Vai trò của e coli mang gien pap, afa trong nhiễm khuẩn tiết niệu ở bệnh viện thanh nhàn, hà nội từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 06 năm 2008

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn tiết niệu (NKTN) là một trong những bệnh nhiễm khuẩn
thường gặp không những ở Việt nam mà còn ở các nước phát triển, thường
chỉ đứng thứ hai hoặc thứ ba sau nhiễm khuẩn hô hấp và tiêu hoá [2, 37, 25].
NKTN gặp ở mọi lứa tuổi, cả nam và nữ, rất hay tái phát [33]. Hơn nữa,
NKTN có thể gây biến chứng nguy hiểm, đặc biệt ở trẻ nhỏ có thể dẫn đến
thận, chức năng thận kém phát triển, cao huyết áp và có nguy cơ bị sẹo thận
[33].
NKTN có thể do nhiều loại vi khuẩn (VK), vi rút, một số loại ký sinh
trùng gây ra. Trong số VK E.coli là căn nguyên hay gặp nhất, chiếm 50-80%
[35,20, 2, 43], đồng thời là loài có khả năng hay gây tái phát và gây nhiều
biến chứng như nhiễm khuẩn huyết, suy thận.
Để gây bệnh, vi sinh vật (VSV) cần có đủ ba yếu tố: độc lực, số lượng,
đường vào thích hợp. Có nhiều yếu tố độc lực của E. coli đã được thừa nhận
như: yếu tố bám dính (adhesin), enzym ngoại bào (hemolysin, cytotoxin),
kháng nguyên K, aerobactin….Blanco đã xác định yếu tố tan máu và yếu tố
bám vào tế bào biểu mô đường niệu của E. coli hiện diện ở 88 % số chủng
gây viêm thận – bể thận. Trong khi E. coli phân lập ở phân người khỏe mạnh
chỉ có 16 % số chủng có các yếu tố này [17]. E. coli gây NKTN ở nhóm có
triệu chứng có các yếu tố độc lực xuất hiện phổ biến hơn ở nhóm không có
triệu chứng [38]. Như vậy vai trò gây bệnh của E. coli liên quan rất nhiều đến
độc lực của chúng. Trong đó, yếu tố bám vào tế bào vật chủ là điều kiện đầu
tiên để VK xâm nhập vào mô gây nhiễm trùng và cũng là yếu tố quan trọng vì
hầu hết NKTN do
E. coli là nhiễm khuẩn ngược dòng [40]. E. coli gây NKTN có các thành phần
tham gia bám đặc hiệu là: pili, fimbriae, afimbriae và một số protein màng
ngoài.

2
Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học, trên thế giới đã có
nhiều nghiên cứu về dịch tễ, cơ chế tác động, tầm quan trọng, gien mã hóa các
yếu tố độc lực của E. coli mà 2 gien pap và afa đang được nghiên cứu nhiều.
Tuy nhiên, ở Việt nam nghiên cứu về vấn đề này còn ít được đề cập đến. Để
hiểu rõ hơn về ý nghĩa các gien này của E. coli gây NKTN trên bệnh nhân
Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Vai trò của E. coli mang
gien pap, afa trong nhiễm khuẩn tiết niệu ở Bệnh viện Thanh Nhàn, Hà
Nội từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 06 năm 2008” với hai mục tiêu sau:
1. Vai trò của E. coli mang gien pap, afa trong các căn nguyên gây
NKTN ở bệnh viện Thanh Nhàn.
2. Tình hình kháng thuốc kháng sinh của các chủng E. coli mang
gien pap, afa.


3

Chương1
TỔNG QUAN
1.1. NHIỄM KHUẨN TIẾT NIỆU
1.1.1. Định nghĩa
Bình thường, ở niệu đạo trước có một vài loại VSV nhưng phần còn lại
của hệ tiết niệu là vô khuẩn. NKTN xảy ra khi VSV xâm nhập và nhân lên ở
bất kì bộ phận nào của hệ tiết niệu với số lượng có ý nghĩa, có hoặc không có
triệu chứng lâm sàng kèm theo [36].
NKTN có thể chỉ khu trú ở một vị trí như: thận (viêm thận - bể thận),
niệu quản (viêm niệu quản), bàng quang (viêm bàng quang ), niệu đạo (viêm
niệu đạo). Nhưng toàn bộ hệ tiết niệu luôn có nguy cơ bị VK xâm nhập khi
một bộ phận của nó bị nhiễm khuẩn.
Khái niệm này không bao hàm các NKTN do: lậu, Chlamydia,

Mycoplasma…
1.1.2. Phân loại
1.1.2.1. Phân loại theo vị trí giải phẫu:
- Viêm thận - bể thận
- Viêm bàng quang
- Viêm niệu đạo
1.1.2.2. Phân loại theo triệu chứng lâm sàng:
- NKTN cấp
- NKTN mạn
- NKTN không triệu chứng
1.1.2.3. Phân loại theo căn nguyên:
- NKTN đặc hiệu: Do các loài VK đặc hiệu gây nên và có hình ảnh lâm
sàng đặc trưng. Các VK trong nhóm này bao gồm: Mycobacterium


4
tuberculosis, Neisseria gonorrhoae, Mycoplasma, Chlamydia... Loại NKTN
đặc hiệu này chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong NKTN nói chung.
- NKTN không đặc hiệu: Là loại NKTN thường gặp do các trực khuẩn
Gram âm hoặc cầu khuẩn Gram dương gây nên.
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh NKTN
1.1.3.1. Cơ chế bảo vệ:
Trong điều kiện bình thường, VSV xâm nhập vào hệ tiết niệu được thải
trừ một cách nhanh chóng nhờ cơ chế đề kháng tự nhiên của nó:
- Hệ tiết niệu với sự toàn vẹn và bình thường về giải phẫu, sinh lý cho
phép dẫn nước tiểu dễ dàng triệt để. Lượng nước tiểu lớn và số lần đi tiểu
bình thường cho phép rửa trôi VSV khi nó xâm nhập vào hệ tiết niệu [36, 43].
- Cấu trúc van bàn quang – niệu quản có tác dụng chống trào ngược
nước tiểu từ bàng quang lên niệu quản khi có tăng áp lực quá mức trong bàng
quang [43].

- Chiều dài niệu đạo cũng có tác dụng hạn chế sự xâm nhập của VSV.
- Ngoài cơ chế bảo vệ mang tính cơ học nói trên, hệ tiết niệu còn được
bảo vệ bởi miễn dịch tại chỗ (IgAs), miễn dịch toàn thân (IgG, bổ thể) [43],
đáp ứng viêm, bong các tế bào biểu mô khi bị VSV bám [29].
- Thành phần nước tiểu có một số yếu tố: pH thấp, áp lực thẩm thấu
cao, nồng độ ure cao, nồng độ glucose và Fe thấp không thuận lợi cho VSV
phát triển [43].
- Chất tiết của tiền liệt tuyến có tác dụng kháng khuẩn [36, 43].
- Lactobacilli ở âm đạo giúp ngăn cản E. coli gây NKTN thông qua cơ
chế cạnh tranh vị trí bám và sản xuất acid lactic, H2O2 [20].
1.1.3.2. Mối tương tác giữa VSV và vật chủ
Không phải bất cứ sự xâm nhập nào của VSV đều có thể gây NKTN.
NKTN xảy ra cần có các yếu tố thuận lợi về phía vật chủ và độc lực của VSV.
* Về phía vật chủ:


5
- Sự bất thường về giải phẫu, sinh lý hay bất kỳ nguyên nhân gì gây tắc
nghẽn, ứ đọng hoặc trào ngược nước tiểu như: dị dạng hệ tiết niệu, trào ngược
bàng quang - niệu quản, sỏi đường niệu, hẹp bao quy đầu, rối thần kinh cơ
bàng quang, u tiền liệt tuyến…tạo điều kiện cho VSV bám vào niêm mạc
đường tiểu, phát triển gây nhiễm khuẩn tại chỗ và nhiễm khuẩn ngược dòng.
- Thai nghén: Tuỳ thuộc vào tình trạng kinh tế xã hội, 2-10% phụ nữ
có thai bị NKTN [11, 43]. Đặc biệt nhiễm khuẩn đường tiểu trên có triệu
chứng thường xảy ra nhiều hơn trong thời kỳ thai nghén là do trương lực và
nhu động của niệu quản bị giảm, sự bất lực tạm thời của van bàng quang niệu quản [43].
- Thời kỳ mãn kinh, NKTN có thể tăng do mô bàng quang, âm đạo trở
mỏng và yếu hơn do mất estrogen [25].
- Phụ nữ sử dụng một số biện pháp tránh thai như: màng ngăn âm đạo,
thuốc diệt tinh trùng làm thay đổi hệ VSV ở âm đạo, có thể tăng nguy cơ

NKTN do E. coli [43].
- Đặt ống thông tiểu: Với hệ thống dẫn lưu hở, NKTN thường xuất
hiện sau 4 ngày đặt sonde. NKTN gần như chắc chắn xuất hiện nếu thời gian
đặt sonde kéo dài trên 30 ngày với bệnh nhân được đặt hệ thống dẫn lưu kín
[8].
- Giảm sức đề kháng do: các nguyên nhân gây suy giảm miễn dịch, suy
dinh dưỡng, bệnh mạn tính đặc biệt là bệnh tiểu đường có nguy cơ NKTN cao
gấp 2-3 lần.
- Di truyền: nhiều bằng chứng cho thấy các yếu tố di truyền có ảnh
hưởng đến nguy cơ NKTN. Số lượng, kiểu loại các thụ thể trên tế bào biểu
mô đường niệu được quy định một phần bởi các yếu tố di truyền. Người có
kháng nguyên nhóm máu P có thụ thể glycolipid trên hồng cầu và tế bào biểu
mô đường niệu cho P fimbriae của E. coli bám vào, những người này có nhiều
khả năng bị viêm thận - bể thận do E. coli [43].


6
* Về phía VSV
Hầu hết các VK đều có thể gây NKTN. Nhưng một số VK có khả năng
đặc biệt thích hợp gây NKTN. Chúng có một số yếu tố độc lực quan trọng:
khả năng bám vào tế bào biểu mô đường tiểu, haemolysin, kháng nguyên bề
mặt, kháng lại các yếu tố bảo vệ (thực bào, miễn dịch)…những yếu tố này đặc
biệt quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm thận - bể thận cấp và cùng
thấy thường xuyên hơn ở các chủng gây nhiễm khuẩn đường tiểu dưới hơn
các chủng VK nhóm đối chứng [36].
Đa số các chủng E. coli gây viêm thận - bể thận cấp ở những vật chủ
không có bất thường về cấu trúc hoặc chức năng có hầu hết các yếu tố độc
lực. Ngược lại các chủng có ít yếu tố độc lực có thể gây viêm thận - bể thận ở
những người có bất thường về cấu trúc, chức năng hoặc bị bệnh đái đường,
suy giảm miễn dịch [36]. Như vậy có sự liên quan giữa các yếu tố vật chủ và

độc lực của VSV.
1.1.4. Tình hình NKTN ở Việt Nam và trên thế giới
NKTN là một vấn đề sức khoẻ khá nghiêm trọng. Khoảng 40 % phụ nữ
bị NKTN ít nhất một lần trong cuộc đời [41]. Ở Mỹ, khoảng 8 triệu người đến
khám vì NKTN và chi phí hàng tỷ đô la cho điều trị bệnh này mỗi năm [25].
Tại Pakistan, tỷ lệ NKTN ở bệnh nhân vào viện là 23,5% [27]. NKTN ở trẻ
em cũng phổ biến sau nhiễm khuẩn hô hấp và tiêu hoá, khoảng 7% trẻ gái và
2% trẻ trai bị NKTN [19, 42].
NKTN bệnh viện là nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) thường gặp [8,
45], đứng thứ 2 hoặc 3 sau nhiễm khuẩn hô hấp và nhiễm khuẩn vết mổ bệnh
viện, chiếm 10 - 40 % NKBV [1, 10, 39]. Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh
phổ rộng kéo dài ở những bệnh nhân đặt ống thông tiểu là điều kiện thuận lợi
xuất hiện các chủng VK đa kháng thuốc.
NKTN không triệu chứng cũng là một vấn đề cần quan tâm, đặc biệt ở
trẻ em và phụ nữ có thai. Tỷ lệ NKTN không triệu chứng ở cộng đồng: 1- 3 %


7
trẻ gái, 0,03- 0,2% trẻ trai [12, 36], 1-3 % phụ nữ (không có thai), 0,1 % nam
giới và tỷ lệ này tăng cao ở lứa tuổi trên 65 (10- 20 %) [36]. Trẻ em, nếu
không được phát hiện và điều trị bệnh diễn biến tiềm tàng kéo dài, có thể dẫn
đến các biến chứng nguy hiểm như cao huyết áp, thận, chức năng thận kém
phát triển và có nguy cơ cao bị sẹo thận [33]. 2-10 % phụ nữ có thai có
NKTN không triệu chứng, khoảng 20%- 30% những người này nếu không
được điều trị có thể dẫn đến viêm thận - bể thận, có nguy cơ bị đẻ non hoặc
thai lưu [36, 43].
Một trong những vấn đề lâm sàng quan trọng của NKTN là tái phát,
ảnh hưởng 25 - 50 % bệnh nhân. Nhóm có nguy cơ cao bị NKTN tái phát là
phụ nữ mãn kinh, người bị bệnh đái đường và trẻ em có bất thường về đường
niệu [25, 33].

1.2. CĂN NGUYÊN VI KHUẨN GÂY NKTN
Các tác giả trong và ngoài nước khi nghiên cứu về căn nguyên NKTN
đều khẳng định vai trò chủ yếu của các VK Gram âm.
Các trực khuẩn đường ruột chiếm tỷ lệ cao nhất (60- 90 %), trong đó
đứng đầu là E. coli rồi đến Klebsiella, Proteus, Enterobacter… Các VK này
thường xuyên có mặt ở đường ruột, dễ dàng xâm nhập vào đường tiết niệu và
gây bệnh khi có điều kiện.
Đứng thứ hai sau trực khuẩn đường ruột là là các cầu khuẩn Gr dương
như: Enterococcus, S. saprophyticcus chiếm 10-20% NKTN cấp ở phụ nữ trẻ
tuổi) [20, 36, 43]. Phân lập được S. aureus từ nước tiểu là một gợi ý cần quan
tâm tới nhiễm khuẩn huyết từ thận [43].
Đứng thứ ba là Pseudomonas đặc biệt chiếm tỷ lệ cao trong NKBV nói
chung và NKTN bệnh viện nói riêng.
Đã có tác giả phân lập được Hemophilus (0,88%) khi nuôi cấy nước
tiểu trẻ em trên môi trường thạch sôcôla [30, 32].


8
1.3. ESCHERICHIA COLI
1.3.1. Một số nét chung về E. coli
E. coli do Buchner tìm ra năm 1885 và được Escherich nghiên cứu chi
tiết từ năm 1886.
1.3.1.1. Đặc điểm sinh học [3]
- E.coli là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2- 3 µm x 0,5
µm. Một số chủng có vỏ, hầu hết có lông và có khả năng di động, không có
nha bào.
- E. coli là VK hiếu kị khí tuỳ ngộ, dễ dàng phát triển trên các môi
trường nuôi cấy thông thường, có thể phát triển được ở 5- 40 oC. Chúng phát
triển rất nhanh, thời gian thế hệ khoảng 20- 30 phút. Trên môi trường lỏng
làm đục môi trường. Trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc dạng S, cũng

có thể gặp dạng R hoặc M.
- Tính chất hoá sinh: E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường và
sinh hơi. Tất cả E. coli đều lên men lactose trừ E. coli loại EIEC; sinh indol,
không sinh H2S, simmon citrate âm tính; có decarboxylase vì vậy có khả năng
khử carboxyl của lysin, ornitin, arginin và acid glutamic; betagalactosidase
dương tính; thử nghiệm VP (Voges Proskauer) âm tính.
- Kháng nguyên: kháng nguyên thân O có khoảng 160 loại khác nhau
(O1-160), kháng nguyên lông H có khoảng 50 loại (H 1-50) và kháng nguyên bề
mặt K có khoảng 100 loại (K1-100).
1.3.1.2. Phân loại
E. coli thuộc họ Enterobacteriacae.
Tác giả
Tộc
Giống
Loài
Ewing (1986)
Escherichieae
Escherichia
E. coli
CDC (1989)
Escherichia – Shigella E. coli
’
Bergey s (1995)
Escherichia
E. coli
IJSB (2000)
Escherichia
E. coli
- Dựa vào cấu trúc kháng nguyên: E. coli được chia thành hơn 700 type
huyết thanh khác nhau.

9
- Dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu, có khoảng 50 type.
- Dựa vào tính chất gây bệnh:
+ E. coli tiêu chảy (Diarrheagenic E. coli - DEC)
+ E. coli gây viêm màng não sơ sinh (New born menigitidis E. coli NMEC)
+ E. coli gây NKTN (Uropathogenic E. coli – UPEC)
+ E. coli gây nhiễm trùng bệnh viện
1.3.1.3. Khả năng gây bệnh
E. coli kí sinh bình thường trong đại tràng của người và một số động
vật, chiếm 80% tổng số VK hiếu khí. Nhưng những năm gần đây, vai trò gây
bệnh của VK này đã được đề cập đến khá nhiều, nó đứng đầu trong các VK
gây tiêu chảy, viêm đường mật, NKTN và nhiễm khuẩn huyết [3].
Để làm sáng tỏ vai trò gây bệnh của E. coli, đã có nhiều công trình
nghiên cứu về VK này. E. coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có
khả năng gây các bệnh lý khác nhau.
1.3.2. E. coli và NKTN
1.3.2.1. Độc lực của E. coli gây NKTN
Các chủng E. coli gây NKTN đặc trưng bởi các yếu tố độc lực, giúp nó
thắng được sự đề kháng của cơ thể vật chủ, ký sinh, xâm nhập và gây bệnh
như: yếu tố bám (adhesin), các enzym ngoại bào (hemolysin, cytotoxin),
aerobactin (siderophore, cạnh tranh Fe với cơ thể vật chủ), colicin, kháng
nguyên K, kháng lại tác dụng diệt khuẩn của huyết thanh [43]. Các chủng
phân lập từ những bệnh nhân nhập viện có số gien độc lực nhiều hơn và sự
kết hợp đa dạng của các gien so với các chủng phân lập từ nhóm không phải
nhập viện [21].
Trong các yếu tố động lực thì yếu tố bám là yếu tố đặc hiệu đặc biệt khi
E. coli có mặt ở đường ruột, đường mật, đường niệu [6]. Nhờ có đặc tính quan
trọng này mà E. coli bám được vào đường tiêu hoá, đường niệu thắng được

10
lực cơ học của nhu động ruột, tác dụng rửa trôi của nước tiểu để tồn tại, xâm
nhập và tạo bước đầu tiên của quá trình gây bệnh. 96% trường hợp NKTN do
E. coli tái phát là do chủng E. coli đó tồn tại ở âm đạo, đại tràng và biểu mô
BQ mặc dù điều trị kháng sinh thích hợp [26]. Ngoài tác dụng trên, khi yếu tố
bám của
E. coli bám vào thụ thể Gal α1- 4Gal β (glycosphingolipid) còn làm tăng phản
ứng viêm, dẫn đến tổn thương mô và làm tăng nguy cơ bị sẹo thận ở trẻ em
[22]. Hơn nữa, có mối liên quan chặt chẽ giữa một số yếu tố bám và sản xuất
độc tố của VK (alpha- haemolysin và cytotoxic necrotizing factor type 1)
[18].
1.3.2.2. Một số đặc điểm và vai trò của gien mã hóa cho các yếu tố bám của
E. coli
Gien độc lực của E. coli hầu hết nằm trên nhiễm sắc thể, chỉ một số ít
gien nằm trên plasmid [5, 31]. E. coli có nhiều gien mã hoá cho các yếu tố
bám như:
- Gien pap mã hoá kiểu hình P fimbriae.
- Gien afa mã hoá kiểu hình AFA afimbriae adhesin.
- Gien sfa mã hoá kiểu hình S fimbriae.
- Gien fil mã hoá kiểu hình type 1 fimbriae.
- Gien foc mã hoá kiểu hình F1C fimbriae, gien gaf (fimbriae G), gien
dra ( yếu tố bám Dr family)….
Trong đó pap, afa là những gien có vai trò quan trọng trong NKTN [15,
16, 34]. Các gien này xuất hiện phổ biến (32 %, 8,5 %) ở các chủng E. coli
gây NKTN hơn E. coli ở phân (15 %, 2,5 %) [34, 16]. E. coli gây tiêu chảy
không mang gien pap [70] và trong bệnh tiêu chảy do E. coli thì E.coli mang
gien afa chỉ chiếm 1,0-2,0 % [23].
E. coli gây NKTN bệnh viện mang gien pap là cao nhất (20,4 %) so với

E. coli ở các loại bệnh phẩm khác: dịch mật (6,3 %), mủ (6,0 %), không thấy


11
ở các bệnh phẩm khác (dịch ổ bụng, vết mổ, máu) [5]. Gien pap
(pyelonephritis - associated pili) liên quan với E. coli gây viêm thận - bể thận
(65 %) hơn với các chủng gây viêm bàng quang (23 %). Receptor của P
fimbriae là Gal α1- 4Gal β có trên hồng cầu và tế bào biểu mô đường niệu của
người có kháng nguyên nhóm máu P, nên được gọi là P adhesin [16]. Người
có kháng nguyên nhóm máu P dễ bị viêm thậm – bể thận do E. coli [43].
Theo Bùi Khắc Hậu, gien afa có tỷ lệ cao hơn (42,4 %) gien pap (20,4
%) ở các chủng E. coli gây NKTN bệnh viện. Trong khi gien afa thường thấp
hơn gien pap ở E. coli gây NKTN nói chung [15, 24]. Để hiểu rõ hơn về ý
nghĩa của các gien pap và afa của E. coli gây NKTN, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài này.
1.3.2.3. Tình hình kháng kháng sinh của E. coli
E. coli đã kháng lại nhiều thuốc kháng sinh thông thường với một tỷ lệ
đáng lo ngại và gần đây đã kháng lại cả các kháng sinh thế hệ mới. Theo
chương trình ASTS – Bộ Y tế (2005) [4], E. coli kháng ampicillin (90 %),
chloramphenicol (60,6 %), new quinolon (56,8- 61,8 %), các cephalosporin
(51- 66,3 %). Chỉ còn 3 kháng sinh còn tác dụng trên 75 % số chủng E. coli
còn nhạy cảm là imipenem (99,6 %), amikacin (89,5 %) và netilmicin (85,3
%).
Kiều Chí Thành (luận án tiến sỹ), Đỗ Mạnh Hùng (luận văn thạc sỹ)
nghiên cứu tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng E. coli gây NKTN cũng
cho kết quả gần tương tự [7, 9].
Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của
E. coli là VK nhận gien kháng thuốc qua plasmid. E. coli có khả năng truyền
R- plasmid với tần xuất khá cao (2-5 x 10 6) [13]. Ngoài cơ chế đề kháng do
plasmid, E. coli còn có thể kháng thuốc do đột biến. Tuy nhiên, đề kháng do

đột biến thường chiếm tỷ lệ thấp vì tần xuất đột biến chỉ từ 10 -5 đến 10-11, nếu
kháng 2 thuốc cùng một lúc thì tần xuất đột biến phải từ 10-10 đến 10-22 [14].


12
Việc nghiên cứu mối liên hệ giữa gien kháng thuốc và gien độc lực của
VK chưa được nghiên cứu nhiều. Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của
Bùi Khắc Hậu xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của E. coli mang
gien afa trong nhiễm trùng ngoại khoa hệ đường mật và tiết niệu [6].
1.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIEN ĐỘC LỰC CỦA E. COLI
* Phương pháp lai ADN: Là kỹ thuật hiện đại, tốn kém và đòi hỏi
nhiều trang thiết bị đắt tiền. Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao, nhưng
có nhược điểm là cần có một lượng ADN đủ lớn.
* Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction): Qua thực nghiệm cho
thấy PCR là một phương pháp rất nhạy, đặc hiệu và đơn giản hơn phương
pháp lai ADN.
1.4.1. Nguyên lý của phản ứng phản ứng PCR
Dựa theo quá trình sao chép ADN trong tế bào, trong đó ADN được
nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu
được tách ra thành hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho
việc tổng hợp chuỗi ADN mới. Chu kỳ nhân lên của ADN trong tế bào có thể
chia làm 3 giai đoạn: Tách chuỗi ADN kép thành 2 chuỗi đơn dùng làm khuôn
mẫu tổng hợp AND mới, tại nơi hai chuỗi đơn tách rời nhau có các nucleotide
đến lai ghép theo nguyên tắc bổ xung A-T, G-C để tạo thành mồi, kéo dài
đoạn mồi đã được lai ghép với sợi ADN khuôn để tạo nên ADN mới. Từ một
phân tử ADN ban đầu, sau một chu kỳ sao chép đã tạo được hai phân tử ADN
chuỗi kép mới.
Tất cả các hoạt động này đều cần enzym đặc hiệu có trong tế bào xúc
tác. Hoạt động sao chép của ADN trong tế bào diễn ra thường xuyên nhưng
với tốc độ chậm, tuỳ thuộc vào các mô của cơ thể.

Kỹ thuật PCR cho phép nhân lên bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào
với tốc độ nhanh hơn nhiều lần so với sự nhân lên của chúng trong tế bào. Chỉ


13
trong thời gian 2- 4 giờ, số lượng bản sao có thể tăng gấp hàng triệu lần so với
ban đầu.
Đối với kỹ thuật PCR, cặp mồi lựa chọn đóng vai trò quyết định tính
đặc hiệu của phản ứng. Việc nhân lên của một đoạn ADN nào đó bằng PCR
chỉ được tiến hành sau khi 2 đoạn ADN mồi lai ghép được với 2 sợi ADN
khuôn mẫu và có sự kéo dài đoạn mồi theo chiều 5’- 3’. Hai đoạn mồi này
phải nhận ra trên ADN mẫu hai đoạn có tổng số khoảng 40 nucleotide. Nếu
ước tính khả năng xuất hiện của một trình tự có độ dài 40 nucleotide thì kết
quả là (1/4)40. Con số này cho thấy tính đặc hiệu cao của việc dò tìm một đoạn
40 nucleotide trên phân tử ADN.
1.4.2. Các thành phần tham gia phản ứng:
* ADN khuôn mẫu: Là những đoạn gien cần được khuyếch đại, đã biết
trình tự và có kích cỡ không quá 2000bp.
* Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs):
- Deoxyadenosine triphosphate (dATP).
- Deoxythymidine triphosphate (dTTP).
- Deoxyguanosine (dCTP).
- Deoxycytidine (dGTP).
Đây là các nguyên liệu dùng để kéo dài mồi.
* Mồi (Primer): Là một đoạn ADN sợi đơn dài khoảng 18-40 base, bao
gồm các đoạn mồi xuôi (forward) và mồi ngược (reverse). Đặc tính của mồi là
phải có trình tự các nucleotide bổ xung với trình tự ở hai đầu của đoạn ADN
đích. Trong giai đoạn ủ mồi, mỗi mồi phải được lai ghép chính xác với một
chuỗi đơn của ADN đích đã được tách ra ở giai đoạn biến tính. Hướng tổng
hợp ADN từ hai mồi này là đi ngược chiều nhau. Như vậy cặp mồi phải mang

tính đặc hiệu với ADN đích.
* Men xúc tác tổng hợp ADN (DNA polymerase):


14
Trong tế bào, để hoàn chỉnh quá trình tổng hợp ADN, có 3 loại ADN
polymerase: ADN polymerase III đóng vai trò chủ yếu, xúc tác cho phản ứng
kéo dài đoạn mồi; ADN polymerase I, II tham gia vào quá trình sửa chữa ADN.
Trong PCR, người ta chỉ sử dụng ADN polymease để tổng hợp ADN
mà không dùng loại sửa chữa. Ngày nay, người ta thường dùng loại ADN
polymease chịu nhiệt (95oC), tách chiết từ một loại VK sống ở suối nước nóng
có tên là Thermus aquaticus nên ADN polymease của nó được gọi là Taq
DNA polymerase. Enzym này xúc tác phản ứng làm cho d NTP s gắn vào đầu
3’ tự do của ADN mồi đã lai ghép với ADN đích và làm cho quá trình kéo dài
mồi được thực hiện theo chiều 5’- 3’.
* Ion Mg2+: Hoạt động của ADN polymease đòi hỏi phải có mặt của
Mg2+. Tuy nhiên không có quy luật chung về nồng độ Mg 2+ . Nồng độ tối ưu
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
* Dung dịch đệm (Buffer): Dung dịch đệm đảm bảo môi trường thích
hợp và ổn định cho PCR. Thành phần thông thường gồm có:
Tris- Cl pH 8,3

10 mM

MgCl2

2,5 mM

Gelatin

0,01mg/ml

1.4.3. Quá trình khuyếch đại gien invitro [5]
* Giai đoạn biến tính ADN khuôn mẫu: Ủ ADN khuôn mẫu ở nhiệt độ cao
(90- 94oC) để cho 2 sợi ADN tách rời nhau, bộc lộ trình tự chuỗi đích.
* Giai đoạn gắn mồi: Thực hiện ở 50- 52oC. Các nucleotide trên đoạn
mồi xuôi và mồi ngược được gắn bổ sung cho nhau với các nuleotide ở 2 đầu
(trên 2 sợi ADN) của đoạn gien cần được tổng hợp.
* Giai đoạn kéo dài mồi tạo ADN mới: Thực hiện ở 70 – 72oC. Nhờ
hoạt động của Taq DNA polymerase mà các dNTPs được gắn vào đầu 3’ của
các đoạn mồi, theo trình tự bổ sung với các nucleotide trên sợi ADN khuôn
mẫu.


15
Khi quá trình trên được hoàn thành, đoạn mồi đã là một phần của sợi
ADN mới tổng hợp. Cứ như vậy, 3 giai đoạn trên được lặp lại khoảng 25- 30
chu kỳ


16

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các chủng E. coli phân lập được từ bệnh phẩm cấy nước tiểu của bệnh
nhân NKTN ở bệnh viện Thanh Nhàn, Hà Nội từ tháng 01 năm 2007 đến
tháng 06 năm 2008.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1. Dụng cụ lấy bệnh phẩm nước tiểu: Ống nghiệm 10 ml, có nút bông,
được hấp sấy vô trùng.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy, phân lập, định danh VK:
- Thạch máu cơ sở: Blood agar base (hãng Bio-Rad)
- Các môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học các loại VK
2.2.3. Vật liệu xác định độ nhạy cảm của VK với kháng sinh:
- Thạch Mueller – Hinton (Hãng Bio-Rad)
- Các khoanh giấy kháng sinh (hãng Bio-Rad)
- Độ đục chuẩn Mc Farland 0,5
- Các chủng quốc tế:
E.

coli

S. aureus ATCC 25923
P. aeruginosa ATCC 27853

ATCC

25922


17
2.2.4. Các vật liệu dùng cho phản ứng PCR:
2.2.4.1. Sinh phẩm:
- Cặp mồi xác định gien qui định yếu tố bám: P fimbriae, afimbriae
adhesin của E. coli
Tên
Mồi
afa-f

Trình tự (5’- 3’)
CGGCTTTTCTGCTGAACTGGCAGGC

afa-r
pap-f

CCGTCAGCCCCCACGGCAGACC
ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA

pap-r

GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG
- Dung dịch đệm, nước khử ion
- Enzym Taq AND polymerase: 5UI/µ
- dNTPs gồm: ATP, TTP, GTP, CTP
- MgCl2: 25mM
- Thang ADN mẫu dùng trong điện di gien

2.2.4.2. Hoá chất:
- Thạch Agarose
- Ethidium bromide
- TAE (Tris Acetate EDTA)
- PBS (Phosphate Buffer Saline)
2.2.4.3. Dụng cụ máy móc :
- Máy ly tâm lạnh
- Máy điều nhiệt tự động
- Bộ điện di ngang
- Máy chụp ảnh gel và phim Kodak cỡ 667
2.2.5. Phiếu điều tra (phụ lục 1)

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Gen
đích
afaC

Sản phẩm
(bq)
750

papC

328


18
Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp điều tra cắt ngang, dựa theo
mục tiêu nghiên cứu.
Nước tiểu

nhuộm Gr

Cấy đếm

Xác định VK
gây bệnh

Định danh

Kháng

sinh đồ

PCR
Gien pap, afa
của E.coli

Xử lý kết quả bằng toán thống kê

Kết luận
(theo mục tiêu )

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
2.3.1. Lấy bệnh phẩm:


19
Bệnh nhân cần rửa sạch bộ phận sinh dục ngoài và tầng sinh môn bằng
xà phòng và nước sạch (không sử dụng các dung dịch sát khuẩn), sau đó lau
khô bằng khăn sạch.
Bệnh phẩm được lấy theo phương pháp “nước tiểu giữa dòng”. Các
mẫu bệnh phẩm được lấy vào buổi sáng và được gửi ngay đến phòng xét
nghiệm trong vòng 2 giờ.
Đây là phương pháp lấy nước tiểu hay được áp dụng vì đơn giản nhất
và cho kết quả đáng tin cậy nếu thực hiện đúng quy trình.
2.3.2. Nhuộm soi, nuôi cấy, phân lập, định danh:
* Nhuộm soi trực tiếp: Dùng pipet Pasteur vô trùng, lấy mẫu nước tiểu
không ly tâm (đã được lắc đều), nhỏ một giọt lên lam kính sạch (không dàn
bệnh phẩm), để khô tự nhiên, cố định bằng nhiệt, nhuộm Gr và soi kính hiển
vi. Đánh giá: VK, tế bào (viêm, biểu mô)
* Nuôi cấy: Quy trình cấy đếm theo phương pháp dùng que cấy chuẩn

của Hoeprich [44]
Dùng que cấy có dung lượng 0,01 ml, lấy nước tiểu (không ly tâm), ria
cấy dàn đều lên môi trường thạch máu. Để tủ ấm 37oC qua đêm.
Đọc kết quả: Đếm số lượng CFU trên toàn bộ đĩa môi trường, xác định
số lượng CFU/ 1 ml nước tiểu theo công thức sau:
Số CFU/ 1ml nước tiểu = Số CFU x 1000
* Tiêu chuẩn chẩn đoán đối với phương pháp lấy nước tiểu giữa
dòng (theo tiêu chuẩn của WHO 1991) [44]
- Số lượng CFU > 105/ 1ml nước tiểu: có thể kết luận có NKTN dù có
triệu chứng lâm sàng hay không.
- Số lượng CFU từ 104 – 105/ 1ml nước tiểu: chẩn đoán NKTN nếu có
thêm ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:
+ Có triệu chứng lâm sàng


20
+ Có VK hoặc bạch cầu trong vi trường tiêu bản nhuộm Gr trực tiếp từ
nước tiểu không pha loãng.
- Số lượng CFU < 104/ 1ml nước tiểu: không có NKTN
Trường hợp có nhiều hơn 2 loại khuẩn lạc thì dù số lượng CFU >10 5/
1ml nước tiểu cũng phải cho là bội nhiễm và cần xét nghiệm lại.
* Định danh: theo thường quy xét nghiệm vi sinh
2.3.3. Thử nghiệm tính nhạy cảm của VK với kháng sinh
Theo phưong pháp kháng sinh khuyếch tán trong thạch (Kirby-Bauer)
Thường quy của ASTS.
2.3.4. Kỹ thuật PCR xác định gien pap, afa của các chủng E. coli phân lập
được
2.3.4.1. Kiểm tra các chủng trước khi làm PCR:
- Lựa chọn, kiểm tra độ thuần khiết của các chủng E. coli từ chủng mẫu,
bệnh phẩm và các chủng được nghiên cứu trên thạch thường đĩa để 24 giờ.

- Xác định lại bằng tính chất sinh vật hoá học.
2.3.4.1. Tiến hành tách chiết ADN (theo qui trình của Viện Karolinska -Thuỵ
Điển):
- Lấy VK từ đĩa môi trường thạch thường cho vào 500µl PSB để có độ
đục Mac-Farland 4 (109 – 5.109 VK/ml). Sau đó tiến hành khuấy đều bằng
máy Vortex.
- Đun sôi cách thuỷ 20 phút để giải phóng ADN .
- Ly tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút/10 phút.
- Chuyển nước nổi (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới.
- ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ lạnh – 70 oC nếu không
được tiến hành phản ứng ngay.
2.3.4.2. Tiến hành phản ứng PCR:


21
Chạy phản ứng PCR phát hiện gien pap, afa của E. coli với các chu kỳ
như sau: Một chu kỳ 96oC/5’, 25 chu kỳ: 94oC/1’, 65oC/1’, 720C/2’, một chu kỳ
72oC/7’, giữ ở 4oC.
Quá trình khuyếch đại gien invitro qua 3 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Biến tính ADN khuôn mẫu ở 94oC/1’, để cho 2 sợi ADN
tách rời nhau, bộc lộ trình tự chuỗi đích (là ADN đặc hiệu cần khuyếch đại).
* Giai đoạn2: Gắn mồi ở 65oC/1’. Các nucleotide trên đoạn mồi xuôi và
mồi ngược được gắn bổ sung cho nhau với các nuleotide ở 2 đầu (trên 2 sợi
ADN) của đoạn gien cần được tổng hợp.
* Giai đoạn 3: kéo dài mồi ở 72oC/2’. Nhờ hoạt động của Taq DNA
polymerase mà các dNTPs được gắn vào đầu 3’ của các đoạn mồi, theo trình
tự bổ sung với các nucleotide trên sợi ADN khuôn mẫu.
2.3.5. Điện di:
- Các sản phẩm sau khi chạy PCR được diện di trên gel agarose 1,5%
với dung dịch đệm là TAE.

- Điện di với hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong thời
gian 20 phút.
- Các mẫu thực hiện được điện di song song cùng với chứng âm, chứng
dương và thang mẫu ADN.
2.3.6. Nhuộm ADN và đọc kết quả:
Sau điện di bản gel được nhuộm trong ethidium bromide 1 % pha trong
nước cất (trong 10 phút ), sau đó ngâm vào nước cất để loại bỏ ethidium
bromide bám không đặc hiệu trên thạch.
Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc chụp ảnh trong buồng tối dưới tia
cực tím.
2.4. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU:


22
Các số liệu được thu thập theo mẫu phiếu điều tra. Nhập, xử lý, phân
tích số liệu theo phương pháp thống kê dịch tễ học, sử dụng phần mềm Epi
info 6.04. So sánh sự khác biệt về tỷ lệ dựa vào thuật toán kiểm định khi bình
phương, với P < 0,05 thì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.


23

Chương 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. CÁC CĂN NGUYÊN PHÂN LẬP ĐƯỢC
Bảng 1: Tỷ lệ các căn nguyên phân lập được
STT
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11

Căn nguyên

Số lượng

E. coli
Klebsiella spp
Proteus spp
Enterobacter spp
Các VK họ đường ruột khác
Pseudomonase aeruginosa
Enterococcus spp
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus
Acinetobacter
Nấm

Tỷ lệ %

`
Cộng

24
Bảng 3.2: Phân bố căn nguyên theo tuổi (%)
<5

Căn nguyên

6
-15

16
-30

31
-45

46
-60

61
-75

>75

E. coli
Klebsiella spp
Proteus spp
Enterobacter spp
Các VK họ đường ruột khác
Pseudomonase aeruginosa

Enterococcus spp
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus
Acinetobacter
Nấm
Cộng
Bảng 3.3: Căn nguyên theo giới
Nam

Căn nguyên

n

E. coli
Klebsiella spp
Proteus spp
Enterobacter spp
Các VK họ đường ruột khác
Pseudomonase aeruginosa
Enterococcus spp
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus
Acinetobacter
Nấm
Cộng

Nữ
%

n

%


25
Bảng 3.4: căn nguyên theo thể lâm sàng
Câp tính
n
%

Căn nguyên

Mạn tính
n
%

Tái phát
n
%

E. coli
Klebsiella spp
Proteus spp
Enterobacter spp
Các VK họ đường ruột khác
Pseudomonase aeruginosa
Enterococcus spp
S. aureus
S. saprophyticus
Acinetobacter

Nấm
Cộng

3.2. E. COLI VÀ E. COLI MANG GIEN pap, afa
Bảng 3.2: Tỷ lệ E. coli mang gien pap, afa
Gien độc lực
pap
afa
pap + afa

Số chủng thực

Số chủng mang

nghiệm

gien độc lực

Tỷ lệ (%)