạp.
Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme cắt mạch chính không phân nhánh
(β-1,4-endoxylanse

và

β-xylosidase)

và

enzyme

cắt

mạch

nhánh

(α-

arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit
phenolic). Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành các
cấu tử đường của nó. Hệ thống các enzyme thủy phân xylan đa chức năng như vậy
khá phổ biến ở vi khuẩn.
 Enzyme phân giải lignin:

11


Lignin cấu trúc từ nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không ưa nước
do đó rất khó phân huỷ. Về cấu tạo, lignin gồm các mạch phenylpropanoid phức
tạp, cấu trúc không đồng nhất. Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ sinh học
lignin đòi hỏi hệ enzyme oxy hóa khử mạnh.
1.2.4.5. Đặc điểm nuôi cấy và khả năng sinh bào tử
 Đặc điểm nuôi cấy
- Vi khuẩn Bacillus phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát
triển được trong môi trường thiếu oxy. Thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ tối ưu
là 34oC - 37oC, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45oC - 75oC) hoặc ưa lạnh (5oC 25oC). Đa số vi khuẩn Bacillus sinh trưởng tốt ở pH=7, một số phù hợp với pH= 9 10 như Bacillus alcalophillus hoặc với pH= 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius.
- Vi khuẩn Bacillus phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ
bản:
+ Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng
tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 - 4 ngày
bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
+ Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm
đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy và khó tan khi
lắc đều.

+ Trên môi trường giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi
khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 - 4cm sau 72 giờ nuôi cấy.
- Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ
nguồn cacbon (như glucose) và nitơ (như peptone)[4].
 Bào tử
- Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học
cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành
phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử Bacillus ở dạng tự do không có quá

12


trình trao đổi chất, khi gặp điều khiện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh
dưỡng.
- Bào tử Bacillus có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x 1,0
- 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,
peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và
nhiều độc tố, vì vậy chúng có khả năng giữ ở trạng thái bào tử niều năm. Bào tử
không phải cơ quan sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ giống nòi, bào tử được tạo
ra để giúp các tế bào chịu được điều kiện bất lợi của môi trường. Đó là dạng nghỉ
của tế bào[10].
 Khả năng tạo bào tử:
Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào
đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng. Mỗi tế
bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành, các tế bào sinh dưỡng
sẽ tự giải phóng các bào tử. Các tế bào Bacillus đặc trưng là sinh bào tử mà vẫn giữ
hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn
Bacillus chỉ phình to một ít khi chứa bào tử. Tùy loại mà bào tử có thể nằm chính
tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào[10].

1.3. Thực tế nghiên cứu về phân giải cellulose trong rơm, rạ nhờ vi sinh vật
Hệ vi sinh vật phân giải cellulose trong rơm, rạ: Các vi khuẩn phân giải
cellulose kị khí Clostridium trong đất hoặc phân chuồng phân xanh. Các vi sinh vật
phân giải cellulose hiếu khí: nấm (Tricodema, Apergillus, Penicillium,
Cladosporium, Botrytis, Furaium,…) vi khuẩn (Bacillus, Cellivibrio,..) xạ khuẩn
(Streptomyces…).
Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu các chủng vi sinh vật để phân giải
rơm, rạ hay các phế phẩm nông nghiệm làm mùn hữu cơ đang rất phát triển và có
nhiều thành tựu[2]:
Trên thế giới: Chế phẩm E. M (Effective Microorganisms - vi sinh vật hữu
hiệu) được sản xuất từ Nhật Bản do Giáo sư Tiến sĩ Teuro Higa - Trường Đại học
tổng hợp Ryukyus, Okinawa sáng chế và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980.

13


Chế phẩm E. M được tạo ra từ việc phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật khác
nhau có sự tương hợp về sinh lý. Chúng sống cộng sinh và phát triển có ích nhằm
phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ. Các nhóm vi sinh vật chính trong chế phẩm
EM là: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, vi khuẩn men, xạ khuẩn, vi khuẩn.
Dùng E.M để ủ phân compost với nguyên liệu là lá cây, vỏ trái ca cao, rơm, rạ… rất
hữu hiệu. Ngoài ra còn có chế phẩm sinh học Bokashi: Bokashi là một phương pháp
sử dụng kết hợp của các vi sinh vật để phân hủy chất thải thực phẩm và giảm mùi.
Bokashi trong thuật ngữ của Nhật Bản là cho "che đi" hoặc "phân cấp". Nó bắt
nguồn từ thực tế của nông dân thế kỷ trước Nhật Bản các chất thải thực phẩm sẽ
làm đất đai màu mỡ, nơi có chứa các vi sinh vật sẽ lên men các chất thải tạo phân
hữu cơ. Sau một vài tuần, họ sẽ chôn các chất thải xuống tạo mùn. Các sản phẩm có
các vi sinh vật như EM1 được trộn với các chất carbon (ví dụ mùn cưa hoặc cám)
và thực phẩm (ví dụ như mật đường). Hỗn hợp được xếp lớp trong một hộp kín và
sau một vài tuần thì được đem chôn lấp.

Tại Việt Nam: Chế phẩm Vixura: là chế phẩm dạng bột chứa 12 - 15 loại vi
sinh vật được phân lập, tuyển chọn tại Viện Công nghệ Sinh học, trong đó có các
chủng vi khuẩn Bacillus và xạ khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme khác nhau để
phân huỷ chất hữu cơ trong rác và rơm, rạ. Ngoài ra, còn có một số vi sinh vật chức
năng như các vi sinh vật đối kháng với một số bệnh của cây trồng (Bacillus sp.), vi
sinh vật cố định đạm (Azotobacter sp.) và vi sinh vật phân huỷ phốt phát khó tan
(Bacillus sp.)… giúp cho cây trồng dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng. Ngoài ra còn có
chế phẩm sinh học BIMA (Trichoderma): Do Trung tâm Công nghệ sinh học Thành
phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học
BIMA có chứa Trichoderma là loại đối kháng có tác dụng cao trong việc thúc đẩy
quá trình phân huỷ chất hữu cơ và có nhiều tác dụng, được dùng cho các loại cây
trồng.
Thực tiễn nghiên cứu: Chúng tôi tiến hành nghiên cứu chuyên sâu trên một
đối tượng có khả năng phân giải cellulose đặc biệt đó là các chủng vi khuẩn có khả
năng phân giải cellulose.

14


1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến đời sống của vi khuẩn
Đời sống của vi khuẩn chịu ảnh hưởng trực tiếp của các thành phần dinh
dưỡng có trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và khả năng tổng
hợp enzyme của vi khuẩn. Ngoài ra, các yếu tố ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH
cũng là các yếu tố quan trọng có khả năng tác động đến quá trình sinh tổng hợp
enzyme của các chủng vi khuẩn.
Độ pH được đo bằng nồng độ ion H+ và OH-. Khi sử dụng một số chất dinh
dưỡng bị thay đổi do sự cân bằng ion, sự tổng hợp năng lượng ATP phụ thuộc vào
dòng ion. Quá trình sinh trưởng của VSV cũng ảnh hưởng đến pH của môi trường
nuôi cấy.
Môi trường dinh dưỡng cần phải đủ các thành phần chính: nguồn nito,

cacbon, vitamin, muối khoáng. Các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme của chủng vi khuẩn nuôi cấy.
1.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy đến khả
năng sinh cellulose của các chủng vi khuẩn
1.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh cellulose của các chủng vi
khuẩn. Vào thời điểm khoảng 48h – 72h nuôi cấy, lượng cellulose thu được ở vi
khuẩn là lớn nhất. Như vậy, có thể nghiên cứu động thái sinh trưởng, động thái sinh
enzyme để biết được thời gian nào thu được nhiều enzyme nhất từ đó điều chỉnh hệ
thống sản xuất phù hợp nhất đem lại hiệu quả cao.
1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là một trong những nguồn dinh dưỡng quan trọng đối với đời sống
của các loài sinh vật. Nguồn cacbon tồn tại ở những dạng khác nhau từ hợp chất vô
cơ đơn giản như CO2 đến các hợp chất vô cơ phức tạp như đường, polisaccharide….
Cellulose là nguồn cacbon chủ yếu trong tự nhiên, thường có ở thân, lá, rễ thực vật,

15


rác thải công nghiệp,... Để đồng hóa được lượng cacbon lớn này đòi hỏi các chủng
vi khuẩn nói riêng và các VSV nói chung phải có khả năng tổng hợp cellulose.
Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học người ta bắt đầu nghĩ
đến việc tận dụng nguồn cellulose trong phế thải như bã ngô, bã mía, vỏ lạc, rơm rạ,
vỏ trấu,… để sản xuất phân hữu cơ. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào hầu như chưa
được tận dụng. Khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường chứa các nguồn
cacbon này đều cho hoạt tính cellulose cao.
1.5.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Theo Nguyễn Thành Đạt, VSV đồng hóa NO3- tốt hơn các nguồn khác. Do
vậy, các chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất trong môi trường chứa nguồn nitrat
còn đối với nguồn nitrit vi khuẩn sinh trưởng yếu hơn.

Phần lớn với các loài sinh vật trong một môi trường nếu sinh trưởng tốt thì
khả năng sinh enzyme cao. Tuy nhiên, ở một số loài môi trường nuôi cấy thu
enzyme khác biệt với môi trường thu sinh khối. Điều này có nghĩa là ở một điều
kiện môi trường nhất định nào đó VSV sinh trưởng tốt chưa chắc đã cho lượng
enzyme cao.
1.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ pH
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường, do vậy pH có tác dụng rất
quan trọng đối với tốc độ phản ứng của enzyme. Mỗi enzyme đều có một giá trị pH
tối ưu cho sự hoạt động của nó và tại đó tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Ngoài
giá trị pH đó thì tốc độ phản ứng lúc này sẽ giảm dần. Đối với một enzyme nhất
định thì pH tối ưu của nó cũng không cố định mà có thể thay đổi tùy theo tính chất,
nồng độ cơ chất, nhiệt độ của phản ứng và bản chất dung dịch đệm. Như vậy, pH
ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme là do chúng tác động vào trạng thái ion
hóa của phân tử enzyme và của cơ chất, độ bền vững của phân tử enzyme do ảnh
hưởng của sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein

16