CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Mục lục
LỜI NÓI ĐẦU

Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được cấu tạo từ nhiều nguyên tố: c , H, o , N...
Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này
bong phân tử Protein như sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 - 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một
số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như p, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca... (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc
Tú- NXB khoa học và kĩ thuật HN, trang 94)

Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và
chức năng của cơ thể sống.
Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất đạm) tồn tại ồ nhiều dạng khác nhau
như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac hoặc muối amonium). Để xác định được chúng hiện nay có
nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng từng
phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp. Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định
lượng Protein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể
.

1


I. Tổng quan:
1. Câu tạo phân tử Proteỉn:
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố c , o , N, H, một số còn chứa một
lượng nhỏ s . Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein như
sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 - 0.24%. Ngoài các nguyên
tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như p, Fe, Zn, Cu,

Mn, Ca...

Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật cấu trúc
có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan ttọng đối vđi tất cả các cơ thể
sinh vật.

Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4
1.1.

Cấu trúc bậc 1:

Là ttình tự sắp xếp các gốc acid amin ttong mạch polypeptide. cấu trúc này được giữ
vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trị)

Liên kết peptide

H HHO H HHO H
I I I II 1

1 I II I

HN - C- C- N- C- C- N- C- C- N- C- C- NC - I II I
I I II I II
o
Ri o R2 H R3 o R4 H 3
R5
1.2.

Cấu trúc bậc 2:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch
polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch
polypeptide. cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành giữa các
liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác định.


p straitd
l hp N
—ca~“c harkhnne as unell
as the Cg of R srotips are represented
heie. Note that the unide phuies arc

EI Hellx
Only the rt <• C barklưmí
ds lepresented. The vertícal
line IS the helẽv a.-ÕS.

peipendiculai' to the Lntage.

1.3. Câu trúc bậc 3;

Tương
tác

không

gian giữa các
gốc

acid

amin ở xa
nhau trong
mạch

polypeptide, là dạng cuộn lại trong không
gian của mạch polypeptide (hình dạng chung
của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein
hình cầu có chứa các gốc Cys, sự tạo thành
các liên kết disuníua giữa các

gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide,

làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên kết tĩnh điện, liên kết
hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin ... đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3.
Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình tự sắp xếp các gô"c acid amin
trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.

1.4. Cấu trúc bậc 4:

Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian giữa
các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi


polypeptide gọi là ”phần dưới đơn vị ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực Vandecvan giữa các
nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vị”.

II. Các phương pháp định lượng proteỉn
1. Định lượng nỉtơ tổng sô" bằng phương pháp Kjeldahl

Theo nguyên tắc Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số
và kết quả nhân với 6.25, như thế nghĩa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong
phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 15 - 17%).

Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ
như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric....Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì vậy
trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác định
nitơ Protein.

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Nitơ protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi protein

1.1.

Định lượng Nitơ tổng sô" theo phương pháp Kjeldãhl

Nguyên tắc:

Quá ttình gồm 2 giai đoạn:

• Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte)

ơ nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H 2S04 thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bị phân
hủy và bị oxi hóa đến C02 và H20 , còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) rồi kết hợp với
H2S04 tạo thành muối amoni sulphate

• Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm)


Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH3 ra khỏi dunh dịch bằng NaOH.

(NH4)2S04 + NaOH Na2S04 + NH3 + H20

Lượng NH3 sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một erlen
có chứa một lượng thừa H2SO4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH3 sẽ tác dụng với
H2SO4 chuyển thành (NH4)2S04.

NH3 +

H2SO4

(NH4)2so4 +

H2SO4

dư Sau đó đi chuẩn độ lượng

H2S04 còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu.

NaOH + H2S04 -ỳ Na2S04 + H20
Cách tiến hành:
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:

❖ Nguyên liệu: các mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô cần
được sấy khô tuyệt đối (105°c, trong 30 phút).

❖ Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K2S04/CuS04 (9:1), H2S04 đặc, H2S04 0,01N, H3P03
2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96°, acid tricloacetic (TCA), thuốc thử
đỏ metyl.

❖ Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger.

(chen hình vào)
Quá trình được thực hiện qua các bước.
❖ Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành ưong tử hotte để ttánh khí độc S02,


co2).
Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn tròn
cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô đạm để
thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2-5 ml,nếu nước quả hộp thì nên
lấy 10 - 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK 2S04/CuS04 (hoặc selen, hay H202 30%,
hay HCL04 70%) và lOml H2S04 đặc.

Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dịch
trỏ nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội.

Chuyển sang bình định mức lOOml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm và định mức
đến vạch định mức.

❖ Bước 2: Cất đạm

Sơ đồ máy cất đạm

Rửa máv: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước vào
ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu c một ít nước cất (khoảng 10
ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen
E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện ở bình A, hơi nước

trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước trong bình B sẽ rút qua G.
khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu c và mở van 2 cho nước chảy vào B, kế đó nước
sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho
nước rút đi. Khóa van 3 và 2 lại.

Cất đam: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dịch H2SO4 0,01N và 3
giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của
ốngsinh hàn D ngập trong dung dịch H2S040,01N của erlen E

Hút lOml dung dịch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu c. đun sôi bình
A, mở van 2 để dung dịch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất vào và
ưáng c, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng giọt cho đến khi
mực nước trong c xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa c một lần nữa với thao
tác tương tự như trên.

Thêm vào phiễu c lOml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy
xuống c từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp tục
cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B.

Tráng phiễu c hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp 2 mà thôi.

Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu mút
của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của ống làm
lạnh D bằng một tia nước của bình xịt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài lần như trên rồi
chuẩn độ lượng H2S04 thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,01N.


❖ Bước 3: chuẩn độ

Lượng H2S04 còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,0IN. quá trình

chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt.

Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H 2S04 0,01N và vài giọt đỏ metyl. Sau
đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình của 3 lần chuẩn độ
Tính kết quả:

Hệ số hiện chỉnh X sẽ được tính theo công thức sau:

X là

tỉ số giữa thể tích H2S04 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ.

Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH.

Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinhl theo công thức:

_ (v0 - Vi **)* 0,0014* 100*

x

100 10*m

Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu

V0: số ml H2S04 đem hấp thụ NH3
Vi: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H2S04 thừam: khối lượng mẫu đem vô
cơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với lml H2SO4 0,1N Nếu là mẫu lỏng:
N/l=14*(v -vt *JC)*10"^

v

Trong đó: vm là thể tích mẫu

m


*Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H2SO4 - H3BO3 Sử dụng hệ
chuẩn H2S04 - H3BO3 để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh được những sai số
về sự thay đổi nồng độ đương lượng của kiềm hoặc không khí.
Cách tiến hành:
-> Nguyên liệu và hóa chất:

H3BO3 2%, thuốc thử Tarshiro, H2S04 0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô cơ
hóa mẫu và cất đạm.

Cho vào bình hứng 2ml H3BO3 2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H3BO3
ngập đầu mút của ống sinh hàn. Trong bình hứng, dd H3BO3 tự phân li:

H3BO3 -ỳ HB02 + H20

Khi cất đạm NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH4)2S04 theo hệ thống sinh hàn vào bình
hứng, phản ứng với HB02 :

NH4OH + HBO2 NH4+ + BO2 + H2O B02' là một bazơ mạnh làm dd
của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng B0 2' được tạo thành
tương đương lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng B0 2' bằng
cách độ ngược với H2SƠ4 0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ
màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ.

BO2

Tính kết quả:

+H+^HBO2


Hàm lượng N%(mg N trong
11y,*o,i4y*ioo
y *m

N(%) =

lOOg mẫu) sẽ được tính theo công thức sau:

m

Trong đó: vt - lượng H2SO4 0,01N để chuẩn độ B02" (ml)

V - số mol dd mẫu pha loãng (lOOml). vm - số ml
dd mẫu cất đạm. m - trọng lượng mẫu đem vô cơ
hóa (mg).

0,14 - số mg N tương đương lml H2S04 0,01N.

1.2.

Định lượng nỉtơ phỉ Protein:

Nguyên tắc:

Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein. Tuy
nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các chất kết tủa
để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút.

Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng, acid, thẩm tích đối
nước ... Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau: TCA 10 - 20%
(acidtricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 - 15%, CuS04 10% trong hổn hộp với NaOH 10% với
tỉ lệ 1:1.

Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch phi Protein. Vô cơ hóa
dung dịch, cất đạm., tương tự định lượng nitơ tổng số.
Cách tiến hành:

Nguyên liệu: các mẫu cần được xác định hàm lượng phi Protein Hóa chất: cồn 70°
và các chất cần cho việc định lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl.


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Cân chính xác 5 - lOg mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ hay thủy
tinh, nghiền lẫn với etanol 70° (tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu tươi và 1:8 nếu
mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 - 80 phút và khuấy liên tục.
Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã vào một becher 250ml còn
phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70° một lần nữa theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước
cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn phản ứng với thuốc thử ninhydrin. Dồn tất
cả các dịch chiết lại và đem kết tủa Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa nitơ Protein,
còn dịch lọc chứa nitơ phi Protein. Đem vô cơ hóa dịch lọc và tiến hành xác định hàm
lượng ni tơ theo phương pháp Kjeldahl.

1.3.

Định lượng Protein trong nguyên liệu:

Có thể tiến hành theo 2 cách sau:

cách 1: xác định trực tiếp

Xác định hàm lượng ni tơ tổng sô" theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết quả
nhân vđi 6,25.

Protein = Nitơ Protein * 6,25

Cách 2: xác định gián tiếp

Nltơ tổng số — Nltơ Protein "t" Nltơ phi Protein

Ta xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau đó tính
nitơ Protein.

Nltơ Protein = Nltơ tổng số ■ Nltơ phi Protein

1


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

■=> Protein = Nitơprotein * 6,25

2. Định lượng Protein bằng phương pháp so màu

2.1.

Định lượng Protein theo phương pháp Biure.

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu 2+ ttong môi trường kiềm tạo phản
ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm

1


NH + NH3

Các phương pháp định lượng protein.
Urea

MH 2
MH
°=<
2

H

0=
<.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

NH?

H?
N

Copper
Coinplex

Biuret

Hình : Phản ứng Biure

Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và sô" lượng liên kết peptid
ứong chuỗi Polypeptid.

Cách tiến hành:

Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1%
Chuẩn bị thuốc thử Biure:

Cân chính xác l,5g CuS04

6g

Tartrat Kilium và Natrium

500ml

nước câ"t

Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và định mức đến lOOOml
Lập đồ thị chuẩn:

Lây 6 ống nghiệm đánh sô" từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:

1


Các phương pháp định lượng protein.

STT
Proteinl%(ml)

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Nồng
độ Protein (mg/ml)
H20(ml)
Thuốc thử Biure (ml)

OD

Bảng 3: lập đồ thị chuẩn nồng độ Proteỉn

Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo độ hấp
thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.

Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu.

Cho vào ống nghiệm lml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc đều và
để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 540nm.
Ghi nhận mật độ quang.
Tính toán:

Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 2->6. Trị số mật độ quang của các ống
nghiệm từ 2->6 bằng mật độ mật độ quang của các ống nghiệm từ 2->6 đã được đo ở trên
trừ cho mật độ quang của ống 1. Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ
quang theo nồng độ Protein chuẩn.

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có ữong ống thí nghiệm là trị số mật độ
quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra
lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.

1


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương pháp
Bradíord vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khôi lượng Protein tương đối lớn
20 - 2,000pg/ml.

2.2.

Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến);

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử dụng
1

NH-CH-C-NH

ị

R

phôi

Ù

hợp

I___P_spi1idfl._

Búiĩds

phản

p

■CH—E —NH —CH —c— NH'
Pritoln R

ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosin, tryptophan, hystidin,
để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào
đường chuẩn Protein để từ đó dinh lượng hàm lượng Protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng
độ Protein.
-

CH'

"t"

iMữ+5/W+5
Polịn

Tetrad&nta
te
ẼU+

1

►Reagervt

1


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

[phũẼphamolyticlic/phũsphotLrgẼiic acid]

Hình : Phản ứng Lowry
Tiến hành
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

• Dung dịch Protein chuẩn có 10 - 100 ịig Protein/lml
Dung dịch nghiên cứu có 50 - 300 ịig Protein/lmlDung dịch chuẩn: Albumin 0,1%, thường
là huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin).
Hóa chất: pha

•

Dung dịch A : Na2C03 2% hòa trong NaOH 0,1N

•

Dung dịch B : CuS04.5H20 0 ,5% pha trong dung dịch natri citrat 1%

•

Dung dịch c : hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B với tỉ lệ 49:1

•

Dung dịch Folin

Cách pha dung dịch Folin: Pha trong bình cầu có v= 21

Cân lOOg natri tungstat (natri wonframat (Na2W04.2H20) và 25g natri molypdate
( Na2Mo04.2H20). Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto phosphoric 85%
( H3P04) .Khuấy cho tan và thêm vào đó lOOml HC1 đậm đặc và tinh khiết rồi tiếp tục

khuấy. Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu trong lOh. Sau khi đun hồi lưu
thêm vào đó 150g lithium sulfat ( Li 2S04.H20) tinh khiết. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn
rồi cho vào đó 5 - 10 ml nước Brom khuấy đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút để đuổi lượng
Brom thừa. Dung dịch phải có màu vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với
Brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dung dịch ở nhiệt độ thường. Để vào bình định mức 11
và định mức đến vạch. Có thể lọc nếu dung dịch không trong. Đựng trong chai thủy tinh
nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2-3 tháng, dung dịch chuyển sang màu xanh
thì thêm vài giọt Brom và đun sôi 15 phút dung dịch lại có màu vàng trở lại. Trước khi
dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng độ 0,5N.
1


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Thiết bị: máy so màu quang điện.
Tiến hành:

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu:

1


Cho vào ống nghiệm lml dung dịch mẫu ,thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch c, lắc đều, để yên trong
10 phút ồ nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên trong 30
- 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từmàu vàng sang màu xanh. Sau đó đem đo độ
hấp thu ở bước sóng 750nm và ghi nhận mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu

Thực hiện tương tự với 1 ống đối chứng bằng cách thay lml dung dịch mẫu bằng

lml nước cất.
Lập đồ thị chuẩn
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
ơng số
Nước Nồng
cất (ml)
độ Protein (mg/ml) Thuốc thử Folin (ml)
Protein 0,1% (ml)
c (ml)

OD

Bảng 1: lập đồ thị nồng độ Protein

Trinh tự và thao tác tương tự như phần dung dịch thí nghiệm. Sau đó đem đo độ
hấp thu của các ống ở bước sóng 750nm. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn.
Tính toán:

Từ bảng trên khi lập đố thị thì ta lấy trị số mật độ quang các ống từ 2 - 6 trừ đi
mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dịch Protein chuẩn, từ
đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn.
Với trục hoành là nồng độ Protein và hục tung là mật độ quang.


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độ quang
của ống thí nghiệm trừ ống đôi chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra

lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
18Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu
chứa vài chục |ig Protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 - 2,000mg Protein. Tuy
nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các Protein không chứa acid amin
vòng thơm như gelatin, đốì với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo kết tủa ảnh hưởng
đến kết quả.

2.3.

Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie
Brilliant Blue G - 250);

Nguyên tắc:

Dựa phản ứng màu của Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G 250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi trường axit
Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương tác với cả nhóm kỵ
nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein làm dung dịch có màu
xanh.
Cường độ
màu tỉ lệ
với

nồng

độ Protein
trong dung
Arrax =
59& m

ProteioOye
Complex

2


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

dịch. Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu.

2


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Tiến hành:

Hóa chất: Chuẩn bị dung dịch mẫu Protein cần xác định.

Dung dịch Albumin chuẩn lmg/ml
Cách pha dung dịch Albumin:

Cân chính xác lOmg Albumin pha trong lml nước cất lắc đều cho tan hết và giữ ở
20°c. Khi dùng pha loãng 100 lần để được dung dịch Albumin 0,lmg/ml.

Pha thuốc thử Bradíord:

Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue và 4,7g Ethanol 99° và 8,5g Acid
Phosphoric 85%, định mức tới lOOml bằng nước cất. Đựng trong chai có nút đậy kín.

Thiết bị: máy đo màu quang điện.
Tiến hành:
Lập đồ thị chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
ơng số
Dung dịch Albumin o.lmg/mlNước
(ml) cất (ml)Nồng độ Albumin Thuốc
(pg) thử Bradíord (ml)

2


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Bảng 2; lập đồ thị chuẩn dung dịch Albumỉn Lắc điều và để yên một
lúc sau đó đem đo độ hấp thu của các ống ở bước sóng 595nm. Từ đó xây dựng đồ thị
chuẩn.
Chuẩn bị ống thí nghiệm:

Ống thí nghiệm: 0,1 ml dd Protein + 5ml dd Bradíord
Ống đôi chứng: 0,lml nước cất + 5ml dd Bradíord (Có
thể thay nước cất bằng NaCl 0,15M)

Đem đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ quang
phải nằm trong khoảng của đường chuẩn).
Tính toán.

Từ bảng trên thì ống 1 là ống đối chứng ,vì vậy khi lập đố thị thì ta lấy trị số mật
độ quang các ống từ 2 - 6 trừ đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự
của dung dịch Protein chuẩn,từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang
theo nồng độ Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ
quang.

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độ
quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy
ra lượng Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Độ nhạy và khả năng ứng dụng
Phương pháp này dùng cho Protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng.
Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn
nhiều vì nó cho phép xác định tới vài pg protein/ml. đồng thời làm giảm ảnh hưởng của
muối, đệm, các chất khử...Tuy nhiên phương pháp này không dùng với những chất có
chứa suríactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng. Những chất có tính kiềm mạnh
làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên
chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ quang.Định lượng Protein bằng phương pháp

dùng Bỉcỉnchonỉnic Acỉd (BCA):
3.1.

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo
màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 562nm.
2

Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

STEP1.

P r ol e i n + C u ? t ° H ~ - C u ^

STEP2.

Ữ u i + * 2BC A

Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA)

Đầu tiên Protein sẽ khử Cu 2+ thành Cu+ và tạo thành phức có màu xanh trong môi
trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu + được tạo ra ở trên cho màu đỏ
tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm.

3.2.

Cách tiến hành:

Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử Biure
thành thuốc thử BCA.

3.3.

Tính kết quả:

Cách tính kết quả cũng tương tự phương pháp Biure.

3.4.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện Protein tương đối lớn 20 2,000pg. Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu

2


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ trong phân tử có các
aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng
đến kết quả.

4. Định lượng Proteỉn bằng phương pháp quang phổ
4.1.

Nguyên tắc:

Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm của Protein. Các Protein hấp
thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acidamin Tryptophan, Tyrosin và một
phần là Phenylalanin. Sự hấp thu ở bước sóng 280nm của chúng cũng thay đổi tùy loại
Protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi Protein cho phép tính nồng độ của Protein tinh
sạch (hệ số tắc là độ hấp thụ của dd Protein 1% với đường truyền sóng qua lcm).

Bảng 3: Hệ sô" tắt của các loại Protein liên quan với hệ miễn dịch ở bước sóng 280nm

IgM

11,8

Chuỗi p 13,9

Lactin Lens Calinaris

12.5

2